一种猕猴桃果实淀粉体提取方法与流程

本发明涉及植物生物化学技术领域，具体涉及一种猕猴桃果实淀粉体提取方法。

背景技术：

猕猴桃是一种新兴水果，果实营养丰富，富含维生素c和矿物质，其中维生素c含量比柑桔、苹果等高几倍至几十倍，为果品中营养最全面的水果之一，且具有促进食欲、保健美容的作用，是一种深受消费者喜爱的水果，有“水果之王”的美称。

质体是仅存在于植物和藻类细胞中的主要细胞器，在生物合成及代谢功能中起着重要作用。质体包括前质体，叶绿体、白色体、有色体、淀粉体等。质体不仅参与光合作用、氮吸收，且广泛参与氨基酸、脂肪、淀粉以及次生代谢物的合成与贮藏，是调控植物细胞基本构架及功能所需的关键亚细胞器。

淀粉体是一种异养型的质体，主要功能是合成和贮藏大量的淀粉。淀粉是贮藏器官主要的碳水化合物，在谷物类、根茎作物、豆类等农作物中有大量报道，而在园艺作物中淀粉研究的报道较少。淀粉是猕猴桃主要的干物质，占果实比重达50％以上。猕猴桃和其他很多水果类园艺作物一样，在发育前期主要积累淀粉，并在成熟期迅速降解。猕猴桃果实采后淀粉降解与果实软化密切联系，并与果实的糖酸风味直接相关。因此，分离提纯完整的淀粉体对研究淀粉的生物学功能和淀粉工业具有重要意义。

技术实现要素：

针对上述问题，现提供一种纯度及完整度都上佳的猕猴桃果实淀粉体的提取方法。

具体技术方案如下：

一种猕猴桃果实淀粉体提取方法，具体实施是用percoll原液配成的梯度分离液，进行两次密度梯度离心，得到纯化的淀粉体，其步骤包括：

1)、取猕猴桃果实，削去外果皮并去掉中柱部分后将果肉切成块状，取30克样品，向其中加入90ml缓冲液a后将其搅碎至匀浆状，得匀浆液；

2)、将匀浆液通过两层纱布和四层米拉滤布过滤，得滤液，将滤液分装到50ml离心管中，再于4℃条件下以800g离心8分钟，取下层沉淀；

3)、向沉淀中加入2ml缓冲液a，轻轻重悬，得到待用的样品i；

4)、用缓冲液b将percoll原液稀释成体积分数为50％的梯度分离液，取5ml梯度分离液置于10ml容积的离心管中，将离心管置于冰盒中预冷10分钟；

5)、用缓冲液a将样品i稀释到5ml，随后轻轻加入到离心管中梯度分离液的液面上方，再于4℃条件下以500g离心8分钟，轻轻倒掉上清液，并用2ml的缓冲液a重悬沉淀，再向其中加入2倍体积的缓冲液a并于4℃条件下以800g离心5分钟，弃上清，得样品ii；

6)、用5ml缓冲液a将样品ii轻轻重悬，重复步骤5)，得纯化的猕猴桃淀粉体；

其中，缓冲液a、b配方如下所示：

缓冲液a

0.2m羟乙基哌嗪乙磺酸；

0.8m山梨醇；

1mm乙二胺四乙酸；

1mm氯化钾；

2mm氯化镁；

2mm二巯基苏糖醇；

缓冲液b

0.4m羟乙基哌嗪乙磺酸；

1.6m山梨醇；

2mm乙二胺四乙酸；

2mm氯化钾；

4mm氯化镁；

4mm二巯基苏糖醇。

本发明缓冲液a中二巯基苏糖醇需在缓冲液使用前加入，且缓冲液在使用前需用氢氧化钠将ph值调整至7.5。

本发明缓冲液b中二巯基苏糖醇需在缓冲液使用前加入，且缓冲液在使用前需用氢氧化钠将ph值调整至7.5。

本发明中进行纯化提取时所用相关提取设备应于冰面上预冷30分钟以上，且纯化提取时相关漏斗、纱布、滤布等需用2ml缓冲液a浸湿。本发明中纯化提取需要在冰上或者4℃环境中进行。

上述方案的有益效果是：

1)、本发明首次独创性地从猕猴桃果实中分离出高纯度和高完整度的淀粉体；

2)、本发明采用percoll分离液可从30克猕猴桃果实中分离得到约10g淀粉体，有效分离率较高。

附图说明

图1a为本发明的实施例中提供的淀粉体的westernblot杂交图，图1b为果肉和淀粉体蛋白聚丙烯酰氨凝胶电泳图；

图2为本发明的实施例1中提供的淀粉体的结构观察示意图；

图3为本发明的实施例2中提供的淀粉体的结构观察示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

一种猕猴桃果实淀粉体提取方法，包括如下步骤：

1)、将100ml量筒、500ml烧杯、15厘米外口径的漏斗、0.22微米孔径的米拉滤布、医用脱脂纱布、50ml离心管和10ml离心管放置在冰面上预冷30分钟以上，并用2ml缓冲液a将漏斗和纱布、滤布浸湿；

