一种肿瘤细胞三维模型及其构建方法和应用与流程

本发明属于肿瘤细胞三维培养技术领域，尤其涉及一种肿瘤细胞三维模型及其构建方法和应用。

背景技术：

目前，基于二维细胞培养模型的药物检测仍然是肿瘤研究的主要方法。但是，此方法无法准确地模拟肿瘤细胞复杂的生长环境，因此采用二维细胞培养模型所进行的药物评价是不准确的，构建一个能够更准确模拟人体肿瘤生长环境且经济高效的模型替代二维细胞模型，对于药物开发和评价筛选至关重要。

要提高抗肿瘤药物评价的准确性与可靠性，就要改变传统的体外细胞培养的模型，根据目前的一些研究表明，三维体外细胞培养能够再现生理微环境并与体内的生理反应高度一致。构建肿瘤细胞三维模型需要特殊材料作为细胞支架以支持细胞生长，目前作为细胞支架的材料包括天然细胞外基质材料、合成生物材料、天然纯化分子材料等，这些材料有着良好的生物相容性和物理化学性质，能让细胞在其中保持生长活性。但是，上述作为细胞支架的材料存在成本昂贵的缺陷。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种肿瘤细胞三维模型及其构建方法和应用，用于解决采用现有材料作为细胞支架成本昂贵的问题。

本发明的具体技术方案如下：

一种肿瘤细胞三维模型的构建方法，包括以下步骤：

a)将肿瘤细胞和成纤维细胞配制成混合细胞悬浮液，在所述混合细胞悬浮液中加入海藻酸盐溶液，得到混合细胞-海藻酸盐溶液；

b)将所述混合细胞-海藻酸盐溶液滴于钙盐溶液中，得到混合细胞微球；

c)将所述混合细胞微球置于培养液中培养，得到肿瘤细胞三维模型。

优选的，所述混合细胞悬浮液中所述肿瘤细胞和所述成纤维细胞的数量比例为(2～3)：(1～2)。

优选的，所述肿瘤细胞在所述混合细胞悬浮液中的浓度为1*10⁵个/ml～5*10⁶个/ml；

所述成纤维细胞在所述混合细胞悬浮液中的浓度为1*10⁵个/ml～5*10⁶个/ml。

优选的，所述肿瘤细胞选自前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫肌瘤细胞或肝癌细胞。

优选的，所述海藻酸盐为海藻酸钠；

所述钙盐选自氯化钙或硫酸钙。

优选的，所述海藻酸盐溶液的质量体积比浓度为2％～4％；

所述混合细胞悬浮液与所述海藻酸盐溶液的质量比为(1～3)：(1～3)。

优选的，所述钙盐溶液的浓度为0.1～0.2mol/l。

优选的，所述混合细胞微球与所述培养液的体积比为(1～3)：(1～3)。

本发明还提供了上述技术方案所述构建方法得到的肿瘤细胞三维模型。

本发明还提供了上述技术方案所述肿瘤细胞三维模型在抗肿瘤药物筛选和/或评价中的应用。

综上所述，本发明提供了一种肿瘤细胞三维模型的构建方法，包括以下步骤：a)将肿瘤细胞和成纤维细胞配制成混合细胞悬浮液，在所述混合细胞悬浮液中加入海藻酸盐溶液，得到混合细胞-海藻酸盐溶液；b)将所述混合细胞-海藻酸盐溶液滴于钙盐溶液中，得到混合细胞微球；c)将所述混合细胞微球置于培养液中培养，得到肿瘤细胞三维模型。本发明中，在含有肿瘤细胞和成纤维细胞的混合细胞悬浮液中加入海藻酸盐溶液，得到混合细胞-海藻酸盐溶液，再将混合细胞-海藻酸盐溶液滴于钙盐溶液中得到混合细胞微球，本发明采用海藻酸盐与钙盐进行交联制备微球作为细胞支架，降低了肿瘤细胞进行三维培养的成本，海藻酸盐有着良好的生物相容性和非免疫原性，能够为细胞提供良好的三维生长环境，并且，本发明将肿瘤细胞与成纤维细胞三维共培养，能够更准确地模拟肿瘤细胞在体内的生存环境，使得构建的肿瘤细胞三维模型应用于抗肿瘤药物的筛选和/或评价更为准确、可靠，能够降低抗肿瘤药物研发的成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例中提供的一种肿瘤细胞三维模型中细胞在第4天、第8天、第10天和第12天的存活率。

