本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
维生素k2(menaquinone，mk)是一种脂溶性维生素，具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，是人体中不可缺少的重要维生素之一。维生素k2为甲萘醌类系列化合物，淡黄色晶体，根据其分子结构上c-3位异戊二烯侧链的长短不同共有14种形式，以mk-n表示指侧链上异戊二烯单位的个数)，其中mk-7(天然维生素k2)生物活性最为显著。
γ–聚谷氨酸(γ-pga)是由d-谷氨酸和(或)l-谷氨酸单体经γ-酰胺键聚合而成的一种多功能生物高分子聚合物，γ–pga是组成纳豆粘性胶体的主要成份，具有促进矿物质吸收的作用。γ-pga特殊的分子结构，使其具有极强的保湿能力，添加γ-pga于化妆品或保养品中，能有效地增加皮肤的保湿能力，促进皮肤健康。
mk-7和γ-聚谷氨酸均是纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)的代谢产物。现经过诱变选育已得到一株纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)nd-1-a27，能够用来发酵生产维生素k2(mk-7)。但是纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)nd-1-a27在工业用发酵培养基中发酵生产维生素k2(mk-7)浓度较低，且γ-聚谷氨酸浓度较低，不适用于工业生产。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种纳豆芽孢杆菌的重组菌，通过在基因组上增强表达mena、menc、mend基因，以及敲除ubia基因以及aroh基因，达到强化维生素k2(mk-7)浓度，并联合生产γ-聚谷氨酸的目的。
本发明的第一个目的是提供一种纳豆芽孢杆菌重组菌，所述重组菌敲除了4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶基因(ubia)，敲除了分支变位酶基因(aroh)，同时在基因组上增强表达了1,4-二羟基-2-萘甲酸聚异戊二烯基转移酶基因(mena)、邻琥珀酰苯甲酸合成酶基因(menc)和2-琥珀酰-5-烯醇丙酮酰-6-羟基-3-环己烯-1-羧酸合成酶基因(mend)。
进一步地，所述4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。
进一步地，所述分支变位酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
进一步地，所述1,4-二羟基-2-萘甲酸聚异戊二烯基转移酶的氨基酸序列如seqidno.3所示，所述邻琥珀酰苯甲酸合成酶的氨基酸序列如seqidno.4所示，所述2-琥珀酰-5-烯醇丙酮酰-6-羟基-3-环己烯-1-羧酸合成酶的核苷酸序列如seqidno.5所示。
进一步地，所述重组菌是以纳豆芽孢杆菌bacillussubtilisnattond-1-a27为宿主菌。所述纳豆芽孢杆菌bacillussubtilisnattond-1-a27于2018年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno:m2018131，具体参见cn201810392873.x一株高产维生素k2(mk-7)的纳豆芽孢杆菌及其应用。
进一步地，所述重组菌是以pma5作为表达载体进行基因敲除或基因过表达。
本发明的第二个目的是提供一种所述的重组菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)设计合成核苷酸序列如seqidno.6所示的cas9蛋白表达框，核苷酸序列如seqidno.7所示的sgrnascaffold表达框，和核苷酸序列如seqidno.8所示的sgrna片段；
(2)将cas9蛋白表达框连接到pma5表达载体上，获得质粒pma5-cas9；
(3)将sgrnascaffold表达框连接到质粒pma5-cas9上；
