一种细胞添加剂及其制备方法与流程

本发明涉及2型糖尿病体外细胞研究领域，具体涉及一种细胞添加剂及其制备方法。

背景技术：

2型糖尿病是一种以糖脂代谢异常为主要表现的慢性代谢性疾病。在2型糖尿病的致病因素中，高血糖通过引起代谢紊乱直接影响细胞的代谢，高血脂引起的高浓度的游离脂肪酸可直接诱发细胞损伤。高血脂对内皮细胞、神经细胞、心肌细胞、肾小管上皮细胞等多种细胞均有不同程度的损伤，是导致2型糖尿病并发症发生发展的主要致病因素之一。

在体外研究中，为了模拟2型糖尿病所致的器官损伤，除在细胞培养基中添加高浓度的葡萄糖外，通常需要添加高浓度的软脂酸（棕榈酸，palmiticacid），这是因为软脂酸是存在于动物、植物及微生物中最常见的游离脂肪酸。正常情况下，人体血液中软脂酸的浓度均值约为100umol/l，肥胖和2型糖尿病情况下血液中软脂酸浓度显著增高。软脂酸钠（棕榈酸钠，sodiumpalmitate）是软脂酸的钠盐，同等摩尔浓度的软质酸钠具有与软脂酸相同的细胞脂毒性。因此，软脂酸和软脂酸钠被认为是模拟细胞脂毒性的理想试剂。

然而，由于配制方法不当，市场上也无可直接使用的软脂酸或软脂酸钠细胞添加剂，导致很多从事2型糖尿病的科研工作者无法顺利开展体外细胞实验。现有技术中，有人采用甲醇、乙醇、氢氧化钠溶液等溶剂配制软脂酸或软脂酸钠，其缺点是这些溶剂本身对细胞就有毒性，而且这些溶剂是否影响软脂酸或软脂酸钠本身的性质也不清楚。

近年来，有人利用牛血清白蛋白（bsa）可与软脂酸、或软脂酸钠结合的特点，采用高浓度的bsa溶液配制软脂酸、或软脂酸钠。上述方法的优点是溶剂本身对细胞无毒性，但仍存在以下问题：

1.对bsa未进行甄选，导致其结合力不足；

2.未掌握溶解软脂酸或软脂酸钠的合适条件，不能充分溶解软脂酸或软脂酸钠；

3.配制的bsa-软脂酸、或bsa-软脂酸钠溶液很快有固体析出，不能有效发挥脂毒性。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种细胞添加剂及其制备方法，该方法能够克服现有软脂酸组分溶液配制过程中溶剂毒性、bsa结合力不足、软脂酸组分难溶解等技术问题，具有简单易操作、稳定性好等优点，配置出的细胞添加剂能够成功诱导2型糖尿病心肌细胞和内皮细胞损伤。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种细胞添加剂，其特征在于，包括bsa组分和软脂酸组分。

进一步的，所述bsa组分的溶液浓度为5-20g/100ml，所述软脂酸组分的溶液浓度为2-20mmol/l。

进一步的，所述bsa组分包括脱脂bsa、无脂bsa、或低脂bsa。

进一步的，所述软脂酸组分包括软脂酸、或软脂酸钠。

本发明的一种细胞添加剂具有以下有益效果：

该细胞添加剂不存在软脂酸、或软脂酸钠固体析出的问题，能够避免溶剂的直接细胞毒性，实现对脂毒性的精确定量。

一种细胞添加剂的制备方法，其特征在于：

a1）将高温溶解的软脂酸组分溶液与bsa组分溶液混合；

a2）将混合后的软脂酸组分溶液和bsa组分溶液充分振荡，直至软脂酸组分溶液与bsa组分溶液充分结合，得混合溶液；

a3）将充分结合的混合溶液置于低温下冷却，将冷却后的混合溶液进行过滤、除菌，得细胞添加剂。

进一步的，所述将高温溶解的软脂酸组分溶液与bsa组分溶液混合包括：将浓度为2-20mmol/l的高温溶解的软脂酸组分溶液与浓度为5-20g/100ml的bsa组分溶液混合。

