盐红菌Halorubrumsp.HRM-150及其发酵生产类胡萝卜素的方法与流程

文档序号:18477177发布日期:2019-08-20 21:21阅读:479来源:国知局
盐红菌Halorubrum sp.HRM-150及其发酵生产类胡萝卜素的方法与流程

本发明涉及天然类胡萝卜素生产技术领域,具体涉及一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株及利用盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株发酵生产类胡萝卜素的方法。



背景技术:

类胡萝卜素(carotenoids)是碳氢类胡萝卜素(carotenes)和含氧类胡萝卜素(xanthophylls)两大类色素的总称,一般由8个类异戊二烯单位组成,呈现黄色、橙红色或者红色。天然类胡萝卜素的主要来源于植物、动物和微生物,可用作着色剂、和抗氧化剂,在提高机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长等方面具有广阔的应用前景。

菌红素作为类胡萝卜素中的一类少见的羟基化c50类胡萝卜素,属于高碳类胡萝卜素。菌红素较β-胡萝卜素清除羟自由基的能力更强,且其抗氧化能力比β-胡萝卜素高出50%。但目前未见一种利用微生物发酵生产类胡萝卜素的报道。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株及其发酵生产类胡萝卜素的方法。本发明提供的菌株能够生产类胡萝卜素。

本发明提供了一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株,保藏编号为cgmccno.17350。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株在生产类胡萝卜素中的应用。

优选的是,所述类胡萝卜素包括菌红素、单脱水菌红素、番茄红素和β-胡萝卜素。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株生产类胡萝卜素的方法,包括以下步骤:

1)将盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株接种到发酵培养基中进行连续发酵培养;所述发酵培养基含质量分数为1%的氮源和质量分数为1%的碳源,盐度为150~250;所述发酵培养的条件为:起始转速200rpm,至对数生长期转速升高至400rpm,发酵至50~54h时补加碳源,80~84h结束发酵;

2)收集菌体,加入蒸馏水,得到细胞裂解液;

3)将细胞裂解液、三氯甲烷和甲醇以1:1:2的体积比混合,震荡,静置4h以上,收集下层有机相,将所述有机相进行旋蒸浓缩,利用氮气去除残余溶剂。

优选的是,步骤1)所述氮源包括酵母提取物和酸水解酪蛋白。

优选的是,步骤1)所述碳源包括可溶性淀粉。

优选的是,步骤1)所述补加为补加发酵培养基的质量分数为1%的碳源。

优选的是,步骤2)所述收集菌体的条件为:在4℃下8000rpm离心10min,取沉淀。

优选的是,步骤3)所述旋蒸浓缩的水浴温度为30~35℃,转速为100rpm。

本发明提供了一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株。本发明提供的hrm-150菌株为极端嗜盐菌,将所述盐红菌属古菌hrm-150菌株采用连续发酵的方式进行发酵,得到的发酵菌体湿重高达20g/l,色素含量高达1.25%ww。

附图说明

图1为本发明提供的hrm-150菌落形态;

图2为本发明提供的hrm-150菌株电子显微镜图片;

图3为本发明提供的基于16srrna片段序列的hrm-150系统育树分析;

图4为本发明是实施例1提供的hrm-150菌株在不同培养条件下的生长曲线;

图5为本发明是实施例1提供的hrm-150菌株在不同培养条件下的菌体湿重情况;

图6为本发明是实施例1提供的hrm-150菌体色素粗提物的tlc以及硅胶柱层析分离结果;

图7为本发明是实施例1提供的色素组分抗氧化水平测试结果。

生物保藏信息

盐红菌halorubrumsp.,菌株编号为hrm-150,保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏时间为2019年3月18日,保藏编号为cgmccno.17350。

具体实施方式

本发明提供了一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株,保藏编号为cgmccno.17350。

