控制大豆类胡萝卜素含量的基因及其应用的制作方法

本发明属于植物分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种大豆gmicc1基因以及该基因参与调控大豆的类胡萝卜素含量、aba响应相关的胁迫反应及异黄酮含量中的应用。

背景技术：

类胡萝卜素是人体不能合成的必需营养元素，是人体普遍缺乏的维生素a的前体物质。类胡萝卜素广泛存在于谷物、水果和蔬菜中，然而，大多数谷物中仅含有少量的类胡萝卜素，而且人类长期较少食用水果和蔬菜的饮食习惯，导致目前饮食中的类胡萝卜素含量远远不能满足人体需求，这一问题在发展中国家尤为普遍。因此，提高谷物中的维他命a含量是缓解维他命a匮乏的一个重要战略。大豆作为最广泛被食用的主要作物之一，培育高类胡萝卜素的高营养大豆新品种对于维他命a缺乏人群膳食营养的改善具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种控制大豆类胡萝卜素含量的基因及其应用。

本发明提供的大豆gmicc1基因，其具有：

1)seqidno.1所示的核苷酸序列，或

2)在seqidno.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与seqidno.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有80％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与大豆gmicc1基因核苷酸序列互补的dna分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明gmicc1基因序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。

其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与gmicc1基因杂交。

严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。本发明所述严格条件优选为在6×ssc(柠檬酸钠)、0.5％sds(十二烷基磺酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc、0.1％sds和1×ssc、0.1％sds各洗膜1次。

本发明提供了大豆gmicc1基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为：

(a)由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

(b)将seqidno.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由seqidno.2衍生的且保持seqidno.2所示的蛋白功能相同的蛋白。

本发明还提供了一种大豆gmicc1基因的突变体，其核苷酸序列为seqidno.1所示的核苷酸序列中的第877位的g缺失，产生截短的转录本和新的3’utr区。

含有本发明所述大豆gmicc1基因或所述突变体的生物材料属于本发明的保护范围，其中所述生物材料为重组表达载体、质粒、表达盒、重组菌或宿主细胞。

本发明提供了所述的大豆gmicc1基因或其编码的蛋白、或所述的突变体、或所述的生物材料的以下任一应用：

(1)在调控植物类胡萝卜素含量中的应用。

(2)在促进植物中类胡萝卜素含量提高中的应用。

(3)在提高植物中aba含量中的应用。

(4)在提高植物中异黄酮含量中的应用。

(5)在制备抗旱性能提高的转基因植物中的应用。

(6)在制备类胡萝卜素含量提高、或aba含量提高、或异黄酮含量提高的转基因植物中的应用。

(7)在提高植物抗性中的应用。

本发明所述的所述类胡萝卜素包括β-类胡萝卜素(β-carotene)和/或叶黄素。

优选地，所述的抗性为抗旱性。

优选地，所述植物为大豆。

本发明的有益效果在于：

(1)大豆gmicc1基因分离自大豆，作为大豆的内源基因，对大豆的基因工程改造非常有利。

(2)gmicc1基因参与调控大豆的类胡萝卜素含量、aba响应相关的胁迫反应及异黄酮含量，不仅可以提高大豆中的维生素a源等含量还能提高植株的抗性。gmicc1基因在植物育种和种质资源改良方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1显示gmicc1基因与抗旱能力间的关系。a：野生型和gmicc1突变体在对照及干旱处理时的aba含量；b：aba响应基因在对照及干旱处理时的野生型和gmicc1突变体中表达水平；c：野生型和gmicc1突变体在对照及离体30分钟时的气孔变化。

图2显示gmicc1基因与异黄酮含量间的关系。a：野生型和gmicc1突变体中代表性异黄酮含量；b：异黄酮合成相关基因在野生型和gmicc1突变体中的表达水平。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生物材料、试剂均为市售可得。

