一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,mscs)始源于中胚层，具有多向分化潜能，在各类组织和器官中分布较为广泛。由于mscs较好的分化和自我更新潜能，在组织修复再生领域的研究中被用作主要的种子细胞之一。近些年，干细胞的临床价值举世瞩目，其中人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，huc-mscs)因其来源较广泛、易采集、伦理争议较少、体外扩增能力强、分化潜能高、低致瘤性、免疫原性低等优点，在临床上具有非常广阔的应用。

现阶段，mscs细胞疗法在神经退行性疾病、心脑血管疾病、糖尿病、脊髓损伤、心脏病等慢性病的治疗中取得了阶段性进展。huc-mscs的制备培养方法是romanov等人于2003年首次从剥离的华通氏胶中获得而建立。目前，huc-mscs的制备分离方法主要为组织块贴壁法，此方法虽然具有生产成本低的优势，但是也存在细胞培养周期长，不适于大规模临床研究及应用需求的缺点。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，此方法采用酶消化法制备细胞，大大缩短了细胞培养周期，可以快速获得大量纯度较高、状态良好的间充质干细胞，进而为组织修复和再生医学领域提供理想的种子细胞。

一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，包括以下步骤：

(1)样本采集接收及细胞分离：

(1.1)采集新生胎儿脐带和母血：采集新生胎儿脐带，在距脐带两末端约2-3cm处结扎，然后将采集的所述新生胎儿脐带置于含有两性霉素b和庆大霉素储运液的脐带瓶中，连同母血一并放入4-25℃的保温箱中保存；

(1.2)将采集的所述新生胎儿脐带在22h内运达实验室；

(1.3)规范接收、登记，并签署知情同意书，对母血进行hbv、hcv、cmv、tp、hiv及alt检测；

(1.4)用pbs反复冲洗所述新生胎儿脐带，去除外表皮血丝，洗出静脉中的残血；

(1.5)将所述新生胎儿脐带的一端固定在解剖台上，在距离固定处1cm处用解剖刀划一条深浅适度的环形口，用解剖镊撕掉脐带的外表皮，获得华通氏胶，并剥下所述新生胎儿脐带中两条动脉的外膜；

(1.6)在经过步骤(1.5)处理后的新生胎儿脐带中加入消化酶溶液进行消化反应，反应完成后加入完全培养基终止消化，获得细胞悬液；

(1.7)将所述细胞悬液过100目筛网，再过200目筛网，之后1700rpm，离心7min，弃上清，沉淀加入完全培养基悬浮；

(2)原代细胞培养：将细胞接种于装有原代细胞培养液的培养皿中，于37℃，5％co2培养箱中培养，获得原代细胞；所述原代细胞培养液由基础培养基和添加物组成，所述基础培养基为dmem/f12，所述添加物为：ultroserg血清替代物6-8％(v/v)、维生素80-100μg/ml、干细胞生长因子30-80ng/ml、氨基酸5-15mmol/ml、微量元素100-200mmol/l；

(3)传代培养：待原代细胞的融合度达到80％以上时，将原代细胞接种于装有传代细胞培养液的培养皿中，于37℃，5％co2培养箱中培养，获得传代细胞；

(4)细胞检测：待传代细胞的融合度达到80％以上时，可以继续传代培养；之后选取生长良好的第三代细胞经抗体孵育洗涤后进行细胞活性检测、活细胞计数及细胞流式检测。

作为一种优选的方案，步骤(1.6)中所述消化酶溶液含1-2mg/ml胶原酶、4-6μg/ml透明质酸酶，消化过程为加入消化酶37℃消化，并每隔10min震荡1次，消化2h后，加入完全培养基终止消化，获得消化液；且所述消化酶溶液的配制方法是：先将60mg所述胶原酶ⅰ用60ml的pbs溶解获得混合液，然后取40ml所述混合液加入200μl透明质酸酶，之后用0.22μm滤器过滤，获得所述消化酶溶液。

更为优选的是，步骤(1.6)可以采用1-2mg/ml胶原酶和4-6μg/ml透明质酸酶的混合液1，37℃消化60min，之后0.25％胰酶和0.1％dnasei混合液2，37℃消化20min的方式，获得细胞悬液。

更为优选的是，步骤(1.6)可以采用1-2mg/ml胶原酶37℃消化1.5h，之后0.25％胰酶37℃消化30min的方式，获得细胞悬液。

更为优选的是，步骤(1.6)所述消化酶溶液中的胶原酶可以是胶原酶ⅰ、胶原酶ⅱ和胶原酶ⅳ。

更为优选的是，步骤(2)中所述维生素包括维生素c、维生素b2、维生素b12、维生素d，所述干细胞生长因子包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子，所述氨基酸包括谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸，所述微量元素包括钙离子和镁离子。

更为优选的是，步骤(4)中所述流式检测所使用的标记抗体分别是cd34-pe、cd44-fitc、cd45-fitc、cd105-pe。

更为优选的是，所述培养方法制备的干细胞具有良好的成脂、成骨分化潜能。

本发明的有益效果在于：本发明的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法具有以下优势：

①本发明的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，大大缩短了细胞培养周期，快速获得了大量纯度较高、状态良好的间充质干细胞。

②本发明的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法除分离了华通胶外，还剥离了两条动脉的外膜，获得的huc-mscs生长状态良好。

③本发明的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法获得的p1代细胞数可达3～12.5×10⁷，流式检测表面抗体cd44⁺cd105⁺可达(99.6±0.2)％，且具有良好的成脂成骨分化能力。

