一种用于制备笼养鸡发酵床垫料的微生物菌剂及其制备方法与流程

本发明公开了一种用于制备笼养鸡发酵床垫料的微生物菌剂及其制备方法，属于微生物工程技术领域。

背景技术：

目前，规模鸡场采用笼养的饲养模式，笼养方式在提高鸡场的生产水平、劳动效率的同时，也存在着鸡粪集中排放，鸡场自身环境恶化等问题，粪便污染已成为制约笼养鸡养殖的重要因素。笼养鸡的粪尿处理技术大多采用堆肥发酵、沼气发酵、好氧发酵烘干技术等方式进行处理，堆肥发酵处理粪便占用土地，对环境的空气污染较大，沼气发酵具有季节局限性，好氧发酵烘干技术成本较高，在实际利用中均有一定的局限性。

发酵床养殖技术是一种新型生态养殖模式，其关键是在畜禽圈舍地面铺设发酵垫料，实现畜禽粪尿的原位降解，极大的改善了养殖环境，是一项环保农业技术。微生物发酵床模式实现养殖、粪便原位腐熟发酵的阶段同步化，是快速生产有机肥的重要途径。腐殖质是有机肥料的重要成分，腐殖酸肥添加可显著提高土壤肥力，促进植物生长。目前发酵床主要应用于生猪的养殖，用于家禽养殖的研究较少，而关于笼养鸡的发酵床研究还鲜有报道。

传统养鸡垫料较薄，一般在10cm左右，鸡粪在垫料中的变化以腐败过程为主，不具有发酵功能，对鸡粪分解作用不大，垫料主要起吸附鸡粪水分和臭气的作用，不明显产热，垫料比较湿，垫料和鸡舍中臭气严重。笼养鸡的发酵床垫料厚度不同于传统的平养垫料模式，垫料的厚度和配比显著影响发酵垫料的孔隙度和持水性。垫料发酵分解粪尿的过程是微生物作用的结果，发酵菌种活力的高低决定了粪便分解和腐殖质产生的效率，是微生物发酵床技术的核心环节。选用定殖能力强、降解率高且功能具有互补作用的菌株组成的复合微生物菌剂，是发酵床原位降解粪便形成腐殖质有机肥的有利保证。

技术实现要素：

本发明的目的旨在提供一种有效促进鸡粪原位降解，显著降低垫料氨态氮和含水量，提高垫料腐殖率的笼养鸡发酵床的微生物菌剂及其制备方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现:

一种用于制备笼养鸡发酵床垫料的微生物组合物，由以下体积配比的微生物发酵液组成：解淀粉芽孢杆菌发酵液20-30％、巨大芽孢杆菌发酵液25-35％、长枝木霉发酵液20-30％、植物乳杆菌发酵液15-25％，菌剂所含的总活菌数在4×109-8×109cfu/g之间。

所述的微生物组合物，优选由以下体积配比的微生物发酵液组成：解淀粉芽孢杆菌25％、巨大芽孢杆菌30％、长枝木霉25％、植物乳杆菌20％，菌剂所含的总活菌数在4×10⁹-8×10⁹cfu/g之间。

1、优良菌种的选择

新鲜鸡粪中含水分50％，有机质25.5％，氮1.63％，磷1.54％，钾0.85％，碳水化合物11％，纤维7％，而猪粪中含水分60-65％，有机质15％，氮0.5％，磷0.5～0.6％，钾0.35～0.45％。鸡粪的有机质和含氮量都相对较高，因此应选择能产蛋白酶、淀粉酶，转化氨态氮的菌种搭配产纤维素酶菌株、产酸抑菌的菌株，降低粪便转化中的氨态氮，转化粪便有机质，提高垫料腐殖质。

解淀粉芽孢杆菌(cicc20164)，产蛋白酶、淀粉酶，可迅速利用蛋白、脂肪、糖类、淀粉等有机碳，在短时间内促进基质中易降解物的转化，加快基质垫料的升温。

长枝木霉(cicc41185)，它繁殖迅速，在短时间内快速生长、代谢，具有较强分解纤维素的能力，能以蔗渣、秸秆、菌糠为底物生产纤维素霉曲。

巨大芽胞杆菌，从鸡粪中筛选的具有硝化作用的固氮芽孢杆菌，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，分类命名：巨大芽孢杆菌bacillusmegaterium，保藏号：cctccno:m2019050，保藏日期为：2019年1月30日。菌落表面光滑不透明，呈污白色，细胞为长杆状，革兰氏阳性菌，在37℃培养2～3天形成芽孢，芽孢大小0.6～1.5μm，芽孢呈椭圆形。