实施例1大豆中gmicc1基因的分离和结构分析

(1)gmicc1基因的分离

从大豆品种williams82幼嫩叶片中,分离mrna,以此mrna为模板,以oligo(t)17为引物合成cdna第一条链。接着以该cdna第一条链为模板，引物(5’-cggaattcatggtcccaaaaccaatc-3’)和引物(5’-cccaagctttcacgacaacgacacttt-3’)进行pcr扩增，获得了1个gmicc1基因的长为1773bp的cdna片段，克隆到pgemteasy载体(takara公司)中并命名为pgemteasy-gmicc1。

pgemteasy-gmicc1中所包含gmicc1cds序列如seqidno.1所示，共1773bp，它编码一个590个氨基酸的蛋白(seqidno.2)。

(2)基因的结构分析

以williams82幼嫩叶片为材料，提取其中的dna，接着以该基因组dna为模板，ol6828(5’cccaagcttgacaagtgcagcacacgataag3’)和ol6829(5’cgggatcccgacaacgacactttcctcag3’)为引物进行扩增获得了gmicc1基因组的片段，gmicc1dna序列如seqidno.3所示，共2572bp，它含有1个内含子和2个外显子。

实施例2大豆gmicc1基因调控类胡萝卜含量

通过筛选伽马射线诱变的大豆williams82突变体库，获得了gmicc1突变体。参考gonzalez-jorge等报道的方法(carotenoidcleavagedioxygenase4isanegativeregulatorofb-carotenecontentinarabidopsisseeds.theplantcell,2013,25:4812–4826.)利用高效液相色谱分析和测定野生型和gmicc1突变体种子中的类胡萝卜素含量，gmicc1突变体中不同种类胡萝卜素含量均高于野生型对照(表1)。与野生型williams82相比，类胡萝卜素总量升高了3倍，gmicc1突变体中β-类胡萝卜素(β-carotene)和叶黄素(lutein)含量分别是野生型对照的12倍和4倍。具体结果见表1。

表1.野生型和gmicc1突变体中类胡萝卜素含量

实施例3大豆gmicc1基因的功能验证

(a)大豆gmicc1基因调控aba含量及气孔运动

利用植物aba酶联反应试剂盒(njjcbioco.,ltd)分析和检测野生型和gmicc1突变体在对照(正常生长条件，未做任何处理)及10％聚乙二醇(peg)6000溶液干旱处理时的脱落酸(aba)含量，发现gmicc1突变体在对照及干旱处理时的aba含量(34.97ng/mg和74.75ng/mg)均高于野生型对照(25.02ng/mg和52.20ng/mg)，aba响应基因gmzep，gmpyr/pyl，gmpp2c，gmsnrk2和gmabf的表达也有明显变化，实时定量pcr结果显示，gmpyr-1，gmpp2c-1/-2，gmsnrk2-1和gmabf-1的基因表达水平明显升高，gmpyr-1基因表达水平显著降低。同时，参考等su等方法(jianbinsu,etal.regulationofstomatalimmunitybyinterdependentfunctionsofapathogen-responsivempk3/mpk6cascadeandabscisicacid.theplantcell,2017,29:526-542.)固定叶片并利用激光共聚焦显微镜观察离体30分钟的野生型对照和gmicc1突变体叶片，gmicc1突变体叶片上的气孔关闭速率明显快于野生型对照，相同叶片面积内gmicc1突变体气孔关闭率为24.12％，野生型为42.86％(图1)。

(b)大豆gmicc1基因影响异黄酮含量

通过高效液相色谱分析和检测野生型和gmicc1突变体中的异黄酮含量，发现最具代表性的大豆苷元和黄豆黄素含量明显升高，野生型大豆中大豆苷元和黄豆黄素含量分别为1.01μmol/g和0.65μmol/g，gmicc1突变体中大豆苷元和黄豆黄素含量分别为2.67μmol/g和1.78μmol/g，同时，实时定量pcr结果显示异黄酮合成相关基因在野生型和gmicc1突变体中的表达水平具有显著差异，gmchs-1/-1、gmf3h、gmcyp93c、gmhi4omt、gm7-iomt-1和gmvr表达水平显著升高(图2)。

综上所述，大豆gmicc1基因可以参与调控植物的类胡萝卜素含量、aba响应相关的胁迫反应及异黄酮含量，特别是gmicc1基因的突变体(其核苷酸序列为seqidno.1所示的核苷酸序列中的第877位的g缺失，产生截短的转录本和新的3’utr区)不仅可以显著提高大豆中的维生素a源等含量还能显著提高植株的抗性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>控制大豆类胡萝卜素含量的基因及其应用

<130>khp191112237.7

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1773

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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gagagtgagctgaggaaagtgtcgttgtcgtga1773

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<211>590

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cggaattcatggtcccaaaaccaatc26

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cccaagctttcacgacaacgacacttt27