在本发明中,所述盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株的菌落形态图如图1所示,菌落为红色,圆形,光滑;菌株电子显微镜图片如图2所示,细胞为短棒状。在本发明中,所述盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株的16srrna序列如seqidno.1所示,其16srrna基因序列全长如下:

gattcgacgttcgtggaacgcctcatccggacctcactcgggtgctttgacgggcggtgtgtgcaaggagcagggacgtattcaccgcgcgcttgtgacacgcgattactaccgaatccagcttcatgtgggcgagttgcagcccacaatccgaactacgatcgagtttctgagattaccgtctcctttcggagttggaaccctttgtctcgaccattgtagcccgcgtgttgcccagcacattcggggcatactgacctaccgttgcccgttccttcctccgtgttagccacggcggtccccctactgtccccagctacctcgcggtactgctggcaagtaagggtgcgggtctcgctcgttgcctgacttaacaggacgcctcacggtacgagctgacggcggccatgcacctcctctctgaaactcggacaaggtcatcaacctggtcgtcattattacagtcgatgctggtgagatgtccggcgttgagtccaattaaaccgcaggctcctccggttgtagtgctcccccgccaattcctttaagtttcatccttgcggacgtacttcccaggcggtctgcttagcggcttccctacggcacagcacccactcgtagtgggagccacacctagcagacattgtttacggccaggactacccgggtatctaatccggttcgagaccctggctttcgtccctcactgtcggatccgtcctcgcgacgtgctttcgccatcggcggtccgtccaggattacgggatttcactcctaccccggacgtacccgtcgcgccttccggtcccaagccacgcagtttctaccgggcgcccacctgttgggcaggtggatttcccgatggacttgcgcggccagctacggacgctttaggcccaataagatcggccatcacttgggctgccggtattaccgcggcggctggcaccggtcttgcccagcccttattctggtaccaccttacggtaccgaaaagcacaggcgctatgcctgtgcacttgggatccccctatcgcactgtcgtgcagtgtaaaggtttcgcgcctgctgcgccccgtagggcccggaatcttgtctcagattccgtctctgggttctcactctcatgacccataccgattattggcacggtgggccgttaccccaccgtctacctaatcggccgcagccacatccttcggcgccggagcgtttggcataccactcattccagtggtggtatggtatacactattagcctcagtttcccgagggtattgtgttccgaagggtagtttggccacgtgttactgagctattcgccacgagtctgaactcgtgcgac。

基于16srrna片段序列的系统发育树分析结果如图3所示。从genebank查找相似度较高的序列,构建系统进化树,发现halorubrumsp.hrm-150菌株与ncbi数据库中四个halorubrum菌株相似度均为99.8%以上。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株在生产类胡萝卜素中的应用。在本发明中,所述类胡萝卜素包括菌红素、单脱水菌红素、番茄红素和β-胡萝卜素。其中,所述类胡萝卜素中菌红素含量最高。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株生产类胡萝卜素的方法,包括以下步骤:

1)将盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株接种到发酵培养基中进行连续发酵培养;所述发酵培养基含质量分数为1%的氮源和质量分数为1%的碳源,盐度为150~250;所述发酵培养的条件为:起始转速200rpm,至对数生长期转速升高至400rpm,发酵至50~54h时补加碳源,80~84h结束发酵;

2)收集菌体,加入蒸馏水,得到细胞裂解液;

3)将细胞裂解液、三氯甲烷和甲醇以1:1:2的体积比混合,震荡,静置4h以上,收集下层有机相,将所述有机相进行旋蒸浓缩,利用氮气去除残余溶剂。

本发明将盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株接种到发酵培养基中进行连续发酵培养;所述发酵培养基含质量分数为1%的氮源和质量分数为1%的碳源,盐度为150~250;所述发酵培养的条件为:起始转速200rpm,至对数生长期转速升高至400rpm,发酵至50~54h时补加碳源,80~84h结束发酵。在本发明中,所述氮源包括酵母提取物和酸水解酪蛋白。在本发明中,所述碳源包括可溶性淀粉。在本发明中,所述补加为补加发酵培养基的质量分数为1%的碳源。本发明所述盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株能够在高盐条件下生长,本发明较高的盐度设置可减少发酵过程中的污染。

