盐红菌Halorubrumsp.HRM-150及其发酵生产类胡萝卜素的方法与流程

本发明涉及天然类胡萝卜素生产技术领域，具体涉及一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株及利用盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株发酵生产类胡萝卜素的方法。

背景技术：

类胡萝卜素(carotenoids)是碳氢类胡萝卜素(carotenes)和含氧类胡萝卜素(xanthophylls)两大类色素的总称，一般由8个类异戊二烯单位组成，呈现黄色、橙红色或者红色。天然类胡萝卜素的主要来源于植物、动物和微生物，可用作着色剂、和抗氧化剂，在提高机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长等方面具有广阔的应用前景。

菌红素作为类胡萝卜素中的一类少见的羟基化c50类胡萝卜素，属于高碳类胡萝卜素。菌红素较β-胡萝卜素清除羟自由基的能力更强，且其抗氧化能力比β-胡萝卜素高出50％。但目前未见一种利用微生物发酵生产类胡萝卜素的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株及其发酵生产类胡萝卜素的方法。本发明提供的菌株能够生产类胡萝卜素。

本发明提供了一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株，保藏编号为cgmccno.17350。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株在生产类胡萝卜素中的应用。

优选的是，所述类胡萝卜素包括菌红素、单脱水菌红素、番茄红素和β-胡萝卜素。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株生产类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

1)将盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株接种到发酵培养基中进行连续发酵培养；所述发酵培养基含质量分数为1％的氮源和质量分数为1％的碳源，盐度为150～250；所述发酵培养的条件为：起始转速200rpm，至对数生长期转速升高至400rpm，发酵至50～54h时补加碳源，80～84h结束发酵；

2)收集菌体，加入蒸馏水，得到细胞裂解液；

3)将细胞裂解液、三氯甲烷和甲醇以1:1:2的体积比混合，震荡，静置4h以上，收集下层有机相，将所述有机相进行旋蒸浓缩，利用氮气去除残余溶剂。

优选的是，步骤1)所述氮源包括酵母提取物和酸水解酪蛋白。

优选的是，步骤1)所述碳源包括可溶性淀粉。

优选的是，步骤1)所述补加为补加发酵培养基的质量分数为1％的碳源。

优选的是，步骤2)所述收集菌体的条件为：在4℃下8000rpm离心10min，取沉淀。

优选的是，步骤3)所述旋蒸浓缩的水浴温度为30～35℃，转速为100rpm。

本发明提供了一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株。本发明提供的hrm-150菌株为极端嗜盐菌，将所述盐红菌属古菌hrm-150菌株采用连续发酵的方式进行发酵，得到的发酵菌体湿重高达20g/l，色素含量高达1.25％ww。

附图说明

图1为本发明提供的hrm-150菌落形态；

图2为本发明提供的hrm-150菌株电子显微镜图片；

图3为本发明提供的基于16srrna片段序列的hrm-150系统育树分析；

图4为本发明是实施例1提供的hrm-150菌株在不同培养条件下的生长曲线；

图5为本发明是实施例1提供的hrm-150菌株在不同培养条件下的菌体湿重情况；

图6为本发明是实施例1提供的hrm-150菌体色素粗提物的tlc以及硅胶柱层析分离结果；

图7为本发明是实施例1提供的色素组分抗氧化水平测试结果。

生物保藏信息

盐红菌halorubrumsp.，菌株编号为hrm-150，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏时间为2019年3月18日，保藏编号为cgmccno.17350。

具体实施方式

本发明提供了一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株，保藏编号为cgmccno.17350。

在本发明中，所述盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株的菌落形态图如图1所示，菌落为红色，圆形，光滑；菌株电子显微镜图片如图2所示，细胞为短棒状。在本发明中，所述盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株的16srrna序列如seqidno.1所示，其16srrna基因序列全长如下：

