一株高温秸秆降解细菌B-8及其菌剂与应用的制作方法

本发明属于农业资源环境领域，具体属于固体废弃物资源化利用领域，涉及一株高温秸秆降解细菌b-8及其菌剂，该细菌b-8及其菌剂用于降解废弃作物秸秆生产有机肥料，实现农业废弃物资源化。

背景技术：

我国是农业大国，每年产生大量的农业废弃物废弃物，如小麦、水稻、玉米等农作物秸秆。一方面，这些秸秆含有大量植物生长所必需的营养元素，但其主要以纤维素的方式存在，由于分子量较大而不能被植物直接利用。另一方面，近几十年，化肥的施用严重破坏了土壤环境健康，降低了土壤中有益微生物的多样性。如何将农业废弃物有效利用，同时在产量不降低的前提下降低化肥施用量已是当下的难题之一。利用纤维素降解菌处理废弃秸秆，具有环保、节能、高效等特点，且符合可持续发展的要求。因此，从环境中筛选一些纤维素降解菌、将这些资源合理利用起来，将是我国可持续发展战略中的一个重要部分。

堆肥化过程是在微生物的作用下，将原料中较难分解的大分子物质分解为可被微生物利用的碳源。因此，加速堆肥过程中纤维素的分解是提升堆肥效率、缩短堆肥周期和提高腐殖化的关键问题之一。研究表明，堆肥高温阶段(一般>55℃)是木质素、纤维素和半纤维素等分子破坏、断裂和分解、病原菌灭活的重要阶段之一。因此，接种高温纤维素分解菌，可以有效缩短堆肥时间，提升效率。目前报道的高温纤维素分解菌主要集中在55℃～65℃之间，而70℃以上鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高温秸秆降解细菌b-8，其能在高温条件下高效分解农业废弃秸秆，使得农田中的废弃秸秆资源化，确保可持续农业的顺利发展。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一株高温秸秆降解细菌b-8，分类命名为土芽孢杆菌(geobacillussp.)，于2019年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmccno.17301。

细菌b-8的生物学特性为：在65～75℃下，na培养基上培养，初期菌落呈白色，最终菌落主体呈淡黄色，质地柔软，表面光滑，边缘呈白色。

细菌b-8能在cmc-刚果红培养基上生长并产生透明的水解圈。cmc-刚果红培养基配方为：羧甲基纤维素钠(cmc-na)2.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g，刚果红0.2g，琼脂20g，去离子水1000ml，ph自然，121℃高压灭菌20min。

本发明的另一个目的提供所述的高温秸秆降解细菌b-8在降解农作物秸秆方面的应用。

本发明的另一个目的是提供一种含有所述的高温秸秆降解细菌b-8的菌剂。

本发明所述的菌剂的制备方法，包括：将菌株b-8接种到nb培养基中，在温度65～75℃、转速170～200r/m下培养至对数期；再将上述培养至对数期的细菌b-8按接种量1％接种于水稻秸秆液体培养基中，在温度65～75℃、转速170～200r/m条件下培养7d，离心过滤除去菌体和杂质，即得菌剂。

nb(nutrientbroth)培养基：牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，蛋白胨10.0g，去离子水1000ml，ph7.3±0.1，121℃灭菌15min。

所述的水稻秸秆液体培养基：水稻秸秆粉末20g，(nh4)2so41.4g，kh2po42.0g，mgso4·7h2o0.3g，cacl2·2h2o0.4g，胰蛋白胨1g，feso4·7h2o0.0075g，mnso4·h2o0.0025g，znso40.002g，cocl20.003g，去离子水1000ml，ph自然，121℃高压灭菌20min。

所述的水稻秸秆粉末为含水量≤1％的水稻秸秆经粉碎、过40目筛制得。

本发明所述的含有高温秸秆降解细菌b-8的菌剂在降解农作物秸秆方面的应用。

所述的应用，包括：农作物秸秆采用1％naoh溶液浸泡30min，50℃烘干，剪碎；将经过处理的农作物秸秆和液体产酶培养基混匀，接种菌剂，在温度65～75℃、转速170～200r/m下培养；其中，经过处理的农作物秸秆、液体产酶培养基和菌剂的比例为1:50:0.5(g:g:ml)。

所述的液体产酶培养基：(nh4)2so41.4g，kh2po42g，mgso4·7h2o0.3g，cacl2·2h2o0.4g，胰蛋白胨1g，feso4·7h2o0.0075g，mnso4·h2o0.0025g，znso40.002g，cocl20.003g，去离子水1000ml，ph自然，121℃高压灭菌20min。

所述的农作物秸秆为水稻秸秆、小麦秸秆、玉米等农作物秸秆。

本发明所述的高温为65～75℃。

本发明的有益效果：

本发明细菌b-8能在cmc-刚果红培养基上产生水解圈，可以在农业废弃物秸秆(水稻、小麦、玉米等秸秆)为唯一碳源的培养基上生长。

本发明细菌b-8能够产生降解纤维素和半纤维素的酶类，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，为高效快速的降解不同秸秆底物提供了基础，确保秸秆降解细菌在高温条件下将废弃农业秸秆发酵分解后制成小分子有机物料，降解7d，即可使秸秆底物降解率达到17.67％，加速秸秆还田腐熟，不仅可以变废为宝、保护环境，还可以促进可持续发展，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为细菌b-8的菌落形态。