具体实施方式

本发明提供了一种肿瘤细胞三维模型及其构建方法和应用，用于解决采用现有材料作为细胞支架成本昂贵的问题。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种肿瘤细胞三维模型的构建方法，包括以下步骤：

a)将肿瘤细胞和成纤维细胞配制成混合细胞悬浮液，在所述混合细胞悬浮液中加入海藻酸盐溶液，得到混合细胞-海藻酸盐溶液；

b)将所述混合细胞-海藻酸盐溶液滴于钙盐溶液中，得到混合细胞微球；

c)将所述混合细胞微球置于培养液中培养，得到肿瘤细胞三维模型。

本发明中，在含有肿瘤细胞和成纤维细胞的混合细胞悬浮液中加入海藻酸盐溶液，得到混合细胞-海藻酸盐溶液，再将混合细胞-海藻酸盐溶液滴于钙盐溶液中得到混合细胞微球，本发明采用海藻酸盐与钙盐进行交联制备微球作为细胞支架，降低了肿瘤细胞进行三维培养的成本，海藻酸盐有着良好的生物相容性和非免疫原性，海藻酸盐与钙盐交联得到的海藻酸钙水凝胶为疏水多孔的结构，便于细胞的附着与生长，以及营养物质的输送，能够为细胞提供良好的三维生长环境。并且，采用海藻酸盐与钙盐进行交联制备微球作为细胞支架，成本低，制作过程简单、容易操作。

在体内，肿瘤细胞与多种细胞共同生存，它们之间有着各种各样的相互作用，这也导致肿瘤细胞单独培养情况下的生理特性和在人体内生长有着较大的差异。本发明将肿瘤细胞与成纤维细胞三维共培养，构建的肿瘤细胞三维模型内具有复杂的细胞与细胞和细胞与基质相互作用的三维网络，能够更准确地模拟肿瘤细胞在体内的生存环境，使用该肿瘤细胞三维模型进行抗肿瘤药物的筛选和/或评价时，肿瘤细胞不仅与药物的渗透作用有关，并且成纤维细胞分泌因子的分布和功能也会影响肿瘤细胞的生长、分化和死亡，使得构建的肿瘤细胞三维模型应用于抗肿瘤药物的筛选和/或评价更为准确、可靠，能够降低抗肿瘤药物研发的成本。

本发明实施例中，混合细胞悬浮液中肿瘤细胞和成纤维细胞的数量比例为(2～3)：(1～2)，优选为2：1。

本发明实施例中，肿瘤细胞在混合细胞悬浮液中的浓度为1*10⁵个/ml～5*10⁶个/ml，优选为1*10⁶个/ml；

成纤维细胞在混合细胞悬浮液中的浓度为1*10⁵个/ml～5*10⁶个/ml，优选为5*10⁵个/ml。

本发明实施例中，肿瘤细胞选自前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫肌瘤细胞或肝癌细胞。

本发明实施例中，需要根据肿瘤在体内的生长环境、肿瘤的组成结构来选取与肿瘤细胞共培养的细胞，需要该细胞的生长、分裂周期与癌细胞相近，培养条件相似(可用同种培养基培养)。肿瘤细胞优选为前列腺癌细胞，前列腺癌细胞的生长、分裂周期与成纤维细胞的相差很小，细胞培养的条件相近，可用同种培养基培养。并且，前列腺癌细胞的生长速度快、对生长环境的要求不高，易于培养，适合短时间培养大量的细胞进行实验。

前列腺癌细胞选自pc3、lncap、du145、vcap或vlcop；成纤维细胞选自3t3、bmf、hpf、hff或bj。

本发明实施例中，海藻酸盐为海藻酸钠，海藻酸钠是一种提取于藻类植物的天然多糖，成本低、易于制作；

钙盐选自氯化钙或硫酸钙。

本发明实施例中，海藻酸盐溶液的质量浓度为2％～4％，优选为3.5％，实验结果表明细胞在海藻酸钠质量体积比浓度为3.5％的小球中，存活率更高、更稳定。

混合细胞悬浮液与海藻酸盐溶液的质量比为(1～3)：(1～3)，优选为1：1。

海藻酸盐的分子量优选为216.12303。

本发明实施例中，钙盐溶液的浓度为0.1～0.2mol/l，优选为0.1mol/l。

本发明实施例中，混合细胞微球与培养液的体积比为(1～3)：(1～3)，优选为1：3。

本发明实施例中，步骤a)之前，还包括：将肿瘤细胞和成纤维细胞分别进行平面培养。

步骤a)肿瘤细胞为第3代至第6代的肿瘤细胞，成纤维细胞为第3代至第6代的成纤维细胞。

本发明还提供了上述技术方案构建方法得到的肿瘤细胞三维模型。

本发明还提供了上述技术方案肿瘤细胞三维模型在抗肿瘤药物筛选和/或评价中的应用。

本发明肿瘤细胞三维模型使用操作简单、实验环境要求较低，减小了实验失误的可能性，并且应用于抗肿瘤药物的筛选和/或评价中准确、可靠，能够降低抗肿瘤药物研发的成本。

本发明肿瘤细胞三维模型可应用于新型抗癌药物的筛选与检测，由于细胞培养在海藻酸钙微球中，方便随时取出检测，以研究不同作用时间药物对肿瘤细胞的作用效果。本发明肿瘤细胞三维模型还可以搭配transwell、微流控等其它装置，再构建出新的更具仿生效果的肿瘤细胞模型。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1