gattcgacgttcgtggaacgcctcatccggacctcactcgggtgctttgacgggcggtgtgtgcaaggagcagggacgtattcaccgcgcgcttgtgacacgcgattactaccgaatccagcttcatgtgggcgagttgcagcccacaatccgaactacgatcgagtttctgagattaccgtctcctttcggagttggaaccctttgtctcgaccattgtagcccgcgtgttgcccagcacattcggggcatactgacctaccgttgcccgttccttcctccgtgttagccacggcggtccccctactgtccccagctacctcgcggtactgctggcaagtaagggtgcgggtctcgctcgttgcctgacttaacaggacgcctcacggtacgagctgacggcggccatgcacctcctctctgaaactcggacaaggtcatcaacctggtcgtcattattacagtcgatgctggtgagatgtccggcgttgagtccaattaaaccgcaggctcctccggttgtagtgctcccccgccaattcctttaagtttcatccttgcggacgtacttcccaggcggtctgcttagcggcttccctacggcacagcacccactcgtagtgggagccacacctagcagacattgtttacggccaggactacccgggtatctaatccggttcgagaccctggctttcgtccctcactgtcggatccgtcctcgcgacgtgctttcgccatcggcggtccgtccaggattacgggatttcactcctaccccggacgtacccgtcgcgccttccggtcccaagccacgcagtttctaccgggcgcccacctgttgggcaggtggatttcccgatggacttgcgcggccagctacggacgctttaggcccaataagatcggccatcacttgggctgccggtattaccgcggcggctggcaccggtcttgcccagcccttattctggtaccaccttacggtaccgaaaagcacaggcgctatgcctgtgcacttgggatccccctatcgcactgtcgtgcagtgtaaaggtttcgcgcctgctgcgccccgtagggcccggaatcttgtctcagattccgtctctgggttctcactctcatgacccataccgattattggcacggtgggccgttaccccaccgtctacctaatcggccgcagccacatccttcggcgccggagcgtttggcataccactcattccagtggtggtatggtatacactattagcctcagtttcccgagggtattgtgttccgaagggtagtttggccacgtgttactgagctattcgccacgagtctgaactcgtgcgac。

基于16srrna片段序列的系统发育树分析结果如图3所示。从genebank查找相似度较高的序列，构建系统进化树，发现halorubrumsp.hrm-150菌株与ncbi数据库中四个halorubrum菌株相似度均为99.8％以上。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株在生产类胡萝卜素中的应用。在本发明中，所述类胡萝卜素包括菌红素、单脱水菌红素、番茄红素和β-胡萝卜素。其中，所述类胡萝卜素中菌红素含量最高。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株生产类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

1)将盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株接种到发酵培养基中进行连续发酵培养；所述发酵培养基含质量分数为1％的氮源和质量分数为1％的碳源，盐度为150～250；所述发酵培养的条件为：起始转速200rpm，至对数生长期转速升高至400rpm，发酵至50～54h时补加碳源，80～84h结束发酵；

2)收集菌体，加入蒸馏水，得到细胞裂解液；

3)将细胞裂解液、三氯甲烷和甲醇以1:1:2的体积比混合，震荡，静置4h以上，收集下层有机相，将所述有机相进行旋蒸浓缩，利用氮气去除残余溶剂。

本发明将盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株接种到发酵培养基中进行连续发酵培养；所述发酵培养基含质量分数为1％的氮源和质量分数为1％的碳源，盐度为150～250；所述发酵培养的条件为：起始转速200rpm，至对数生长期转速升高至400rpm，发酵至50～54h时补加碳源，80～84h结束发酵。在本发明中，所述氮源包括酵母提取物和酸水解酪蛋白。在本发明中，所述碳源包括可溶性淀粉。在本发明中，所述补加为补加发酵培养基的质量分数为1％的碳源。本发明所述盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株能够在高盐条件下生长，本发明较高的盐度设置可减少发酵过程中的污染。

结束发酵后，本发明收集菌体，加入蒸馏水，得到细胞裂解液。本发明加入蒸馏水后，优选进行震荡，使菌体和蒸馏水充分混匀，本发明菌体可利用渗透压变化进行裂解，方便色素的提取、分离和纯化。在本发明中，所述收集菌体的条件优选为：在4℃下8000rpm离心10min，取沉淀。

得到细胞裂解液后，本发明将细胞裂解液、三氯甲烷和甲醇以1:1:2的体积比混合，震荡，静置4h以上，收集下层有机相，将所述有机相进行旋蒸浓缩，利用氮气去除残余溶剂。在本发明中，所述旋蒸浓缩的水浴温度为30～35℃，转速为100rpm。

下面结合具体实施例对本发明所述的一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株及其发酵生产类胡萝卜素的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1)碳、氮源单因素实验(96孔板实验)

采用的碳源包括：可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖；氮源包括：明胶、酵母提取物&酸水解酪蛋白(4/3,g/g)，培养基ph7.0～7.2，培养基灭菌后使用。碳(c)、氮(n)源分别包括三个水平，即0.5％、1％和1.5％，并由该组空白培养基作为对照。菌体接种量为1％。

使用生长曲线分析仪(oygrowthcurvesfp-1100-c，芬兰)测定细胞的生长状况。菌体积累在与仪器配套的孔板中进行，每孔加入200～400μl培养液进行实验。实验条件：检测od600和od494，温度37.0℃，转速150rpm，时间为6d。生长曲线结果如图4所示(其中，图4a为菌株以可溶性淀粉为碳源，分别以酵母提取物&酸水解酪蛋白、明胶为氮源时的细胞生长情况；图4b为菌株在以酵母提取物&酸水解酪蛋白为氮源，分别以可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖为碳源时的细胞生长情况)。