图2为细菌b-8在cmc-刚果红平板上产生的水解圈。

图3为细菌的系统发育进化树。

图4为水稻秸秆降解前后对比图，a为降解前的水稻秸秆，b为降解7天后的水稻秸秆。

生物保藏信息

b-8，分类命名为土芽孢杆菌(geobacillussp.)，于2019年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.17301。

具体实施方式

实施例1

秸秆降解细菌b-8的分离与鉴定

秸秆降解细菌菌株b-8是从山东省潍坊市某秸秆堆积处筛选得到。利用梯度稀释涂布法将逐级稀释的样品悬液涂布到cmc-刚果红培养基平板，75℃培养筛选纤维素降解菌。挑选在cmc-刚果红培养基平板上产生透明圈较大并生长较快的菌株纯化分离，将它们接种至以水稻秸秆为唯一碳源的水稻秸秆培养基上，75℃培养，比较各菌株生长速度和生长情况，最终得到能在高温条件下高效降解水稻秸秆的细菌菌株b-8。

cmc-刚果红培养基：羧甲基纤维素钠(cmc-na)10.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g，刚果红0.2g，琼脂20g，去离子水1000ml，ph自然，121℃高压灭菌20min。

水稻秸秆培养基：水稻秸秆粉末10g，kh2po43.0g，nano33.0g，cacl20.5g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.0075g，mnso4·h2o0.0025g，znso4·7h2o0.002g，cocl20.003g，琼脂20g，去离子水1000ml，ph自然，121℃高压灭菌20min。所述的水稻秸秆粉末为水稻秸秆烘干至含水量1％以下、粉碎、过40目筛制得。

如图1，b-8生物学特性为：在75℃下，na培养基上培养，初期菌落呈白色，最终菌落主体(培养12h后)呈淡黄色，质地柔软，表面光滑，边缘呈白色。

如图2，细菌b-8在cmc-刚果红培养基上产生水解圈。

采用细菌通用引物27f和1492r进行16s测序，所得序列经blast比对，发现与geobacilluszalihaestrainwsucf-019b有99％的相似度。选取和它相近的一些菌株绘制系统发育进化树(如图3)，结合菌落和形态学特征，鉴定菌株b-8为土芽孢杆菌(geobacillussp.)。

实施例2

将菌株b-8接种到nb培养基中，在温度75℃、转速170r/m条件下培养8～12h至对数期；再将培养至对数期的细菌b-8按1％的接种量接种于水稻秸秆液体培养基中，在温度75℃、转速170r/m条件下培养7d，离心过滤除去菌体和杂质，得到粗酶液，测定粗酶液中内切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶活，见表1。

水稻秸秆液体培养基：水稻秸秆粉末20g，(nh4)2so41.4g，kh2po42g，mgso4·7h2o0.3g，cacl2·2h2o0.4g，胰蛋白胨1g，feso4·7h2o0.0075g，mnso4·h2o0.0025g，znso40.002g，cocl20.003g，去离子水1000ml，ph自然，121℃高压灭菌20min；其中，水稻秸秆粉末为水稻秸秆烘干至含水量1％以下、粉碎、过40目筛制得。

表1高温秸秆降解菌株菌b-8的酶活

从表1中可以看出，细菌b-8能够产生大量降解纤维素和半纤维素的酶类，为高效快速的降解不同秸秆底物提供了基础。

实施例3

采用三角瓶液体发酵的方法研究细菌b-8对水稻秸秆的降解效果：

菌剂的制备：将菌株b-8接种到nb培养基中，在温度75℃、转速170r/m条件下培养8～12h至对数期；再将培养至对数期的细菌b-8按1％的接种量接种于水稻秸秆液体培养基中，在温度75℃、转速170r/m条件下培养7d，离心过滤除去菌体和杂质，得到菌剂。

水稻秸秆预处理：水稻秸秆采用1％naoh溶液浸泡30min去除秸秆表面的蜡质，使纤维素分解菌更好地与秸秆中的纤维素接触，50℃烘干，剪碎至2-3cm长。

液体产酶培养基：(nh4)2so41.4g，kh2po42g，mgso4·7h2o0.3g，cacl2·2h2o0.4g，胰蛋白胨1g，feso4·7h2o0.0075g，mnso4·h2o0.0025g，znso40.002g，cocl20.003g，去离子水1000ml，ph自然，121℃高压灭菌20min。

每个250ml三角瓶分装预处理后水稻秸秆3.00g、液体产酶培养基150ml。处理组接种1.5ml菌剂，混匀后置于75℃恒温摇床170r/m培养，以接种等量无菌水作为对照组。定期观察水稻秸秆的形态变化，7d后，洗去秸秆上的菌体，烘干至恒重，测定其降解率。

接种24h后，处理组培养液开始变浑浊，此时，水稻秸秆开始变软，崩解分散。7d后(图4b)，处理组的秸秆底物降解率为17.67％；而对照组中秸秆无明显变化，依然完整没有很明显的分解，秸秆底物的降解率为8.34％，其降解率不到处理组的1/2。由此可知，接种降解菌b-8可以在高温条件下加快秸秆的分解和其中成分的转化，加速底物的分解和转化。