本发明专利属于生物医药领域，具体涉及一种动物血活性复合肽的制备方法及其应用。
背景技术：
生物活性肽是由氨基酸以不同组成的排列方式构成的，从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称。这些肽类可通过磷酸化、糖基化活酰基化被激活而发挥生理作用。肽是构成人体所有细胞的基本材料，在身体内，各种活性肽都是在各自腺体细胞内生成并分泌，其量很少，但肽涉及到人体激素、神经、生殖及细胞的更新、代谢、生长和修复的各个领域。肽是生命的基础，生命之所以存在就是因为它们的体内可以产生肽。缺少肽细胞就会衰老、失去活性、甚至死亡，可以说没有肽就没有生命。
科学家已经证实：所有疾病的发生、发展、治疗、康复都与肽有关。生物活性肽能够激活免疫系统，增强抵抗各种疾病的能力，活性肽能使人体心、肝、肺、肾等重要器官的组织细胞得到修复和再生，使逐渐退化的生理功能恢复到健康状态；活性肽具有激素和调节激素的作用，对生物体内的酶具有调节和抑制功能，能促进生长发育；活性肽能增加血管壁的弹性，具有抗血栓，抗高血压，降胆固醇，抑制细菌、病毒，抗癌作用；活性肽具有抗氧化和清除自由基作用，可改善元素吸收和矿物质运输，能增加皮肤的弹性，恢复皮肤的白皙、细腻和光泽；活性肽对深度睡眠有促进作用，对慢性疲劳综合征有很好的效果；同时活性肽还具有促进伤口愈合的能力。
动物血中含有大量的活性肽，它们随人体血液循环系统运遍全身，为人体250多种不同细胞提供细胞营养剂，同时广泛参与和调节了人体细胞的增殖、生长、代谢、衰老、死亡等生命活动。临床上小牛血清去蛋白注射液已被应用多年，其主要功效成分就是血清肽，它被广泛应用于治疗各类烧烫伤、褥疮、糖尿病足等疾病，这不仅验证了血清活性肽的重要功效作用，同时也进一步开创不同动物血清肽互用的先例，为血清活性临床应用的安全性奠定了坚实的基础。
目前人们已经能够利用体外酶解的手段，从动物血、植物和微生物中分离出多种多样的生物活性肽。国内外已经有大量的动物血（鹿、骆驼、牛、羊血）多肽粉上市，以原料形式被广泛应用食品或保健品领域，用于提高机体免疫力、抗疲劳、抗衰等能力，但当前动物血清多肽的传统提取工艺多以血清蛋白为原料，经蛋白加热熟化、粉碎、蛋白酶切、超滤浓缩、喷雾干燥等工艺制备而成，这不仅让血清中本来含有的活性肽活性丧失，大大降低了血清活性肽的生理活性，同时血清各种多肽和蛋白酶切肽经高温熟化和喷雾干燥处理后也丧失了肽的生理活性。
技术实现要素：
本发明的目的正是针对上述存在问题，并在现有技术的基础上，提出的一种动物血活性复合肽的制备方法，可以在有效保护动物血清蛋白和多肽活性的前提下，将利用膜分离技术和生物定向酶切技术相结合，发明一种可以制备高活性动物血活性肽的工艺方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
（1）采集经检疫合格的健康动物血，管式离心机分离，收集血浆备用，血球可以用于制备动物蛋白饲料或提取的SOD，或直接购买检疫合格的新鲜动物血浆；
（2）将血浆经2~3个串联的0.22微米孔径的管式滤器过滤除菌；
（3）将过滤除菌后血浆经截流分子量为5000Da的超滤设备超滤，分别收集透过液和截流液备用；
（4）将步骤（3）中的透过液经截流分子量为100-200Da的反渗透膜超滤浓缩至透过液原体积的1/8-1/10，分别收集截流液和透过液，截流液即为动物血活性多肽A（血浆超滤肽）（多肽含量≥8mg/ml，多肽含量可用《中国药典》中紫外吸收系数法进行检测），透过液可作为生产用水（如作为设备清洗用水）循环利用；
（5）将步骤（3）中的截流液放入反应釜中，加入复合蛋白酶，各蛋白酶加入量为200-600U/mL（以截留液体积计）），即在pＨ7.0－8.5、温度35-50℃条件下保温4小时以上，得到动物血蛋白酶解液；
（6）将步骤（5）中的酶解液，经截流分子量3000Da的超滤设备超滤，分别收集截流液和透过液，其中截流液可以加入下批料液步骤（5）中继续酶解，循环利用；
（7）将步骤（6）中的透过液经截流分子量100-200Da的反渗透膜超滤浓缩至透过液原体积的1/3-1/5，分别收集截流和透过液，截流液即为动物血多肽B（血浆蛋白酶切肽）(≥20mg/ml)，透过液可作为生产用水（如作为设备清洗用水）循环利用；
（8）将同批次步骤（4）中的动物血多肽A和步骤（7）中的动物血多肽混合，即为动物血活性复合肽。
步骤（5）中所述复合蛋白酶可为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的任意两种或两种以上。
本发明所涉提取工艺也可用于以动物其他组织（如脾脏、胰脏、胎盘等）为材料进行活性多肽的提取流程。
所述动物血是指猪血、鹿血、羊血、牛血、骆驼血等哺乳动物的血液。
通过本发明制备的动物血活性复合肽可应用于医疗、美容、保健等多个方面。在医药方面可以用于组织的再生修复、美容方面可用于过敏肤质的修复，保健上可以提高机体免疫力。