进一步的，所述高温溶解的软脂酸组分溶液的配置方法包括如下步骤：将所述软脂酸组分倒入溶剂中，并置于70-100℃的温度下加热溶解，待软脂酸组分溶解于溶剂后，得高温溶解的软脂酸组分溶液。

进一步的，所述bsa组分溶液的配置方法包括如下步骤：将所述bsa组分倒入溶剂中，待bsa组分溶解于溶剂后，得bsa组分溶液。

进一步的，所述溶剂包括水、生理盐水、缓冲溶液、或细胞培养基。

进一步的，所述缓冲溶液和细胞培养基的ph数值为7.2~7.5。

本发明的一种细胞添加剂制备方法具有以下有益效果：

1)目前，溶解软脂酸或软脂酸钠的溶剂包括甲醇、乙醇、氢氧化钠溶液和bsa溶液。其中，甲醇、乙醇、氢氧化钠溶液等溶剂本身对细胞就有毒性，而且这些溶剂是否影响软脂酸（软脂酸钠）本身的性质也不清楚。该方法采用bsa组分溶液作为溶剂，不仅保证了对软脂酸组分溶液的有效溶解，而且避免了溶剂的直接细胞毒性。

2)由于未脱脂bsa组分本身结合了一定量的脂肪酸，不仅导致其与软脂酸或软脂酸钠的结合能力下降，而且会导致脂肪酸的浓度无法精确定量。该方法提出的bsa组分采用脱脂bsa、无脂bsa、或低脂bsa，不仅增强bsa组分与软脂酸或软脂酸钠的结合能力，而且增加了对脂毒性的精确定量。

3)采用bsa组分溶液与高温软脂酸组分溶液相结合的技术方案，不仅解决了软脂酸或软脂酸钠的溶解问题，而且也解决了bsa-软脂酸、bsa-软脂酸钠固体析出的问题。因为在高温环境下，软脂酸或软脂酸钠可溶于水、生理盐水、缓冲溶液、或细胞培养基等溶剂，但当温度下降至70℃以下时，软脂酸或软脂酸钠将迅速从上述溶剂中析出，因此温度的把控极为重要。