附图说明

图1是本发明实施例中人脐带间充质干细胞原代细胞培养效果图(×40)；

图2是本发明实施例中人脐带间充质干细胞第三代细胞培养效果图(×400)；

图3本发明实施例中人脐带间充质干细胞第三代细胞经抗体孵育洗涤后的流式细胞检测结果；

图4发明实施例中人脐带间充质干细胞成脂诱导分化鉴定结果图(×400)；

图5发明实施例中人脐带间充质干细胞成骨诱导分化鉴定结果图(×400)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，所述培养方法包括以下步骤：

(1)样本采集接收及细胞分离培养：

(1.1)采集新生胎儿脐带和母血：采集新生胎儿脐带，在距脐带两末端约2-3cm处结扎，然后将采集的所述新生胎儿脐带置于含有两性霉素b和庆大霉素储运液的脐带瓶中，连同母血一并放入4-25℃的保温箱中保存；

(1.2)将采集的所述新生胎儿脐带在22h内运达实验室；

(1.3)规范接收、登记，并签署知情同意书，对母血进行hbv、hcv、cmv、tp、hiv及alt检测；

(1.4)消化酶配制：将60mg胶原酶用60ml的pbs溶解获得混合液，然后取40ml所述混合液加入200μl透明质酸酶，之后用0.22μm滤器过滤，获得消化酶溶液，备用；

(1.5)用pbs反复冲洗所述新生胎儿脐带，去除外表皮血丝，洗出静脉中的残血；

(1.6)将所述新生胎儿脐带的一端固定在解剖台上，在距离固定处1cm处用解剖刀划一条深浅适度的环形口，用解剖镊撕掉脐带的外表皮，获得华通氏胶，并剥下所述新生胎儿脐带中两条动脉的外膜；

(1.7)在经过步骤(1.6)处理后的新生胎儿脐带中加入消化酶溶液，37℃消化，并每隔10min震荡1次，消化2h后，加入完全培养基终止消化，获得细胞悬液；

(1.8)将所述细胞悬液过100目筛网，再过200目筛网，之后1700rpm，离心7min，弃上清，沉淀加入完全培养基悬浮；

(2)细胞培养：将细胞接种于装有原代细胞培养液的培养皿中，于37℃，5％co2培养箱中培养，获得原代细胞，具体培养结果见图1；所述原代细胞培养液由基础培养基和添加物组成，所述基础培养基为dmem/f12，所述添加物为：ultroserg血清替代物8％(v/v)、维生素80μg/ml、干细胞生长因子60ng/ml、氨基酸12mmol/ml、微量元素130mmol/l；

(3)传代培养：待原代细胞的融合度达到80％以上时，吸弃原代细胞培养液，用生理盐水清洗细胞表面2次，每皿加0.25％胰酶1ml，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min或室温孵育3min；待细胞变圆后每皿加完全培养基终止消化，快速震荡，反复吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支15ml离心管中，每皿加适量生理盐水，吹洗一次，汇入15ml离心管中；1200rpm，离心6min，弃上清，沉淀用传代细胞培养液重悬，经细胞筛过滤，计数，使细胞密度为1-2×10⁴/ml左右，置37℃、5％co2培养箱中进行传代培养，获得传代细胞；所述传代细胞培养液由原代细胞培养液和传代添加物组成，所述传代添加物为：丝氨酸20-30μg/ml、甘氨酸20-40μg/ml、生物素3-5mmol/ml、叶酸2-5mmol/ml、吡多醇2-3mmol/ml、硫胺素1-2mmol/ml、b族维生素3-5mmol/ml；

(4)细胞检测：待传代细胞的融合度达到80％以上时，可以继续传代培养；之后选取生长良好的第三代细胞(具体培养结果见图2)经抗体孵育洗涤后进行细胞活性检测、活细胞计数及细胞流式检测，具体为：

(4.1)细胞活性及计数：利用countstar细胞计数仪进行细胞总数测定；利用血球计数板检测细胞活性，死细胞个数计为n，细胞活性＝[100-10n/c]×100％；

(4.2)细胞流式检测：细胞表面抗体检测包括cd34-pe、cd44-fitc、cd45-fitc、cd105-pe，收集生长状态良好的第3代huc-mscs，1500rpm，离心5min后弃掉上清液，调整细胞浓度至4×10⁶/ml；之后分别标记igg-fitc/igg-pe(同型对照)、cd44-fitc/cd34-pe、cd45-fitc/cd105-pe，3支流式上样管，每管加入5～10μl荧光抗体及100μl待测细胞悬液，充分振荡均匀后，避光孵育20min，之后每管加2ml生理盐水，离心洗涤，1200rpm离心5min，弃上清，重复上述操作1次。每管加2mlpbs，1500rpm离心5min，弃上清，加500μlpbs，混匀后上机检测。流式检测结果：cd44+、cd105+均高于95％，cd34+、cd45+均低于2％，具体结果见图3。

(4.3)huc-mscs成脂、成骨诱导分化

参照gibcoadipogenesis/osteogenesisdifferentiationkit(gibco，美国)操作步骤进行成脂、成骨诱导，21d后分别用油红o、茜素红染色后观察，可见细胞周围出现大而圆的脂滴以及矿化钙结节的形成并沉积。结果表明hp-mscs具有良好的成脂、成骨分化潜能，符合mscs的特征，具体结果见图4。

本发明的huc-mscs分离和培养方法操作简单、耗时短、成本低，获得的细胞纯度高，活性强，且具有良好的成脂成骨分化能力，为临床研究及应用提供了大量的种子细胞。

应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。