与现有技术相比，本发明的创新点主要在于：
1.本发明工艺充分利用膜分离提取技术和生物定向酶切技术，剔除了传统动物血多肽提取工艺中的化学或高温变性和喷雾干燥等步骤，整个工艺流程建立在保障血浆蛋白和多肽的生物活性的基础上，提取出了真正意义上的高活性动物血活性肽，为动物血活性肽在机体内冲分发挥作用奠定了生物学基础。
2.本发明所涉的活性复合肽提取工艺，采用分级提取的方式，在同一工艺流程中不仅率先用5000Da超滤膜提出了血浆中本身就含有的活性肽A，而且以经超滤浓缩后的血浆为原料直接酶切、超滤、浓缩提取出了血浆蛋白肽（纤维蛋白原肽、白蛋白肽、球蛋白肽）等活性肽B，两者复合后形成的活性多肽复合物，不仅活性肽种类更加丰富全面，而且两类活性多肽混合后可以相辅相成，起到生物协同作用，较传统工艺提取的相对单一的动物血多肽在医疗、美容、保健等领域能发挥更强的功效。
3.本发明复合肽活性肽A（血浆超滤肽）和活性肽B（血浆蛋白酶切肽）的提取过程的中分别采用了截流分子量5000Da和截流分子量3000Da的超滤膜，这一关键截流分子量的选择和设定，很好的实现了复合活性肽中细菌、病毒和细菌内毒素的截流，为动物血活性肽的生物安全性提供了工艺保障。
4.本发明活性肽A和活性肽B的提取过程中采用了截流分子量为100-200Da的反渗透膜进行浓缩，不仅提高了动物血活性肽的有效浓度，而且降低了活性肽的含水量，为活性肽冻干粉制剂的生产提供了便利。
5.本发明动物血活性肽制备过程中上批次的“废液”，可以成为下批次的原料进行循环使用，实现了闭环式的生态提取操作，全过程不产生任何废液、废渣，不仅实现了动物血的高附加值利用，而且做到了真正意义上的绿色环保。
6.本发明中采用截流分子量3000Da的超滤膜对酶解液进行超滤，提取出3000Da分子量以下的活性肽B，整个酶解过程不需要通过高温灭酶或化学试剂进行终止酶解反应，这样不仅节省了试剂的用量，而且让提取过程更加环保。
7.本发明生产过程采用现代生物集成化技术，机器化程度高，操作方便，成本低，便于规模化生产，具有巨大的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面实施例只为进一步说明本发明，不以任何形式限制本发明。
实施例1
（1）采集经检疫合格的健康鹿血，管式离心机分离，收集血浆备用，血球可以用于制备动物蛋白饲料或提取的SOD；
（2）将血浆经3个串联的0.22微米孔径的管式滤器过滤除菌；
（3）将过滤除菌后血浆经截流分子量为5000Da的超滤设备超滤，分别收集透过液和截流液备用；
（4）将步骤（3）中的透过液经截流分子量为200Da的反渗透膜超滤浓缩至步骤3透过液原体积1/8，分别收集截流液和透过液，截流液即为鹿血活性多肽A（多肽含量≥8mg/ml），透过液可作为设备清洗用水循环利用；
（5）将步骤（3）中的截流液放入反应釜中，加入复合蛋白酶（胰蛋白酶600U/mL、木瓜蛋白酶200U/mL（以截留液体积计）），即在pＨ8.5、温度40℃条件下保温6小时，得到鹿血蛋白酶解液；
（6）将步骤（5）中的酶解液，经截流分子量3000Da的超滤设备超滤，分别收集截流液和透过液，其中截流液可以加入下批料液步骤（5）中继续酶解，循环利用；
（7）将步骤（6）中的透过液经截流分子量200Da的反渗透膜超滤浓缩至步骤（6）中透过液原体积的1/3，分别收集截流和透过液，截流液即为鹿血多肽B(≥20mg/ml)，透过液可作为设备清洗用水循环利用；
（8）将同批次步骤（4）中的鹿血多肽A和步骤（7）中的鹿血多肽B混合，即为鹿血活性复合肽。
实施例2
（1）购买检疫合格的新鲜猪血浆加入抗凝剂备用；
（2）将血浆经2个串联的0.22微米孔径的管式滤器过滤除菌；
（3）将过滤除菌后血浆经截流分子量为5000Da的超滤设备超滤，分别收集透过液和截流液备用；
（4）将步骤（3）中的透过液经截流分子量为100Da的反渗透膜超滤浓缩至原体积的1/10，分别收集截流液和透过液，截流液即为猪血活性多肽A（多肽含量≥10mg/ml），透过液可作为设备清洗用水循环利用；
（5）将步骤（3）中的截流液放入反应釜中，加入复合蛋白酶（胰蛋白酶300U/mL、中性蛋白酶500U/mL、碱性蛋白酶200U/mL（以截留液体积计）），即在pＨ7.5、温度45℃条件下保温4小时，得到猪血蛋白酶解液
（6）将步骤（5）中的酶解液，经截流分子量3000Da的超滤设备超滤，分别收集截流液和透过液，其中截流液可以加入下批料液步骤（5）中继续酶解，循环利用；
（7）将步骤（6）中的透过液经截流分子量100Da的反渗透膜超滤浓缩至原体积的1/5，分别收集截流和透过液，截流液即为猪血多肽B(≥33mg/ml)，透过液可作为设备清洗用水循环利用；
（8）将同批次步骤4中的猪血多肽A和步骤（7）中的猪血多肽B混合，即为猪血活性复合肽。