附图说明

图1为本发明的一种高脂细胞添加剂的制备方法的流程示意图；

图2为实施例1中流式细胞仪采集到的所有颗粒的实验结果图；

图3为实施例1中给予h9c2心肌细胞的空白对照的流式细胞术实验结果图；

图4为实施例1中给予h9c2心肌细胞0.2%的bsa的流式细胞术实验结果图；

图5为实施例1中给予h9c2心肌细胞100µm的细胞添加剂的流式细胞术实验结果图；

图6为实施例1中给予h9c2心肌细胞200µm的细胞添加剂的流式细胞术实验结果图；

图7为实施例1中给予h9c2心肌细胞300µm的细胞添加剂的流式细胞术实验结果图；

图8为实施例1中给予h9c2心肌细胞400µm的细胞添加剂的流式细胞术实验结果图；

图9为实施例1中空白对照、0.2%bsa、100-400µm细胞添加剂诱导的细胞凋亡率的统计结果对照图；

图10为实施例2中cleavedcaspase-3，caspase-3和β-actin的westernblotting实验结果图；

图11为实施例2中cleavedcaspase-3/β-actin比值的统计结果对照图；

图12为实施例3中给予h9c2心肌细胞0.8%的bsa的流式细胞术实验结果图；

图13为实施例3中给予h9c2心肌细胞400µm的细胞添加剂的流式细胞术实验结果图；

图14为实施例3中0.8%bsa、400µm细胞添加剂诱导的细胞凋亡率的统计结果对照图；

图15为实施例4中给予h9c2心肌细胞0.4%的bsa的流式细胞术实验结果图；

图16为实施例4中给予h9c2心肌细胞400µm的细胞添加剂的流式细胞术实验结果图；

图17为实施例4中0.4%bsa、400µm细胞添加剂诱导的细胞凋亡率的统计结果对照图；

图18为实施例5中给予h9c2心肌细胞0.4%的bsa的流式细胞术实验结果图；

图19为实施例5中给予h9c2心肌细胞400µm的细胞添加剂的流式细胞术实验结果图；

图20为实施例5中0.4%bsa、400µm细胞添加剂诱导的细胞凋亡率的统计结果对照图；

图21为实施例6中给予h9c2心肌细胞1.0%的bsa的流式细胞术实验结果图；

图22为实施例6中给予h9c2心肌细胞400µm的细胞添加剂的流式细胞术实验结果图；

图23为实施例6中1.0%bsa、400µm细胞添加剂诱导的细胞凋亡率的统计结果对照图。

具体实施方式

本发明可能以不同的形式来实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。

实施例一

一种细胞添加剂，包括浓度为5-20g/100ml的bsa组分和浓度为2-20mmol/l的软脂酸组分。

本实施例中，bsa组分的溶液浓度采用10g/100ml，软脂酸组分的溶液浓度采用5mmol/l。其中，本实施例中bsa组分包括脱脂bsa，软脂酸组分包括软脂酸。

需要说明的是，采用上述浓度是为了满足体外细胞实验中模拟2型糖尿病的软脂酸的工作浓度，软脂酸的工作浓度通常为200-400umol/l。

本实施例中的细胞添加剂的制备方法，具体包括如下步骤：

a1）将浓度为5mmol/l的高温溶解的软脂酸溶液与浓度为10g/100ml的脱脂bsa溶液混合；

实际操作时，使用移液器迅速将高温溶解的软脂酸溶液转移至脱脂bsa溶液中，使用移液器快速转移，每次转移过程应控制在15s内。

具体的，配置上述高温溶解的软脂酸溶液包括如下步骤：将所述软脂酸倒入溶剂中，并置于100℃的温度下加热溶解，待软脂酸全部溶解于溶剂后，得高温溶解的软脂酸溶液。

具体的，配置上述脱脂bsa溶液包括如下步骤：将所述脱脂bsa倒入溶剂中，待脱脂bsa充分溶解于溶剂后，得脱脂bsa溶液。

需要说明的是，上述溶剂包括ph数值为7.3的磷酸盐缓冲溶液。

a2）将混合后的软脂酸溶液和脱脂bsa溶液充分振荡，使软脂酸溶液与脱脂bsa溶液充分结合，得混合溶液；

实际操作时，使用涡旋振荡器、翻转振荡器或搅拌装置将混合后的软脂酸溶液和脱脂bsa溶液充分振荡，振荡时间一般为10-30s。

a3）将充分结合的混合溶液置于低温下冷却，将冷却后的混合溶液进行过滤、除菌，得细胞添加剂。

实际操作时，待上述混合液冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得终浓度为2-20mmol/l的软脂酸细胞添加剂，将该细胞添加剂至于-25~8℃的低温环境下保存。

以下通过实验数据验证本发明提出的细胞添加剂对h9c2心肌细胞系的损伤作用：

分别给予h9c2心肌细胞100、200、300、400µm的细胞添加剂、单纯0.2%的bsa或空白对照，24小时后，进行annexinv-fitc、碘化丙啶（propidiumiodide,pi）双染后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡（fitc阴性、pi阳性），图2~图9展示了细胞添加剂诱导h9c2心肌细胞系发生凋亡的数据。

其中，图2为实施例1中流式细胞仪采集到的所有颗粒的实验数据图，图中r1框选中的是h9c2心肌细胞；图3-图8分别为流式细胞术结果，其中右下象限中的细胞是发生凋亡的细胞；图9为细胞凋亡的统计结果，每组包括3个有效数据。图中，fl1-a.fitc为通道荧光值；fl3-a.pi为通道荧光值；control.为空白对照；bsa0.2.为0.2%牛血清白蛋白；hl100-400.为含100-400µm软脂酸的细胞添加剂。