植物乳杆菌，是从秸秆上筛选出来的具有产酸速度快、生长能力强、抑制病原菌的乳酸菌；该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，分类命名：植物乳杆菌lactobacillusplantarum，保藏号：cctccno:m2016281，保藏日期为：2016年5月25日。植物乳杆菌的菌落呈乳白色，边缘整齐；细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；接触酶阴性，氧化酶阴性；具有较强的生长及产酸性能，在起始ph值为3.0-8.0的培养基上能生长，在10℃条件下呈现微弱生长，在15℃-45℃条件下生长状况良好，在不大于6.5％nacl的条件下生长状况良好。

本发明所述的微生物组合物的制备：

1、一级扩培：各个经纯化培养的菌种(解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、长枝木霉、植物乳杆菌)从保藏的斜面上取出后，分别接种到制备好的五个种子培养基中分别培养，每个1l的瓶中装培养基200ml，植物乳杆菌在37℃的恒温培养箱中培养48h，解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌在摇床上35℃150r/min振荡培养48h，长枝木霉在摇床上30℃120r/min振荡培养96h。

2、二级扩培：期间分别检测各菌培养液活菌数，待各菌活菌数≥2×10⁸/ml后，取出种子液，将四种菌按菌种配比制成所述的微生物组合物。

一种用于制备笼养鸡发酵床垫料的复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂是将本发明所述的微生物组合物接种于固体培养基中，混匀共同置于30-35℃培养条件下培养72-96h，烘干制得。

所述的复合微生物菌剂，优选将本发明所述的微生物组合物与固体培养基按照重量比为1:9的比例将微生物组合物接种于固体培养基中，混匀共同置于30-35℃培养条件下培养72-96h；然后在50℃条件下烘干即可制成复合微生物菌剂；所述的固体培养基配方为：豆腐渣64％，麸皮22％、玉米粉10％、葡萄糖3.5％，nacl0.4％、kh2po40.1％、ph6.4-7.2。

本发明所述的复合微生物菌剂的制备方法，包括将所述的微生物组合物接种于固体培养基中，混匀共同置于30-35℃培养条件下培养72-96h，烘干制得所述的复合微生物菌剂；优选包括将本发明所述的微生物组合物接种于固体培养基中，混匀共同置于30-35℃培养条件下培养72-96h；然后在50℃条件下烘干即可制成复合微生物菌剂。

所述的固体培养基配方优选为：豆腐渣64％，麸皮22％、玉米粉10％、葡萄糖3.5％，nacl0.4％、kh2po40.1％、ph6.4-7.2；本发明所述的微生物组合物与固体培养基的重量比优选为1:9。

本发明所述的复合微生物菌剂在制备笼养鸡发酵床垫料中的应用。

一种笼养鸡发酵床垫料，包含本发明所述的复合微生物菌剂。

所述的笼养鸡发酵床垫料优选还包括菌糠、木屑、稻壳和麸皮。

所述的笼养鸡发酵床垫料，进一步优选通过如下方法制备：笼养鸡发酵床铺35～40cm菌糠，表面铺木屑和稻壳等重量比混合物8～15cm，用翻耙机运行搅拌，将菌糠与木屑和稻壳的混合物混合；将权利要求3或4所述的复合微生物菌剂、麸皮混合均匀后，撒于发酵床表面,再用翻耙机运行搅拌，其中；本发明所述的复合微生物菌剂、麸皮的重量比为：1:15～22；每平方垫料撒本发明所述的复合微生物菌剂50g。

本发明的有益效果是：

(1)本发明产品用四种优良菌种选择最佳比例组成复合微生物菌剂，功能菌株在笼养鸡发酵床面的饲养管理过程中能协同作用，有机质转化菌(解淀粉芽孢杆菌、长枝木霉)、固氨除臭菌(巨大芽孢杆菌)和病菌抑制菌(植物乳杆菌)功能互补，快速启动发酵床的升温发酵，实现粪便中水分的快速脱除，提高发酵床微生物多样性，抑制金黄色葡萄球菌、流行杆菌属等病原腐败菌的生长，有效促进鸡粪原位降解。

