一种拮抗菌解淀粉芽孢杆菌X8菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种拮抗菌解淀粉芽孢杆菌x8菌株及其应用。

背景技术：

具有“水中人参”美誉的泥鳅(misgurnusanguillicaudatus)，是水产养殖中的常见品种，养殖户遍布除青藏高原地区等特殊地区的全国各地。泥鳅本身肉质十分鲜美，具有丰富的营养，因此销量极好。目前我国是泥鳅出口大国，每年都要往国外出口大量的泥鳅。连云港是全国最大的泥鳅养殖和出口基地，也是全国唯一的国家级出口泥鳅质量安全示范区。每年出口泥鳅1万吨左右，产值达4000多万美元。2017年的1-2月份连云港总共出口泥鳅超过8.112×10⁵kg，占总出口水生生物总量的60.58％。中国香港、澳门频频向大陆发出需求信息，然而供需缺口一直存在，原因就是泥鳅一旦发病，不及时、正确的治疗，泥鳅产量和质粒都受到严重影响，无法满足出口需求。大鳞副泥鳅(paramisgurnusdabryanus)因其体型较大，生长快、抗逆性强、产量高等优点，成为近年新兴的养殖品种。但随着养殖面积的扩大和养殖密度的增加，病害发生也愈加频繁。其中最为常见、危害较大的病就是泥鳅腐皮病。

每到春夏时节，泥鳅在饲养，运输等过程中容易发病。泥鳅腐皮病是一种传染性极，潜伏期长，危害大，发病率高的常见疾病，泥鳅出现腐皮病后，会有烂身，烂鳍，食欲不振的情况，全身出现溃疡，大面积血斑分布在病鱼表面等情况。更糟糕的是，病泥鳅死后，其内脏系统受损，大部分死鳅都是先沉在水底，甚至埋没到淤泥里，只有被水涨泡肿胀后才能浮出水面，死鳅的腹腔内存在大量的病菌，扩散到整个养殖池，从而造成更大的污染和病原传播。关于泥鳅腐皮病病原的研究，仅有萧克宇等报道的温和气单胞菌。

对腐皮病的防控和治疗，目前主要采用化学药物(包括抗生素等)，其结果一是会导致病原菌产生耐药性，二是药物残留会干扰水产动物肠道益生菌的生长和繁殖，三是残留在水体中的消毒剂和抗生素破坏养殖水环境，影响水产品质量，甚至给食用者带来潜在危险。利用拮抗菌来抑制病原菌的发生是一种环境友好型的病害防治方法，目前在其它水产病害防治中已有一些报道。如kozasa应用东洋芽孢杆菌(bacillustoyoi)处理日本鳗鲡，降低了由爱德华菌引起的鳗鲡死亡率；赵淑江等筛选的海洋放线菌对大黄鱼病原性弧菌，副溶血弧菌(v.parahaemolyticus)和哈维弧菌(v.harveyi)具有很强的抑制作用。本发明前期工作，从发病泥鳅池中分离出一批泥鳅腐皮病病原菌，进而以此为指示菌分离筛选拮抗菌，以期为泥鳅腐皮病的防治及相关生物制剂的开发奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种拮抗菌解淀粉芽孢杆菌x8菌株及其应用。

其具体技术方案为：

一种拮抗菌解淀粉芽孢杆菌x8菌株，所述菌株命名为(bacillusamyloliquefaciensstrainx8)，该菌株，已于2018年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018830。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心。

进一步，所述菌株的核苷酸序列如seq:id:no:1所示。

本发明所述拮抗菌解淀粉芽孢杆菌x8菌株在防治泥鳅腐皮病生物制剂制备过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明分离筛选的拮抗菌x8，对引起泥鳅腐皮病的杀鲑气单胞菌d5-7具有较强的抑菌作用，抑菌圈直径达到18.6±0.25mm，其对引起水产病害的其他病原如维氏气单胞菌(a.veronii)、温和气单胞菌(a.sobria)、嗜水气单胞菌(a.hydrophila)、迟缓爱德华菌(edwardsiellatarda)、哈维弧菌(vibrioharveyi)鳗弧菌(v.anguillarum)、也具有较强的抑菌作用，为泥鳅腐皮病的防治及相关生物制剂的开发奠定基础。

