本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种干细胞体外诱导培育视网膜神经节细胞的方法。
背景技术：
视网膜神经元的损伤和修复是神经性视觉损伤发生、发展和转归共同的科学问题。近年随着干细胞研究的迅速发展，诱导干细胞为视觉神经损伤的修复与治疗带来了新的希望。由于干细胞的自我复制和多分化潜能，作为修复神经系统损伤的供体不但能满足移植时所需的细胞量，而且干细胞在一定条件下能诱导分化为包括神经元在内的不同的神经细胞系。因此，将人源性的干细胞通过移植治疗视觉神经损伤并恢复机体功能，具有重要的理论意义和良好的临床治疗前景。研究发现将多功能干细胞直接移植到受损的视网膜组织后，90％以上的细胞均分化为星形胶质细胞，几乎没有神经元的存在。而神经元对损伤后视功能的恢复起着决定性的作用。因此，能否在体外将多功能干细胞定向诱导分化为特定的视网膜神经元就成为制约其临床应用的关键问题之一。
发育生物学研究表明，无论是低等还是高等的动物，其视觉系统的发育和可塑性变化均需要精确的时间和空间的调控，从视泡、视杯发育到神经视网膜、视网膜色素上皮的分化进一步发育分化成为精细的视网膜结构。因此认为视网膜神经节细胞的发育与成熟除了化学因素影响外，精细的时空调控也是必不可少的重要诱导条件。由于视网膜神经节细胞在视觉信号的传入、视觉信息的传导完整以及视功能维持等方面均具有重要的作用，其损伤后较难以通过其它方式进行替代。因此，视觉神经损伤后恢复视网膜神经节细胞的数目和功能不仅有助于减缓视神经损伤病人病情的恶化，促进患者视觉功能的恢复，也必将促进损伤视神经结构和功能的重建，对整个神经系统的损伤修复以及神经组织工程学的研究也会产生积极的推动作用。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题为视网膜神经的修复问题，提供一种干细胞体外诱导培育视网膜神经节细胞的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种干细胞体外诱导培育视网膜神经节细胞的方法，包括：s11.取自体干细胞制成单细胞悬液；s12.将单细胞悬液计数后用分化培养基将其稀释成10-5~10-3cells/ml的干细胞悬液，接种到培养皿中，获取拟胚体；s13.将拟胚体增殖后转移到诱导分化培养基中，在37℃、5%co2、饱和湿度下进行干预分化培养，所述诱导分化培养基为：每ml含有bfgf10ng、bdnf20ng、cntf20ng、n2supplement1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为dmem/f12培养基，所述dmem/f12培养基是由dmem培养基和f12培养基按照体积比1:1混合而成。
自体干细胞在诱导分化培养基中的多种诱导因子的作用下向视网膜神经节细胞分化，可以得到足量的由自体干细胞分化产生的视网膜神经节细胞。
自体干细胞分化形成的视网膜神经节细胞可用于视觉神经损伤后恢复视网膜神经节细胞的数目和功能，不仅有助于减缓视神经损伤病人病情的恶化，促进患者视觉功能的恢复，也必将促进损伤视神经结构和功能的重建，同时，由于神经节细胞是由自体干细胞分化得到的，因此受损的视神经恢复的概率更大。
优选地，所述培养基中还包括银杏内酯1~5ng。银杏内酯可促进神经节细胞生长，而同分化培养基中的诱导因子共同作用可以提高神经节细胞的分化率，加快分化速度。
优选地，所述银杏内酯为银杏叶提取物经进一步提取而得，所述银杏叶提取物的制备方法为：s31.取银杏叶，加入90%的乙醇进行第一次提取，提取2~4h，所述银杏叶同90%的乙醇的质量比为1:10~12，得到第一提取液；经过第一次提取的银杏叶，再加入60%的乙醇进行第二次提取，提取2~4h，所述银杏叶同60%乙醇的质量比为1：7~10，得到第二提取液；经过第二次提取的银杏叶，再加入40%的乙醇进行第三次提取，提取1~3h，所述银杏叶同40%的乙醇的质量比为1：3~5；s32.合并提取液后浓缩提取液至原体积的一半，加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取分离出的有机相，浓缩成浸膏后加去离子水稀释，所述浸膏同去离子水的体积比为1:80，得到混合液；s33.混合液上ads-17柱，先用水洗，直至流出液无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩至浸膏，再用体积浓度为70%的乙醇结晶，得到银杏叶提取物。多次提取后，银杏叶中的有效物质从叶片内释放到乙醇中，在经过大孔吸附树脂提纯后得到的银杏叶提取物中可以提取出大量的银杏内酯。