(2)从鸡粪中分离的巨大芽孢杆菌，在笼养鸡发酵床中能定植，快速生长，显著降低垫料氨态氮，减少氨气，同时在升温的过程中减少氮素损失。

(3)菌糠、稻壳、木屑的垫料组合，配合复合微生物菌剂，能显著提高胡敏酸等腐殖质的含量，提高垫料腐殖率，形成优质有机肥。

附图说明

图1不同垫料的菌群丰度差异分析

生物材料保藏信息

巨大芽胞杆菌bm18，分类命名为bacillusmegateriumbm18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctccno:m2019050，保藏地址中国武汉武汉大学，保藏日期为2019年1月15日。植物乳杆菌zrr，分类命名为lactobacillusplantarumzrr，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctccno:m2016281，保藏地址中国武汉武汉大学，保藏日期为2016年5月25日。

具体实施方式

以下实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

本发明采用的4株菌株名称及菌种来源如下：

解淀粉芽孢杆菌(cicc20164)、长枝木霉(cicc41185)均购于中国工业微生物菌种保藏中心。巨大芽胞杆菌，从鸡粪中筛选的具有硝化作用的固氮芽孢杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctccno:m2019050。植物乳杆菌，是从秸秆上筛选出来的具有产酸速度快、生长能力强、抑制病原菌的乳酸菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctccno:m2016281。

实施例1：巨大芽孢杆菌和植物乳杆菌的分离

巨大芽孢杆菌的分离：取10g腐熟鸡粪接入装有200ml富集培养基(硫酸铵2g、琥珀酸钠2.17g、磷酸二氢钾0.25g，硫酸镁0.125g、nac10.125g、水1000ml)中，每隔3d，以3％的接种量转接到新的富集培养基中，连续富集培养30d，稀释涂布至硫酸铵平板上，挑选长势快的大菌落，重复分离纯化两次。将获得的菌株接种于富集培养基中振荡培养，同时用格利斯试剂、二苯胺试剂跟踪检测亚硝酸盐、硝酸盐的产生情况初筛得到菌株28株，再将菌株复接到鸡粪浸出液中(鸡粪浸出液的制备：鸡粪与自来水按l：1比例混合，在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，静止过夜，过滤，再次12l℃灭菌20min)。采用氯化钾浸提－靛酚蓝比色法测定接种前后氨态氮的含量，得到降解能力强的菌株6株，其中一株菌在48小时氨氮降解率最高，达到69.7％。该菌株菌落较大，边缘不整齐；菌体呈杆状，有芽孢，革兰氏染色阳性；淀粉水解试验、明胶水解、氧化酶试验、接触酶试验、甲基红试验、柠檬酸盐试验阳性，经16rrna基因序列鉴定为巨大芽孢杆菌,将保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctccno:m2019050。

植物乳杆菌的分离：称取10g秸秆样品加入灭菌的90ml蒸馏水中，梯度稀释后涂布在mrs固体培养基上，培养48h，根据形态和颜色，挑取mrs上生长菌落，通过产酸、耐酸、温度试验等试验筛选了产酸耐酸抗逆性强、抑制病原菌的1株乳酸菌，24小时产乳酸量1.51mg/l，对大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为21.4mm、20.8mm。菌落呈乳白色，边缘整齐；细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；接触酶阴性，氧化酶阴性；具有较强的生长及产酸性能在起始ph值为3.0-8.0的培养基上能生长，在10℃条件下呈现微弱生长，在15℃—45℃条件下生长状况良好，经16rrna基因序列鉴定为植物乳杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctccno:m2016281。

实施例2复合微生物菌剂的制备

该复合菌剂的配置从斜面菌种到成品的扩增要经过以下三个步骤

1、一级扩培：各个经纯化培养的菌种(解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、长枝木霉、植物乳杆菌)从保藏的斜面上取出后，分别接种到制备好的四个种子培养基中分别培养，每个1l的瓶中装培养基200ml，植物乳杆菌在37℃的恒温培养箱中培养48h，解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌在摇床上35℃150r/min振荡培养48h、长枝木霉在摇床上30℃120r/min振荡培养96h。

在一级扩培中，各种菌的斜面培养基和种子培养基均为公知的基础培养基。其中解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的种子培养基——营养肉汤培养基(培养细菌)，长枝木霉——pda培养基(培养霉菌)，植物乳杆菌——mrs培养基(培养乳酸菌)。