附图说明

图1拮抗菌的初筛(a)和拮抗菌的复筛(b)；

图2x8的菌落形态(a)和革兰氏染色结果(b)；

图3x8的明胶(a)和淀粉(b)水解实验；

图4基于16srdna构建的x8(mh128163)系统发育树；

图5x8对不同病原菌的抑制作用，ck为无菌lb，a组为淡水病原菌，b组为海水病原菌。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1拮抗菌的分离

采集连云港市赣榆区某水产养殖公司泥鳅养殖池水样和底泥，用无菌生理盐水按10^-1～10^-7梯度稀释，然后涂布到lb培养基上，28℃培养24h后，根据菌落颜色、形态、大小、边缘整齐度及透明度等特征的不同，用接种环挑取单菌落进行划线分离，直至得到纯培养物，共分离出11株菌株，编号分别为l11，l12，l13，l14，l15，l17，l18，l19，l20，h25，x8。挑取单菌落进行液体培养，加入终浓度15％的甘油，-20℃保存备用。

2拮抗菌的筛选

本实验采用滤纸片抑菌圈法。接种病原菌d5-7于lb液体培养基中，28℃培养16h。取10μl培养液倾注于培养皿中，将冷却到室温的lb固体培养基倒入，轻轻摇晃混匀。将直径为6mm的无菌滤纸片置于培养皿中，再将20μl待测菌液滴加于滤纸片上，28℃培养24h后观察测定抑菌圈大小。将出现抑菌圈的菌株再次复筛，筛选出抑菌圈较大而且稳定出现的菌株进行后续实验。

初选结果显示菌株l11，x8，l18，h25出现抑菌圈，直径分别为11.2±0.11mm、14.2±0.15mm、11.9±0.14mm、9.9±0.25mm。将出现抑菌圈的菌株进行复筛，筛选出抑菌圈较大而且稳定的菌株x8(如图1所示)进行后续实验。

3.拮抗菌x8鉴定

3.1形态特征观察

在lb平板上将拮抗菌x8三区划线，28℃培养24h后观察。x8菌落呈黄白色，多边形，边缘不整齐，表面干燥不平滑，不透明；革兰氏染色呈紫色(如图2所示)，即为革兰氏阳性细菌，大小为(2.99±0.28)μm×(1.17±0.17)μm；有芽孢，无荚膜，无运动性。

3.2生理生化实验

(1)大分子水解实验

以本实验小组已报道的bacilluspumiluse14为对照进行观察，结果表明拮抗菌x8具有水解淀粉和明胶的能力，不能水解酪蛋白、油脂，如图3所示。

(2)细菌微量生化反应管实验

按杭州微生物试剂有限公司《细菌微量生化反应管说明书》操作和观察记载。结果如表1。

表1拮抗菌x8微量生化管反应结果

3.3分子鉴定

采用16srdna序列分析并构建系统发育树。扩增拮抗菌株x8的16srrna基因，琼脂糖凝胶电泳显示，16srdna片段大小约为1500bp。将pcr产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得序列利用ez.biocloud网站查找模式菌株序列并下载，用mega6.06软件采用临接法(重复数为1000，步长值取百分比)构建x8菌株系统发育进化树，结果见图4。

由图4可知，拮抗菌x8与菌株bacillusamyloliquefaciensstraind15同处一支，遗传距离最近，同源性为98％。综合菌落和细胞形态观察、生理生化实验及16srrna基因序列分析，将拮抗菌x8鉴定为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，故暂时定名为b.amyloliquefaciensx8。

4.拮抗菌x8的拮抗谱探讨

采用滤纸片抑菌圈法(ck为无菌lb)，按拮抗d5-7同样方法，结果如图5所示。

从图5的结果可以看出，x8对维氏气单胞菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、鳗弧菌有拮抗性，抑菌圈直径分别达14.7±0.15mm、16.8±0.15mm、11.2±0.1mm、15.9±0.15mm、8.3±0.2mm、11.8±0.13mm、8.2±0.15mm。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>刘爱民

<120>一种拮抗菌解淀粉芽孢杆菌x8菌株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1448

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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