优选地，所述银杏内酯经过进一步提取后加入到培养基中，所述进一步提取的方法为：s41.将硅藻土在持续搅拌条件下缓慢加入乙酸乙酯中，再加入银杏叶提取物，于70~80℃加热回流4~5h，过滤浓缩，得到浓缩液；所述硅藻土：乙酸乙酯：银杏叶提取物=0.8~1.2:20~30:1；s42.向浓缩液中加入去离子水，静置分层后，取出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；s43.洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯，加入无水乙醇使其溶解，再加入去离子水是含醇量为50~60%，静置，得到结晶物，烘干得到银杏内酯。从银杏提取物中提取中银杏内酯的一次结晶物中，还包含少量的银杏提取物，含有这些提取物的结晶物烘干后得到银杏内酯实际为主要成分为银杏内酯的混合物，而该混合物对促进干细胞向视网膜神经节细胞分化有一定的作用。
优选地，所述硅藻土为改性硅藻土，所述改性硅藻土的制备方法为：s51.将硅藻土加入到ph=0.3～0.5的硝酸溶液中，配置成重量百分比浓度为20～50%的浆液，经煮沸、冷却、抽滤、洗涤、干燥、煅烧，得到预改性硅藻土；s52将预改性硅藻土加入到重量百分比浓度为25～30%的硝酸铁溶液中，配置成重量百分比浓度为40～50%的浆液，经干燥、焙烧得到二次预改性硅藻土；s53.将纳米二氧化锆与二次预改性硅藻土通过气流分散混合，得到改性硅藻土。采用纳米二氧化锆改性的硅藻土可以在提取银杏内酯的过程中，可以向最后得到的结晶物中引入少量的纳米二氧化锆，使得诱导分化培养基可以更进一步的促进干细胞向视网膜神经节细胞转化。
优选地，所述s52中干燥温度为60～120℃，焙烧温度为500~600℃，焙烧时间为6h。。
优选地，所述s53中焙烧温度为500~600℃，焙烧时间为10h。。
优选地，所述二次预改性硅藻土和纳米二氧化锆的质量比为1:0.01~0.05。。
优选地，所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述改性二氧化锆的制备方法为：所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述纳米二氧化锆的改性方法为：取硝酸铈1~2质量份，氢氧化钠4~10质量份，去离子水40~50质量份，纳米二氧化锆0.8~1质量份；将硝酸铈溶于20~25质量份的去离子水中，氢氧化钠溶于20~25质量份的去离子水中，将两份溶液混合，搅拌均匀，在高压环境中在140℃下反应48h后，去除一半的上清液，加入等体积的去离子水，加入纳米二氧化锆，搅拌均匀后，140℃下反应48h，过滤取固体物质，洗涤后干燥，在空气气氛中500~600℃焙烧3h，得到改性纳米二氧化锆。向培养基中引入改性的纳米二氧化锆，可以更进一步的提高干细胞分化为视网膜神经节细胞的分化率。
优选地，所述硝酸铈1.5量份，氢氧化钠6质量份，去离子水45质量份，纳米二氧化锆0.9质量份。。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：自体干细胞分化形成的视网膜神经节细胞可用于视觉神经损伤后恢复视网膜神经节细胞的数目和功能，不仅有助于减缓视神经损伤病人病情的恶化，促进患者视觉功能的恢复，也必将促进损伤视神经结构和功能的重建，同时，由于神经节细胞是由自体干细胞分化得到的，因此受损的视神经恢复的概率更大；向培养基中引入改性的纳米二氧化锆，可以更进一步的提高干细胞分化为视网膜神经节细胞的分化率。
具体实施方式
以下实施列是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