2)最适碳氮源比例实验(500ml摇瓶实验)

根据上述结果，菌株hrm-150在可溶性淀粉与酵母提取物&酸水解酪蛋白共同存在的培养基中能够出现菌体的大量生长。实验设计碳氮源分别以0.5％、1％、1.5％的添加量进行正交实验。实验以三水平不添加碳源的氮源组作为对照，其它实验条件不变。

菌体采用恒温摇床(hmy-211b，欧诺，中国)进行培养。实验条件：温度37.0℃，转速150rpm，培养12d。每隔1d取样一次，测定od600。并测定发酵实验终止时的菌体湿重。菌体始终测定结果如图5所示(其中，图5a为不添加碳源的情况下，不同氮源添加量对菌株生长的影响；图5b为氮源添加量为0.5％时，不同碳源添加量对菌株生长的影响；图5c为氮源添加量为1％时，不同碳源添加量对菌株生长的影响；图5d为氮源添加量为1.5％时，不同碳源添加量对菌株生长的影响)。

在不添加碳源的情况下，hrm-150菌体湿重随氮源添加比例的增加而增加，在改良cm培养基中(即17.5g/l)，菌体湿重达到最高(4.15g/l)。当氮源添加比例为0.5％时，添加碳源促进菌体生长。当碳源添加量为1.5％时，菌体湿重达到最高(7.30g/l)。当氮源添加比例为1％时，添加碳源同样促进菌体生长，但三个水平的碳源对菌体生长的影响相差不大，添加1％碳源时菌体湿重达到最高(8.47g/l)。当氮源添加水平为1.5％时，添加1％碳源菌体湿重最高(8.81g/l)。

综上所述，在无碳源添加的组别，氮源添加水平的增加会增加菌体积累量；在同一氮源水平下添加碳源，菌体积累量会大幅度增加，且菌体积累量会随着添加碳源的比例增高而增加，1％氮源添加组除外，该组碳源添加水平对菌体积累量并无产生太大差异。考虑到成本的因素，选择1％氮源和1％碳源水平进行hrm-150菌体的大量培养。

3)发酵实验(5l全自动连续发酵罐)

利用上述实验获得最适碳氮比，即发酵培养基组成为：10g/l酵母提取物和7.5g/l酸水解酪蛋白，碳源选择可溶性淀粉10g/l。发酵控制条件：盐度150；起始转速200rpm，至对数生长期逐渐升高至400rpm；发酵至54h时补加可溶性淀粉10g/l，84h结束发酵。测定菌体湿重为20g/l。

采用高速冷冻离心机(h-2050r，湘仪，中国)8000rpm，10min，4℃进行菌体收集，收集后的菌体放入4℃备用。色素提取后进行硅胶柱层析分离(结果如图6所示)，从hrm-150细胞中分离得到四种主要组分，分别命名为r1-r4。经分析鉴定，r1、r2、r3和r4组分分别为β-胡萝卜素、番茄红素、单脱水菌红素和菌红素，产量分别为7.46、10.82、7.45和5.36mg/l(如表1所示)。

表1为halorubrumhrm-150色素组分及含量。

抗氧化实验(如图7所示，其中，图7a为色素组分dpph自由基的清除率，图7b为色素组分还原力，图7c为色素组分总抗氧化力，图7d为色素组分螯合亚铁离子能力)表明，与其它色素组分相比，菌红素(r4)对自由自由基清除率最高，达到17.68％，高于阳性对照组合成β-胡萝卜素；单脱水菌红素(r3)和mix的自由基清除率基本与对照组β-胡萝卜素持平，其余两组分均比阳性对照组低；色素r1-r4还原力均比阳性对照组β-胡萝卜素的还原力高，还原力最强的组分为r4，为0.18；色素r4总抗氧化力最高达22.89％，其余组分的总抗氧化力相差不大，但均低于r4组分的总抗氧化力。色素r3和mix的螯合亚铁离子能力相对较高，其值分别为11.81％和11.35％，均高于阳性对照bha和bht组。

表1halorubrumhrm-150色素组分

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>天津科技大学

<120>盐红菌halorubrumsp.hrm-150及其发酵生产类胡萝卜素的方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1345

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gattcgacgttcgtggaacgcctcatccggacctcactcgggtgctttgacgggcggtgt60

gtgcaaggagcagggacgtattcaccgcgcgcttgtgacacgcgattactaccgaatcca120

gcttcatgtgggcgagttgcagcccacaatccgaactacgatcgagtttctgagattacc180

gtctcctttcggagttggaaccctttgtctcgaccattgtagcccgcgtgttgcccagca240

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