本实施例进行肿瘤细胞三维模型的制备，包括以下步骤：

1)海藻酸钠溶液和氯化钙溶液的配制

称量海藻酸钠粉末加入到试剂瓶中并加入去离子水，然后放入磁力搅拌子，放在磁力搅拌器上进行12h～24h搅拌，配制得到质量浓度分别为3％、3.5％和4％的海藻酸钠溶液。

称量氯化钙粉末加入到试剂瓶中并加入去离子水，配制得到0.1mol/l的氯化钙溶液。

将海藻酸钠溶液和氯化钙溶液一起放入高温高压灭菌机里进行125℃灭菌15分钟，海藻酸钠溶液和氯化钙溶液配制完成。

2)前列腺癌细胞(pc3)和成纤维细胞(3t3)的平面培养

取出装有pc3细胞的冷冻管，水浴融化，离心，用含1％双抗、10％胎牛血清的低糖dmem培养液培养pc3细胞，每2天换一次液。待细胞铺满培养瓶底75％-80％时，用胰蛋白酶进行消化，在显微镜中观察pc3细胞至pc3细胞外形呈椭圆状，即将脱壁分离时，终止消化。取pc3细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养液重悬，配成细胞浓度为(1*10⁶个/ml)的pc3细胞悬浮液。

取出装有3t3细胞的冷冻管，水浴融化，离心，用含1％双抗、10％胎牛血清的低糖dmem培养液培养3t3细胞，每2天换一次液。待细胞铺满瓶底75％-80％时，用胰蛋白酶进行消化，在显微镜中观察3t3细胞至3t3细胞外形呈椭圆状，即将脱壁分离时，终止消化。取3t3细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养液重悬，得到3t3细胞悬浮液，3t3细胞悬浮液的细胞浓度与pc3细胞悬浮液的细胞浓度一致。

3)制备混合细胞微球

将pc3细胞悬浮液和3t3细胞悬浮液以1：1比例加入至离心管中，配置成总细胞浓度为1×10⁶/ml的混合细胞悬浮液，然后取三支离心管，往其中分别加入质量浓度分别为3％、3.5％和4％的海藻酸钠溶液，再以海藻酸钠溶液：混合细胞悬浮液比例1：1加入混合细胞悬浮液，然后用移液枪将溶液吹打均匀，得到混合细胞-海藻酸钠溶液1、混合细胞-海藻酸钠溶液2和混合细胞-海藻酸钠溶液3。

取培养皿，加入0.1mol/l的等量氯化钙溶液，使用注射器分别吸取混合细胞-海藻酸钠溶液1、混合细胞-海藻酸钠溶液2和混合细胞-海藻酸钠溶液3，将注射器针头悬空于培养皿中氯化钙液面以上，缓慢地以1滴/秒的速度滴出溶液，使混合细胞-海藻酸钠溶液1、混合细胞-海藻酸钠溶液2和混合细胞-海藻酸钠溶液3与氯化钙溶液分别交联形成混合细胞微球1、混合细胞微球2和混合细胞微球3，再将混合细胞微球1、混合细胞微球2和混合细胞微球3培养于新鲜的含1％双抗、10％胎牛血清的低糖dmem培养液中，得到肿瘤细胞三维模型1、肿瘤细胞三维模型2和肿瘤细胞三维模型3。其中，肿瘤细胞三维模型1、肿瘤细胞三维模型2和肿瘤细胞三维模型3均设5组平行试验。

将肿瘤细胞三维模型1、肿瘤细胞三维模型2和肿瘤细胞三维模型3分别在第0天、第4天、第8天、第10天和第12天进行细胞收集并测定细胞的存活率，以第0天细胞存活率为100％计。请参阅图1，为本发明实施例中提供的一种肿瘤细胞三维模型中细胞在第4天、第8天、第10天和第12天的存活率，结果表明，采用质量浓度为3.5％的海藻酸钠构建的肿瘤细胞三维模型的细胞存活率最高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。