一种干细胞体外诱导培育视网膜神经节细胞的方法，包括：s11.取自体干细胞制成单细胞悬液；s12.将单细胞悬液计数后用分化培养基将其稀释成10-5~10-3cells/ml的干细胞悬液，接种到培养皿中，获取拟胚体；s13.将拟胚体增殖后转移到诱导分化培养基中，在37℃、5%co2、饱和湿度下进行干预分化培养，所述诱导分化培养基为：每ml含有bfgf10ng、bdnf20ng、cntf20ng、n2supplement1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为dmem/f12培养基，所述dmem/f12培养基是由dmem培养基和f12培养基按照体积比1:1混合而成。所述培养基中还包括银杏内酯3ng。所述银杏内酯为银杏叶提取物经进一步提取而得，所述银杏叶提取物的制备方法为：s31.取银杏叶，加入90%的乙醇进行第一次提取，提取3h，所述银杏叶同90%的乙醇的质量比为1:11，得到第一提取液；经过第一次提取的银杏叶，再加入60%的乙醇进行第二次提取，提取3h，所述银杏叶同60%乙醇的质量比为1：9，得到第二提取液；经过第二次提取的银杏叶，再加入40%的乙醇进行第三次提取，提取2h，所述银杏叶同40%的乙醇的质量比为1：4；s32.合并提取液后浓缩提取液至原体积的一半，加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取分离出的有机相，浓缩成浸膏后加去离子水稀释，所述浸膏同去离子水的体积比为1:80，得到混合液；|s33.混合液上ads-17柱，先用水洗，直至流出液无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩至浸膏，再用体积浓度为70%的乙醇结晶，得到银杏叶提取物。所述银杏内酯经过进一步提取后加入到培养基中，所述进一步提取的方法为：s41.将硅藻土在持续搅拌条件下缓慢加入乙酸乙酯中，再加入银杏叶提取物，于75℃加热回流4.5h，过滤浓缩，得到浓缩液；所述硅藻土：乙酸乙酯：银杏叶提取物=1:25:1；s42.向浓缩液中加入去离子水，静置分层后，取出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；s43.洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯，加入无水乙醇使其溶解，再加入去离子水是含醇量为55%，静置，得到结晶物，烘干得到银杏内酯。所述硅藻土为改性硅藻土，所述改性硅藻土的制备方法为：s51.将硅藻土加入到ph=0.4的硝酸溶液中，配置成重量百分比浓度为25%的浆液，经煮沸、冷却、抽滤、洗涤、干燥、煅烧，得到预改性硅藻土；s52将预改性硅藻土加入到重量百分比浓度为26%的硝酸铁溶液中，配置成重量百分比浓度为45%的浆液，经干燥、焙烧得到二次预改性硅藻土；s53.将纳米二氧化锆与二次预改性硅藻土通过气流分散混合，得到改性硅藻土。所述s52中干燥温度为100℃，焙烧温度为550℃，焙烧时间为6h。所述s53中焙烧温度为560℃，焙烧时间为10h。所述二次预改性硅藻土和纳米二氧化锆的质量比为1:0.02。所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述改性二氧化锆的制备方法为：所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆；将硝酸铈溶于22.5质量份的去离子水中，氢氧化钠溶于22.5质量份的去离子水中，将两份溶液混合，搅拌均匀，在高压环境中在140℃下反应48h后，去除一半的上清液，加入等体积的去离子水，加入纳米二氧化锆，搅拌均匀后，140℃下反应48h，过滤取固体物质，洗涤后干燥，在空气气氛中580℃焙烧3h，得到改性纳米二氧化锆。所述硝酸铈1.5量份，氢氧化钠6质量份，去离子水45质量份，纳米二氧化锆0.9质量份。
自体干细胞在诱导分化培养基中的多种诱导因子的作用下向视网膜神经节细胞分化，可以得到足量的由自体干细胞分化产生的视网膜神经节细胞。