2)、取猕猴桃果实，削去1毫米厚度的外果皮后去掉中柱部分，将果肉切成0.5厘米×0.5厘米的块状，称重30克样品，加入90ml缓冲液a，用九阳破壁机以搅拌模式将样品搅碎，反复3次，每次3-5秒至其呈匀浆状，得匀浆液；

3)、将第2)步得到的匀浆液通过两层纱布和四层米拉滤布过滤，得到滤液，将滤液分装到50ml离心管中，再于4℃条件下以800g离心8分钟，取下层沉淀；

4)、向步骤3)中获得的沉淀中轻轻加入2ml缓冲液a，轻轻重悬(具体方法是离心管放在冰面上打圈，长时间未重悬的沉淀可以用滴管轻轻吸打)，得到待用的样品i；

5)、用缓冲液b将100％的percoll原液稀释成体积分数为50％的梯度分离液，取5ml置于10ml容积的离心管中，冰盒中预冷10分钟；

6)、用缓冲液a将样品i稀释到5ml，随后轻轻加入到步骤5)离心管中梯度分离液的液面上方，再于4℃条件下以500g离心8分钟，轻轻倒掉上清液，再用2ml的缓冲液a重悬沉淀(具体方法是离心管放在冰面上打圈，长时间未重悬的沉淀可以用滴管轻轻吸打)，再加入2倍体积的缓冲液a，再于4℃条件下以800g离心5分钟，得样品ii；

7)、用5ml缓冲液a将步骤6)中样品ii轻轻重悬(方法同上)，重复步骤6)，得到纯化的猕猴桃果实淀粉体；

其中，缓冲液a、b配方如下所示：

缓冲液a

0.2m羟乙基哌嗪乙磺酸；

0.8m山梨醇；

1mm乙二胺四乙酸；

1mm氯化钾；

2mm氯化镁；

2mm二巯基苏糖醇；

缓冲液b

0.4m羟乙基哌嗪乙磺酸；

1.6m山梨醇；

2mm乙二胺四乙酸；

2mm氯化钾；

4mm氯化镁；

4mm二巯基苏糖醇；

本发明缓冲液a中二巯基苏糖醇需在缓冲液使用前加入，且缓冲液在使用前需用氢氧化钠将ph值调整至7.5；

本发明缓冲液b中二巯基苏糖醇需在缓冲液使用前加入，且缓冲液在使用前需用氢氧化钠将ph值调整至7.5；

本发明中纯化提取需要在冰上或者4℃环境中进行。

实施例1

于2018年8月在湖北省赤壁市海沃德猕猴桃基地采摘海沃德猕猴桃果实样品，并按照如上方法进行提取。

实施例2

于2018年8月在湖北省咸宁市花果山猕猴桃基地采摘的红阳猕猴桃果实样品，并按照如上方法进行提取。

本发明中通过westernblot杂交检测判断提纯的淀粉体的纯度，其主要原理为：提纯的质体往往容易受到线粒体、胞质和液泡的污染，利用不同亚细胞器的标记抗体做westernblot杂交可以检验是否存在其他亚细胞器的污染。本发明使用以下抗体验证提纯淀粉体的纯度：(1)ugpase胞质标记抗体：胞质蛋白51.6kda，稀释比例1:2000；(2)vdac1线粒体外膜标志抗体：线粒体膜蛋白29kda，稀释比例1:5000；(3)v-atpase液泡标志抗体：液泡蛋白26-31kda，稀释比例1:2000；(4)pgl35(质体小球标记抗体)：原纤维蛋白35，稀释比例：1:2000。

本发明中通过细胞学观察验证提纯的淀粉体的完整度，其主要原理为：在具有相位差功能的光学显微镜下，完整的淀粉体可观察到典型的膜结构；同时，通过扫描电镜和透射电子显微镜则可观察到淀粉体表面及内部的微细结构。

westernblot杂交检测表明，本发明实施例1、2中提纯的淀粉体的纯度均达90％以上，且未受到细胞质、线粒体及液泡的污染(实施例1(图1a)、实施例2(图1b))。

细胞学结构观察(光学显微镜(图2a、d)、透射电镜(图2b、e)、扫描电镜(图2c、f))观察表明，本发明的实施例1中提纯的淀粉体呈不定形、半晶体状，直径大小为2-10μm，且淀粉体中可以清晰的看到淀粉体结构特征、表明其完整度较高。

细胞学结构观察(光学显微镜(图3a、d)、透射电镜(图3b、e)、扫描电镜(图3c、f))观察表明，本发明的实施例2中提纯的淀粉体呈不定形、半晶体状，直径大小为2-10μm，且淀粉体中可以清晰的看到淀粉体结构特征、表明其完整度较高。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。