与图3中空白对照（control）相比，图4单纯0.2%的bsa对细胞凋亡水平无影响（p>0.05），图5中100µm的细胞添加剂（hl100）对细胞凋亡水平也无影响（p>0.05）。然而，图6-图8中200-400µm的细胞添加剂（hl200、hl300、hl400）剂量依赖性增加细胞凋亡水平。该研究证明200-400µm的细胞添加剂成功诱导了心肌细胞发生凋亡。

本实施提供一种细胞添加剂及其制备方法，该方法能够克服现有软脂酸组分溶液配制过程中溶剂毒性、bsa结合力不足、软脂酸组分难溶解等技术问题，具有简单易操作、稳定性好等优点，配置出的细胞添加剂能够成功诱导2型糖尿病心肌细胞和内皮细胞损伤。

实施例二

一种细胞添加剂，包括浓度为5-20g/100ml的bsa组分和浓度为2-20mmol/l的软脂酸组分。

本实施例中，bsa组分的溶液浓度采用10g/100ml，软脂酸组分的溶液浓度采用5mmol/l。其中，本实施例中bsa组分包括无脂bsa，软脂酸组分包括软脂酸钠。

需要说明的是，采用上述浓度是为了满足体外细胞实验中模拟2型糖尿病的软脂酸的工作浓度，软脂酸的工作浓度通常为200-400umol/l。

本实施例中的细胞添加剂的制备方法，具体包括如下步骤：

a1）将浓度为5mmol/l的高温溶解的软脂酸钠溶液与浓度为10g/100ml的无脂bsa溶液混合；

实际操作时，使用移液器迅速将高温溶解的软脂酸钠溶液转移至无脂bsa溶液混合中，使用移液器快速转移，每次转移过程应控制在15s内。

具体的，配置上述高温溶解的软脂酸钠溶液包括如下步骤：将所述软脂酸钠倒入溶剂中，并置于95℃的温度下加热溶解，待软脂酸钠全部溶解于溶剂后，得高温溶解的软脂酸钠溶液。

具体的，配置上述无脂bsa溶液包括如下步骤：将所述无脂bsa倒入溶剂中，待无脂bsa充分溶解于溶剂后，得无脂bsa溶液。

需要说明的是，上述溶剂包括ph数值为7.3的磷酸盐缓冲液。

a2）将混合后的软脂酸钠溶液和无脂bsa溶液充分振荡，使软脂酸钠溶液与无脂bsa溶液充分结合，得混合溶液；

实际操作时，使用涡旋振荡器、翻转振荡器或搅拌装置将混合后的软脂酸钠溶液和无脂bsa溶液充分振荡，振荡时间一般为10-30s。

a3）将充分结合的混合溶液置于低温下冷却，将冷却后的混合溶液进行过滤、除菌，得细胞添加剂。

实际操作时，待上述混合液冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得终浓度为2-20mmol/l的软脂酸钠细胞添加剂，将该细胞添加剂至于-25~8℃的低温环境下保存。

以下通过实验数据验证本发明提出的细胞添加剂对小鼠主动脉内皮细胞系的损伤作用。

分别给予小鼠主动脉内皮细胞100、200、300、400µm的细胞添加剂、单纯0.2%的bsa或空白对照，48小时后，采用westernblotting法检测cleavedcaspase-3的蛋白水平。结果显示如图10和图11所示，与空白对照（control）相比，单纯0.2%的bsa和100µm的细胞添加剂（hl100）对cleavedcaspase-3蛋白水平均无影响（p>0.05）。然而，200-400µm的细胞添加剂（hl200、hl300、hl400）显著增加cleavedcaspase-3的蛋白水平。该研究证明200-400µm的细胞添加剂成功诱导了内皮细胞发生凋亡。