2、二级扩培：期间分别检测各菌培养液活菌数，待各菌活菌数≥2×10⁹/ml后，取出种子液，将四种菌按体积百分比解淀粉芽孢杆菌25％、巨大芽孢杆菌30％、长枝木霉25％、植物乳杆菌20％制成复合菌液，然后按照重量比为复合菌液10％和固体培养基90％的比例将复合菌液接种于固体培养基中，混匀共同置于35℃培养条件下培养72h。

二级扩培中的固体培养基配方(重量百分比)：豆腐渣(含水80％)64％，麸皮22％、玉米粉10％、葡萄糖3.5％，nacl0.4％、kh2po40.1％、ph6.4-7.2。

3)固料干燥：在50℃条件下烘干即可制成复合微生物菌剂。菌剂含菌量在4×10⁹-8×10⁹cfu/g之间

实施例3：采用本发明的复合微生物发酵剂在笼养鸡发酵床的床体效果试验

2017年10月-2017年12月在某鸡场进行了本发明产品在床面基质上的应用实验。笼养鸡发酵床铺40cm左右菌糠，表面铺木屑/稻壳10cm左右，木屑与稻壳重量比为1:1，用翻耙机运行搅拌，将垫料混合，垫料厚度为50cm。试验组每平方米发酵床用发酵床菌剂50克，其撒入方法是先将发酵床菌剂、麸皮混合均匀后，撒于发酵床表面，用翻耙机运行搅拌；发酵床菌剂、麸皮的重量比为：发酵床菌剂50g，麸皮1kg。对照组每平方米只撒1kg麸皮。

分别在15d、30d、45d、60d取发酵床垫料，监测垫料的微生物和养分含量。总细菌用营养琼脂(na)培养基37℃恒温培养24h；芽孢杆菌的稀释液在80℃水浴10min后用营养琼脂(na)培养基37℃恒温培养24h；真菌用马铃薯葡萄糖琼脂培养基28℃培养5d；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌分别用甘露醇氯化钠琼脂(msa)、伊红美兰琼脂培养基(emb)37℃恒温培养48h。硝化细菌用斯蒂芬森培养液mpn法，反硝化细菌采用柠檬酸钠硝酸钾培养基mpn法。氨态氮采用氯化钾浸提－靛酚蓝比色法测定。有机质采用重铬酸钾氧化法测定。垫料腐殖质及其组分采用焦磷酸钠-氢氧化钠溶液提取法，重铬酸钾法测定。结果如表1、表2、表3所示。由表1、2可知，添加本发明的微生物菌剂显著提高芽孢杆菌分布数量，显著降低金黄色葡萄球菌分布数量，显著提高了氮代谢微生物中的硝化细菌(p＜0.05)，减少了氮素损失。由表3可知，添加本发明的微生物菌剂能显著降低垫料的含水量和氨态氮含量，从而显著改善禽舍环境，在垫料肥料化方面，添加菌剂显著提高胡敏酸和总腐殖质的含量，提高垫料腐殖率，形成优质有机肥。

表1笼养鸡发酵床的垫料微生物(logcfu/g)

表2笼养鸡发酵床垫料的氮代谢微生物(logcfu/g)

表3笼养鸡发酵床垫料的养分含量

为进一步研究笼养鸡发酵床的微生物区系，采用分子微生物学方法系统研究笼养鸡垫料的微生物组成，提取60d垫料样品的微生物dna，进行了16srdnav3区的扩增，采用hiseq平台测序分析。结果如表4和图1所示。香农多样性指数、辛普森指数指数是反映微生物多样性的重要指标。香农多样性指数越高，辛普森指数指数越低，表明微生物的多样性越高。由表4可知，添加发酵床菌剂显著提高了鸡垫料微生物的多样性，显著促进了微生物对鸡粪尿的原位降解。对不同组的垫料微生物dna进行lefse分析，寻找两个组优势菌群的丰度变化。结果如图1所示，添加鸡发酵床菌剂显著提高了垫料中芽孢杆菌属(bacillus)、海洋杆菌属(oceanobacillus)的菌群丰度，显著降低了流行杆菌属(vulgatibacter)的菌群丰度。芽孢杆菌属、海洋杆菌属是参与粪便转化的重要菌群。试验结果表明，添加发酵床菌剂，菌剂中的芽孢杆菌能在鸡粪垫料中快速生长，形成优势菌群，促进鸡粪尿的原位降解。

表4不同垫料样品的微生物多样性分析