结束发酵后,本发明收集菌体,加入蒸馏水,得到细胞裂解液。本发明加入蒸馏水后,优选进行震荡,使菌体和蒸馏水充分混匀,本发明菌体可利用渗透压变化进行裂解,方便色素的提取、分离和纯化。在本发明中,所述收集菌体的条件优选为:在4℃下8000rpm离心10min,取沉淀。

得到细胞裂解液后,本发明将细胞裂解液、三氯甲烷和甲醇以1:1:2的体积比混合,震荡,静置4h以上,收集下层有机相,将所述有机相进行旋蒸浓缩,利用氮气去除残余溶剂。在本发明中,所述旋蒸浓缩的水浴温度为30~35℃,转速为100rpm。

下面结合具体实施例对本发明所述的一株盐红菌halorubrumsp.hrm-150菌株及其发酵生产类胡萝卜素的方法做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1)碳、氮源单因素实验(96孔板实验)

采用的碳源包括:可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖;氮源包括:明胶、酵母提取物&酸水解酪蛋白(4/3,g/g),培养基ph7.0~7.2,培养基灭菌后使用。碳(c)、氮(n)源分别包括三个水平,即0.5%、1%和1.5%,并由该组空白培养基作为对照。菌体接种量为1%。

使用生长曲线分析仪(oygrowthcurvesfp-1100-c,芬兰)测定细胞的生长状况。菌体积累在与仪器配套的孔板中进行,每孔加入200~400μl培养液进行实验。实验条件:检测od600和od494,温度37.0℃,转速150rpm,时间为6d。生长曲线结果如图4所示(其中,图4a为菌株以可溶性淀粉为碳源,分别以酵母提取物&酸水解酪蛋白、明胶为氮源时的细胞生长情况;图4b为菌株在以酵母提取物&酸水解酪蛋白为氮源,分别以可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖为碳源时的细胞生长情况)。

2)最适碳氮源比例实验(500ml摇瓶实验)

根据上述结果,菌株hrm-150在可溶性淀粉与酵母提取物&酸水解酪蛋白共同存在的培养基中能够出现菌体的大量生长。实验设计碳氮源分别以0.5%、1%、1.5%的添加量进行正交实验。实验以三水平不添加碳源的氮源组作为对照,其它实验条件不变。

菌体采用恒温摇床(hmy-211b,欧诺,中国)进行培养。实验条件:温度37.0℃,转速150rpm,培养12d。每隔1d取样一次,测定od600。并测定发酵实验终止时的菌体湿重。菌体始终测定结果如图5所示(其中,图5a为不添加碳源的情况下,不同氮源添加量对菌株生长的影响;图5b为氮源添加量为0.5%时,不同碳源添加量对菌株生长的影响;图5c为氮源添加量为1%时,不同碳源添加量对菌株生长的影响;图5d为氮源添加量为1.5%时,不同碳源添加量对菌株生长的影响)。

在不添加碳源的情况下,hrm-150菌体湿重随氮源添加比例的增加而增加,在改良cm培养基中(即17.5g/l),菌体湿重达到最高(4.15g/l)。当氮源添加比例为0.5%时,添加碳源促进菌体生长。当碳源添加量为1.5%时,菌体湿重达到最高(7.30g/l)。当氮源添加比例为1%时,添加碳源同样促进菌体生长,但三个水平的碳源对菌体生长的影响相差不大,添加1%碳源时菌体湿重达到最高(8.47g/l)。当氮源添加水平为1.5%时,添加1%碳源菌体湿重最高(8.81g/l)。

综上所述,在无碳源添加的组别,氮源添加水平的增加会增加菌体积累量;在同一氮源水平下添加碳源,菌体积累量会大幅度增加,且菌体积累量会随着添加碳源的比例增高而增加,1%氮源添加组除外,该组碳源添加水平对菌体积累量并无产生太大差异。考虑到成本的因素,选择1%氮源和1%碳源水平进行hrm-150菌体的大量培养。

3)发酵实验(5l全自动连续发酵罐)

利用上述实验获得最适碳氮比,即发酵培养基组成为:10g/l酵母提取物和7.5g/l酸水解酪蛋白,碳源选择可溶性淀粉10g/l。发酵控制条件:盐度150;起始转速200rpm,至对数生长期逐渐升高至400rpm;发酵至54h时补加可溶性淀粉10g/l,84h结束发酵。测定菌体湿重为20g/l。