图中，β-actin是参照蛋白；control.为空白对照；bsa0.2.为0.2%牛血清白蛋白；hl100-400.为含100-400µm软脂酸钠的细胞添加剂。

本实施提供一种细胞添加剂及其制备方法，该方法能够克服现有软脂酸钠组分溶液配制过程中溶剂毒性、bsa结合力不足、软脂酸钠组分难溶解等技术问题，具有简单易操作、稳定性好等优点，配置出的细胞添加剂能够成功诱导2型糖尿病心肌细胞和内皮细胞损伤。

实施例三

一种细胞添加剂，包括浓度为5-20g/100ml的bsa组分和浓度为2-20mmol/l的软脂酸组分。

本实施例中，bsa组分的溶液浓度采用20g/100ml，软脂酸组分的溶液浓度采用10mmol/l。其中，本实施例中bsa组分包括无脂bsa，软脂酸组分包括软脂酸钠。

需要说明的是，采用上述浓度是为了满足体外细胞实验中模拟2型糖尿病的软脂酸的工作浓度，软脂酸的工作浓度通常为200-400umol/l。

本实施例中的细胞添加剂的制备方法，具体包括如下步骤：

a1）将浓度为10mmol/l的高温溶解的软脂酸钠溶液与浓度为20g/100ml的无脂bsa溶液混合；

实际操作时，使用移液器迅速将高温溶解的软脂酸钠溶液转移至无脂bsa溶液混合中，使用移液器快速转移，每次转移过程应控制在15s内。

具体的，配置上述高温溶解的软脂酸钠溶液包括如下步骤：将所述软脂酸钠倒入溶剂中，并置于90℃的温度下加热溶解，待软脂酸钠全部溶解于溶剂后，得高温溶解的软脂酸钠溶液。

具体的，配置上述无脂bsa溶液包括如下步骤：将所述无脂bsa倒入溶剂中，待无脂bsa充分溶解于溶剂后，得无脂bsa溶液。

需要说明的是，上述溶剂包括dmem培养基。

a2）将混合后的软脂酸钠溶液和无脂bsa溶液充分振荡，使软脂酸钠溶液与无脂bsa溶液充分结合，得混合溶液；

实际操作时，使用涡旋振荡器、翻转振荡器或搅拌装置将混合后的软脂酸钠溶液和无脂bsa溶液充分振荡，振荡时间一般为10-30s。

a3）将充分结合的混合溶液置于低温下冷却，将冷却后的混合溶液进行过滤、除菌，得细胞添加剂。

实际操作时，待上述混合液冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得终浓度为2-20mmol/l的软脂酸钠细胞添加剂，将该细胞添加剂至于-25~8℃的低温环境下保存。

以下通过实验数据验证本发明提出的细胞添加剂对h9c2心肌细胞系的损伤作用：

分别给予h9c2心肌细胞400µm的细胞添加剂、单纯0.8%的bsa对照，24小时后，进行annexinv-fitc、碘化丙啶（propidiumiodide,pi）双染后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡（fitc阴性、pi阳性），图12~图14展示了细胞添加剂诱导h9c2心肌细胞系发生凋亡的数据。

其中，图12和图13分别为实施例3中流式细胞术结果，其中右下象限中的细胞是发生凋亡的细胞；图14为细胞凋亡的统计结果，每组包括3个有效数据。图中，fl1-a.fitc为通道荧光值；fl3-a.pi为通道荧光值；bsa0.8.为0.8%牛血清白蛋白；hl400.为含400µm软脂酸钠的细胞添加剂。

与图12中单纯0.8%的bsa相比，图13中400µm的细胞添加剂（hl400）显著增加细胞凋亡水平。该研究证明实施例3中400µm的细胞添加剂成功诱导了心肌细胞发生凋亡。