(4)提取纳豆芽孢杆菌nd-1-a27基因组dna，扩增ubia上下游各500bp，将基因mena扩增共同作为同源修复序列，将所述同源修复序列连接到步骤(3)的质粒上，获得纳豆芽孢杆菌基因编辑载体pmac；
(5)将纳豆芽孢杆菌基因编辑载体pmac电转至nd-1-a27感受态中，筛选得到ubia敲除，mena增强表达的纳豆芽孢杆菌，并进行无抗性传代，消除质粒实验，最终获得无抗性纳豆芽孢杆菌nd-1-a27a△ubia；
(6)提取纳豆芽孢杆菌nd-1-a27基因组dna，扩增aroh上下游各500bp，将基因menc、mend扩增共同作为同源修复序列，将所述同源修复序列连接到步骤(3)的质粒上，获得纳豆芽孢杆菌基因编辑载体pmac-1；
(7)将纳豆芽孢杆菌基因编辑载体pmac-1电转至nd-1-a27a△ubia感受态中，筛选获得aroh敲除并且增强表达menc及mend的纳豆芽孢杆菌nd-1-a27acd△ubia△aroh。
本发明的第三个目的是提供一种所述的重组菌在发酵生产维生素k2(mk-7)和γ–聚谷氨酸中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种所述的重组菌发酵生产维生素k2(mk-7)和γ–聚谷氨酸的方法，将所述重组菌单菌落接种于种子培养基中，35～38℃、100～150r/min培养6～10h得到种子培养液；以1～5％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，35～38℃培养3～6天，得到发酵液，从发酵液中分离提取得到维生素k2(mk-7)和γ–聚谷氨酸。
进一步地，所述种子培养基为：葡萄糖25～35g/l，蛋白胨35～45g/l，氯化钠3～7g/l，牛肉膏3～7g/l，酵母膏3～7g/l。
进一步地，所述发酵培养基为：甘油40-60g/l，大豆蛋白胨25-35g/l，酵母粉0.5-1g/l，k2hpo40.2-0.6g/l。
本发明的有益效果是：
本发明系统首次尝试使用crispr-cas基因编辑技术将副产物泛琨反馈调节代谢途径中关键酶ubia以及副产物氨基酸反馈调节代谢途径中关键酶aroh进行敲除，同时在基因组上增强表达了关键酶基因mena、menc、mend，在提高维生素k2(mk-7)浓度的同时得到γ-聚谷氨酸，并且γ-聚谷氨酸的浓度达到较高水平，做到维生素k2(mk-7)与γ-聚谷氨酸的联合生产的新思路。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
无抗性纳豆芽孢杆菌nd-1-a27a△ubia制备方法：
(1)设计并合成符合纳豆芽孢杆菌nd-1-a27密码子特性的cas9蛋白表达框(seqidno.6)、sgrna表达框(seqidno.7)、sgrna片段(seqidno.8)；
合成的cas蛋白表达框t-a克隆自pmd19-t-simple载体，获得质粒t-cas9。再使用引物扩增片段，胶回收后无缝拼接到bamhi和mlui酶切的pma5，得到质粒pmac；
(2)用引物扩增以ubia为靶点设计的sgrna，用primerstardna聚合酶扩增获得带有靶点n20的sgrnascaffold表达框；
扩增产物纯化后进行mlui酶切后连接入质粒pma5-cas9的mlui位点；
(3)提取纳豆芽孢杆菌nd-1-a27基因组dna，使用primerstardna聚合酶及相关引物分别扩增ubia上下游各500bp以及mena基因作为同源修复序，并按照ubia上游500bp、mena以及ubia下游500bp顺序无缝拼接于质粒pma5-cas9的psti位点。获得所述的纳豆芽孢杆菌nd-1-a27基因组编辑载体pmac；
(4)在制备的纳豆芽孢杆菌nd-1-a27感受态细胞内接入质粒dna；电转感受态细胞中，冰浴5min；加入到预冷的电转杯中，电击一次(2.0kv，4.5～5.0ms)，若电击效率不高可进行两次；电击完毕立即往电转杯中加入700μl复苏培养基rm(lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)，将杯底的菌体吹吸起来，然后置37℃，220rpm培养3-3.5h使菌体恢复生长；以6000rpm离心5min后，吸去上清，留100μl左右重悬菌体后涂带10μg/ml的卡那霉素抗性平板，37℃培养12h后验证长出的转化子；