采用高速冷冻离心机(h-2050r,湘仪,中国)8000rpm,10min,4℃进行菌体收集,收集后的菌体放入4℃备用。色素提取后进行硅胶柱层析分离(结果如图6所示),从hrm-150细胞中分离得到四种主要组分,分别命名为r1-r4。经分析鉴定,r1、r2、r3和r4组分分别为β-胡萝卜素、番茄红素、单脱水菌红素和菌红素,产量分别为7.46、10.82、7.45和5.36mg/l(如表1所示)。

表1为halorubrumhrm-150色素组分及含量。

抗氧化实验(如图7所示,其中,图7a为色素组分dpph自由基的清除率,图7b为色素组分还原力,图7c为色素组分总抗氧化力,图7d为色素组分螯合亚铁离子能力)表明,与其它色素组分相比,菌红素(r4)对自由自由基清除率最高,达到17.68%,高于阳性对照组合成β-胡萝卜素;单脱水菌红素(r3)和mix的自由基清除率基本与对照组β-胡萝卜素持平,其余两组分均比阳性对照组低;色素r1-r4还原力均比阳性对照组β-胡萝卜素的还原力高,还原力最强的组分为r4,为0.18;色素r4总抗氧化力最高达22.89%,其余组分的总抗氧化力相差不大,但均低于r4组分的总抗氧化力。色素r3和mix的螯合亚铁离子能力相对较高,其值分别为11.81%和11.35%,均高于阳性对照bha和bht组。

表1halorubrumhrm-150色素组分

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>天津科技大学

<120>盐红菌halorubrumsp.hrm-150及其发酵生产类胡萝卜素的方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1345

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gattcgacgttcgtggaacgcctcatccggacctcactcgggtgctttgacgggcggtgt60

gtgcaaggagcagggacgtattcaccgcgcgcttgtgacacgcgattactaccgaatcca120

gcttcatgtgggcgagttgcagcccacaatccgaactacgatcgagtttctgagattacc180

gtctcctttcggagttggaaccctttgtctcgaccattgtagcccgcgtgttgcccagca240

cattcggggcatactgacctaccgttgcccgttccttcctccgtgttagccacggcggtc300

cccctactgtccccagctacctcgcggtactgctggcaagtaagggtgcgggtctcgctc360

gttgcctgacttaacaggacgcctcacggtacgagctgacggcggccatgcacctcctct420

ctgaaactcggacaaggtcatcaacctggtcgtcattattacagtcgatgctggtgagat480

gtccggcgttgagtccaattaaaccgcaggctcctccggttgtagtgctcccccgccaat540

tcctttaagtttcatccttgcggacgtacttcccaggcggtctgcttagcggcttcccta600

cggcacagcacccactcgtagtgggagccacacctagcagacattgtttacggccaggac660

tacccgggtatctaatccggttcgagaccctggctttcgtccctcactgtcggatccgtc720

ctcgcgacgtgctttcgccatcggcggtccgtccaggattacgggatttcactcctaccc780

cggacgtacccgtcgcgccttccggtcccaagccacgcagtttctaccgggcgcccacct840

gttgggcaggtggatttcccgatggacttgcgcggccagctacggacgctttaggcccaa900

taagatcggccatcacttgggctgccggtattaccgcggcggctggcaccggtcttgccc960

agcccttattctggtaccaccttacggtaccgaaaagcacaggcgctatgcctgtgcact1020

tgggatccccctatcgcactgtcgtgcagtgtaaaggtttcgcgcctgctgcgccccgta1080

gggcccggaatcttgtctcagattccgtctctgggttctcactctcatgacccataccga1140

ttattggcacggtgggccgttaccccaccgtctacctaatcggccgcagccacatccttc1200

ggcgccggagcgtttggcataccactcattccagtggtggtatggtatacactattagcc1260

tcagtttcccgagggtattgtgttccgaagggtagtttggccacgtgttactgagctatt1320

cgccacgagtctgaactcgtgcgac1345

当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1