本实施提供一种细胞添加剂及其制备方法，该方法能够克服现有软脂酸钠组分溶液配制过程中溶剂毒性、bsa结合力不足、软脂酸钠组分难溶解等技术问题，具有简单易操作、稳定性好等优点，配置出的细胞添加剂能够成功诱导2型糖尿病心肌细胞和内皮细胞损伤。

实施例四

一种细胞添加剂，包括浓度为5-20g/100ml的bsa组分和浓度为2-20mmol/l的软脂酸钠组分。

本实施例中，bsa组分的溶液浓度采用20g/100ml，软脂酸钠组分的溶液浓度采用20mmol/l。其中，本实施例中bsa组分包括无脂bsa，软脂酸钠组分包括软脂酸钠。

需要说明的是，采用上述浓度是为了满足体外细胞实验中模拟2型糖尿病的软脂酸钠的工作浓度，软脂酸钠的工作浓度通常为200-400umol/l。

本实施例中的细胞添加剂的制备方法，具体包括如下步骤：

a1）将浓度为20mmol/l的高温溶解的软脂酸钠溶液与浓度为20g/100ml的无脂bsa溶液混合；

实际操作时，使用移液器迅速将高温溶解的软脂酸钠溶液转移至无脂bsa溶液混合中，使用移液器快速转移，每次转移过程应控制在15s内。

具体的，配置上述高温溶解的软脂酸钠溶液包括如下步骤：将所述软脂酸钠倒入溶剂中，并置于85℃的温度下加热溶解，待软脂酸钠全部溶解于溶剂后，得高温溶解的软脂酸钠溶液。

具体的，配置上述无脂bsa溶液包括如下步骤：将所述无脂bsa倒入溶剂中，待无脂bsa充分溶解于溶剂后，得无脂bsa溶液。

需要说明的是，上述溶剂包括双蒸水。

a2）将混合后的软脂酸钠溶液和无脂bsa溶液充分振荡，使软脂酸钠溶液与无脂bsa溶液充分结合，得混合溶液；

实际操作时，使用涡旋振荡器、翻转振荡器或搅拌装置将混合后的软脂酸钠溶液和无脂bsa溶液充分振荡，振荡时间一般为10-30s。

a3）将充分结合的混合溶液置于低温下冷却，将冷却后的混合溶液进行过滤、除菌，得细胞添加剂。

实际操作时，待上述混合液冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得终浓度为2-20mmol/l的软脂酸钠细胞添加剂，将该细胞添加剂至于-25~8℃的低温环境下保存。

以下通过实验数据验证本发明提出的细胞添加剂对h9c2心肌细胞系的损伤作用：

分别给予h9c2心肌细胞400µm的细胞添加剂、单纯0.4%的bsa对照，24小时后，进行annexinv-fitc、碘化丙啶（propidiumiodide,pi）双染后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡（fitc阴性、pi阳性），图15~图17展示了细胞添加剂诱导h9c2心肌细胞系发生凋亡的数据。

其中，图15和图16分别为实施例4中流式细胞术结果，其中右下象限中的细胞是发生凋亡的细胞；图17为细胞凋亡的统计结果，每组包括3个有效数据。图中，fl1-a.fitc为通道荧光值；fl3-a.pi为通道荧光值；bsa0.4.为0.4%牛血清白蛋白；hl400.为含400µm软脂酸钠的细胞添加剂。

与图15中单纯0.4%的bsa相比，图16中400µm的细胞添加剂（hl400）显著增加细胞凋亡水平。该研究证明实施例4中400µm的细胞添加剂成功诱导了心肌细胞发生凋亡。

本实施提供一种细胞添加剂及其制备方法，该方法能够克服现有软脂酸钠组分溶液配制过程中溶剂毒性、bsa结合力不足、软脂酸钠组分难溶解等技术问题，具有简单易操作、稳定性好等优点，配置出的细胞添加剂能够成功诱导2型糖尿病心肌细胞和内皮细胞损伤。