(5)将获得的携带了pmac质粒的重组纳豆芽孢杆菌nd-1-a27阳性转化子，用pma5通用引物进行菌落pcr检测，对pcr检测ubia片段大小发生了变化的转化子，回收其扩增片段并送至南京金维智生物科技公司进行测序，将测序结果和原基因进行比对，检测ubia基因是否敲除成功且mena是否增强表达；
(6)将敲除成功的单菌落挑取到无抗性的种子培养基中培养传代以消除pmac质粒，获得无抗性纳豆芽孢杆菌nd-1-a27a△ubia。
实施例2：
纳豆芽孢杆菌nd-1-a27acd△ubia△aroh制备方法：
(1)用引物扩增以aroh为靶点设计的sgrna，用primerstardna聚合酶扩增获得带有靶点n20的sgrnascaffold表达框；
扩增产物纯化后进行mlui酶切后连接入质粒pma5-cas9的mlui位点；
(2)提取纳豆芽孢杆菌nd-1-a27基因组dna，使用primerstardna聚合酶及相关引物分别扩增aroh上下游各500bp以及menc基因、mend基因作为同源修复序，并按照aroh上游500bp、menc、mend以及aroh下游500bp顺序无缝拼接于质粒pma5-cas9的psti位点。获得所述的纳豆芽孢杆菌nd-1-a27基因组编辑载体pmac-1；
(3)在制备的纳豆芽孢杆菌nd-1-a27a△ubia感受态细胞内接入质粒dna；电转感受态细胞中，冰浴5min；加入到预冷的电转杯中，电击一次(2.0kv，4.5～5.0ms)，若电击效率不高可进行两次；电击完毕立即往电转杯中加入700μl复苏培养基rm(lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)，将杯底的菌体吹吸起来，然后置37℃，220rpm培养3-3.5h使菌体恢复生长；以6000rpm离心5min后，吸去上清，留100μl左右重悬菌体后涂带10μg/ml的卡那霉素抗性平板，37℃培养12h后验证长出的转化子；
(4)将获得的携带了pmac-1质粒的重组纳豆芽孢杆菌nd-1-a27阳性转化子，用pma5通用引物进行菌落pcr检测，对pcr检测aroh片段大小发生了变化的转化子，回收其扩增片段并送至南京金维智生物科技公司进行测序，将测序结果和原基因进行比对，检测aroh基因是否敲除成功及menc、mend是否增强表达成功；
(5)将敲除成功的单菌落挑取到无抗性的种子培养基中培养传代以消除pmac-1质粒，获得纳豆芽孢杆菌nd-1-a27acd△ubia△aroh。
实施例3：
利用代谢改造所得菌株联合生产维生素k2(mk-7)和γ-聚谷氨酸的应用。包括下述步骤：
(1)制备纳豆芽孢杆菌nd-1-a27acd△ubia△aroh的细胞液体培养物：挑取营养琼脂培养基上纳豆芽孢杆菌nd-1-a27acd△ubia△aroh菌株一环，接种在装有30ml种子培养基的250ml锥形瓶中，在37℃下，置于摇床上以120r/min的转速培养8h至对数期，即制得纳豆芽孢杆菌nd-1-a27acd△ubia△aroh菌株的细胞液体培养物。
(2)发酵培养基的成分及配比为：甘油50g/l，大豆蛋白胨30g/l，酵母粉0.6g/l，k2hpo40.3g/l；121℃灭菌20分钟。
(3)摇瓶发酵：将上述纳豆芽孢杆菌nd-1-a27acd△ubia△aroh菌株的细胞液体培养物以2％(w/w)的接种量接种在装有已灭菌的30ml发酵培养基的250ml锥形瓶中，在37℃，静置培养条件下发酵培养3-6天，得粘稠发酵液。
(4)浓度测定：使用正己烷：异丙醇(2:1)作为萃取剂，将上述nd-1-a27acd△ubia△aroh菌株的发酵液进行产物提取，使用c18柱；流动相为100％甲醇；柱温40℃；流速为1.0ml做hplc分析。另外稀释发酵液通过hplc测定γ-聚谷氨酸的浓度。
发酵到第四天时，维生素k2(mk-7)浓度从改造前的30.87mg/l，提高到80.29mg/l，γ-聚谷氨酸浓度达到103.53g/l。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种纳豆芽孢杆菌重组菌及其构建方法与应用
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