实施例五

一种细胞添加剂，包括浓度为5-20g/100ml的bsa组分和浓度为2-20mmol/l的软脂酸钠组分。

本实施例中，bsa组分的溶液浓度采用5g/100ml，软脂酸钠组分的溶液浓度采用5mmol/l。其中，本实施例中bsa组分包括无脂bsa，软脂酸钠组分包括软脂酸钠。

需要说明的是，采用上述浓度是为了满足体外细胞实验中模拟2型糖尿病的软脂酸钠的工作浓度，软脂酸钠的工作浓度通常为200-400umol/l。

本实施例中的细胞添加剂的制备方法，具体包括如下步骤：

a1）将浓度为5mmol/l的高温溶解的软脂酸钠溶液与浓度为5g/100ml的无脂bsa溶液混合；

实际操作时，使用移液器迅速将高温溶解的软脂酸钠溶液转移至无脂bsa溶液混合中，使用移液器快速转移，每次转移过程应控制在15s内。

具体的，配置上述高温溶解的软脂酸钠溶液包括如下步骤：将所述软脂酸钠倒入溶剂中，并置于80℃的温度下加热溶解，待软脂酸钠全部溶解于溶剂后，得高温溶解的软脂酸钠溶液。

具体的，配置上述无脂bsa溶液包括如下步骤：将所述无脂bsa倒入溶剂中，待无脂bsa充分溶解于溶剂后，得无脂bsa溶液。

需要说明的是，上述溶剂包括生理盐水。

a2）将混合后的软脂酸钠溶液和无脂bsa溶液充分振荡，使软脂酸钠溶液与无脂bsa溶液充分结合，得混合溶液；

实际操作时，使用涡旋振荡器、翻转振荡器或搅拌装置将混合后的软脂酸钠溶液和无脂bsa溶液充分振荡，振荡时间一般为10-30s。

a3）将充分结合的混合溶液置于低温下冷却，将冷却后的混合溶液进行过滤、除菌，得细胞添加剂。

实际操作时，待上述混合液冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得终浓度为2-20mmol/l的软脂酸钠细胞添加剂，将该细胞添加剂至于-25~8℃的低温环境下保存。

以下通过实验数据验证本发明提出的细胞添加剂对h9c2心肌细胞系的损伤作用：

分别给予h9c2心肌细胞400µm的细胞添加剂、单纯0.4%的bsa对照，24小时后，进行annexinv-fitc、碘化丙啶（propidiumiodide,pi）双染后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡（fitc阴性、pi阳性），图18~图20展示了细胞添加剂诱导h9c2心肌细胞系发生凋亡的数据。

其中，图18和图19分别为实施例5中流式细胞术结果，其中右下象限中的细胞是发生凋亡的细胞；图20为细胞凋亡的统计结果，每组包括3个有效数据。图中，fl1-a.fitc为通道荧光值；fl3-a.pi为通道荧光值；bsa0.4.为0.4%牛血清白蛋白；hl400.为含400µm软脂酸钠的细胞添加剂。

与图18中单纯0.4%的bsa相比，图19中400µm的细胞添加剂（hl400）显著增加细胞凋亡水平。该研究证明实施例5中400µm的细胞添加剂成功诱导了心肌细胞发生凋亡。

本实施提供一种细胞添加剂及其制备方法，该方法能够克服现有软脂酸钠组分溶液配制过程中溶剂毒性、bsa结合力不足、软脂酸钠组分难溶解等技术问题，具有简单易操作、稳定性好等优点，配置出的细胞添加剂能够成功诱导2型糖尿病心肌细胞和内皮细胞损伤。

实施例六

一种细胞添加剂，包括浓度为5-20g/100ml的bsa组分和浓度为2-20mmol/l的软脂酸钠组分。

本实施例中，bsa组分的溶液浓度采用5g/100ml，软脂酸钠组分的溶液浓度采用2mmol/l。其中，本实施例中bsa组分包括无脂bsa，软脂酸钠组分包括软脂酸钠。

需要说明的是，采用上述浓度是为了满足体外细胞实验中模拟2型糖尿病的软脂酸钠的工作浓度，软脂酸钠的工作浓度通常为200-400umol/l。

本实施例中的细胞添加剂的制备方法，具体包括如下步骤：

a1）将浓度为2mmol/l的高温溶解的软脂酸钠溶液与浓度为5g/100ml的无脂bsa溶液混合；

实际操作时，使用移液器迅速将高温溶解的软脂酸钠溶液转移至无脂bsa溶液混合中，使用移液器快速转移，每次转移过程应控制在15s内。

具体的，配置上述高温溶解的软脂酸钠溶液包括如下步骤：将所述软脂酸钠倒入溶剂中，并置于70℃的温度下加热溶解，待软脂酸钠全部溶解于溶剂后，得高温溶解的软脂酸钠溶液。

具体的，配置上述无脂bsa溶液包括如下步骤：将所述无脂bsa倒入溶剂中，待无脂bsa充分溶解于溶剂后，得无脂bsa溶液。

需要说明的是，上述溶剂包括生理盐水。

a2）将混合后的软脂酸钠溶液和无脂bsa溶液充分振荡，使软脂酸钠溶液与无脂bsa溶液充分结合，得混合溶液；

实际操作时，使用涡旋振荡器、翻转振荡器或搅拌装置将混合后的软脂酸钠溶液和无脂bsa溶液充分振荡，振荡时间一般为10-30s。

a3）将充分结合的混合溶液置于低温下冷却，将冷却后的混合溶液进行过滤、除菌，得细胞添加剂。

实际操作时，待上述混合液冷却后，在超净台中使用注射器和滤器过滤除菌，即得终浓度为2-20mmol/l的软脂酸钠细胞添加剂，将该细胞添加剂至于-25~8℃的低温环境下保存。

以下通过实验数据验证本发明提出的细胞添加剂对h9c2心肌细胞系的损伤作用：

分别给予h9c2心肌细胞400µm的细胞添加剂、单纯0.4%的bsa对照，24小时后，进行annexinv-fitc、碘化丙啶（propidiumiodide,pi）双染后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡（fitc阴性、pi阳性），图21~图23展示了细胞添加剂诱导h9c2心肌细胞系发生凋亡的数据。

其中，图21和图22分别为实施例5中流式细胞术结果，其中右下象限中的细胞是发生凋亡的细胞；图23为细胞凋亡的统计结果，每组包括3个有效数据。图中，fl1-a.fitc为通道荧光值；fl3-a.pi为通道荧光值；bsa1.0.为1.0%牛血清白蛋白；hl400.为含400µm软脂酸钠的细胞添加剂。

与图21中单纯1.0%的bsa相比，图22中400µm的细胞添加剂（hl400）显著增加细胞凋亡水平。该研究证明实施例6中400µm的细胞添加剂成功诱导了心肌细胞发生凋亡。

本实施提供一种细胞添加剂及其制备方法，该方法能够克服现有软脂酸钠组分溶液配制过程中溶剂毒性、bsa结合力不足、软脂酸钠组分难溶解等技术问题，具有简单易操作、稳定性好等优点，配置出的细胞添加剂能够成功诱导2型糖尿病心肌细胞和内皮细胞损伤。

上述实施例提供了一种细胞添加剂及其制备方法，属于2型糖尿病体外细胞研究领域，该细胞添加剂包括bsa组分和软脂酸钠组分，本发明将高温软脂酸钠组分溶液与bsa组分溶液混合、溶解，在实际操作过程中，振荡混合前的bsa组分溶液应保持-5~10℃低温状态，通过该技术方案克服了现有软脂酸钠组分溶液配制过程中溶剂毒性、bsa结合力不足、软脂酸钠组分难溶解等技术问题，具有简单易操作、稳定性好等优点，配置出的细胞添加剂能够成功诱导2型糖尿病心肌细胞和内皮细胞损伤，具有广阔的应用前景。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。