自体干细胞分化形成的视网膜神经节细胞可用于视觉神经损伤后恢复视网膜神经节细胞的数目和功能，不仅有助于减缓视神经损伤病人病情的恶化，促进患者视觉功能的恢复，也必将促进损伤视神经结构和功能的重建，同时，由于神经节细胞是由自体干细胞分化得到的，因此受损的视神经恢复的概率更大。银杏内酯可促进神经节细胞生长，而同分化培养基中的诱导因子共同作用可以提高神经节细胞的分化率，加快分化速度。多次提取后，银杏叶中的有效物质从叶片内释放到乙醇中，在经过大孔吸附树脂提纯后得到的银杏叶提取物中可以提取出大量的银杏内酯。从银杏提取物中提取中银杏内酯的一次结晶物中，还包含少量的银杏提取物，含有这些提取物的结晶物烘干后得到银杏内酯实际为主要成分为银杏内酯的混合物，而该混合物对促进干细胞向视网膜神经节细胞分化有一定的作用。采用纳米二氧化锆改性的硅藻土可以在提取银杏内酯的过程中，可以向最后得到的结晶物中引入少量的纳米二氧化锆，使得诱导分化培养基可以更进一步的促进干细胞向视网膜神经节细胞转化。。。。向培养基中引入改性的纳米二氧化锆，可以更进一步的提高干细胞分化为视网膜神经节细胞的分化率。
实施例2
一种干细胞体外诱导培育视网膜神经节细胞的方法，包括：s11.取自体干细胞制成单细胞悬液；s12.将单细胞悬液计数后用分化培养基将其稀释成10-5~10-3cells/ml的干细胞悬液，接种到培养皿中，获取拟胚体；s13.将拟胚体增殖后转移到诱导分化培养基中，在37℃、5%co2、饱和湿度下进行干预分化培养，所述诱导分化培养基为：每ml含有bfgf10ng、bdnf20ng、cntf20ng、n2supplement1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为dmem/f12培养基，所述dmem/f12培养基是由dmem培养基和f12培养基按照体积比1:1混合而成。所述培养基中还包括银杏内酯1ng。所述银杏内酯为银杏叶提取物经进一步提取而得，所述银杏叶提取物的制备方法为：s31.取银杏叶，加入90%的乙醇进行第一次提取，提取2h，所述银杏叶同90%的乙醇的质量比为1:10，得到第一提取液；经过第一次提取的银杏叶，再加入60%的乙醇进行第二次提取，提取2h，所述银杏叶同60%乙醇的质量比为1：7，得到第二提取液；经过第二次提取的银杏叶，再加入40%的乙醇进行第三次提取，提取1h，所述银杏叶同40%的乙醇的质量比为1：3；s32.合并提取液后浓缩提取液至原体积的一半，加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取分离出的有机相，浓缩成浸膏后加去离子水稀释，所述浸膏同去离子水的体积比为1:80，得到混合液；|s33.混合液上ads-17柱，先用水洗，直至流出液无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩至浸膏，再用体积浓度为70%的乙醇结晶，得到银杏叶提取物。所述银杏内酯经过进一步提取后加入到培养基中，所述进一步提取的方法为：s41.将硅藻土在持续搅拌条件下缓慢加入乙酸乙酯中，再加入银杏叶提取物，于70℃加热回流4h，过滤浓缩，得到浓缩液；所述硅藻土：乙酸乙酯：银杏叶提取物=0.8:20:1；s42.向浓缩液中加入去离子水，静置分层后，取出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；s43.洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯，加入无水乙醇使其溶解，再加入去离子水是含醇量为50%，静置，得到结晶物，烘干得到银杏内酯。所述硅藻土为改性硅藻土，所述改性硅藻土的制备方法为：s51.将硅藻土加入到ph=0.3的硝酸溶液中，配置成重量百分比浓度为20%的浆液，经煮沸、冷却、抽滤、洗涤、干燥、煅烧，得到预改性硅藻土；s52将预改性硅藻土加入到重量百分比浓度为25%的硝酸铁溶液中，配置成重量百分比浓度为40%的浆液，经干燥、焙烧得到二次预改性硅藻土；s53.将纳米二氧化锆与二次预改性硅藻土通过气流分散混合，得到改性硅藻土。所述s52中干燥温度为60℃，焙烧温度为500℃，焙烧时间为6h。所述s53中焙烧温度为500℃，焙烧时间为10h。所述二次预改性硅藻土和纳米二氧化锆的质量比为1:0.01。所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述改性二氧化锆的制备方法为：所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述纳米二氧化锆的改性方法为：取硝酸铈1质量份，氢氧化钠4质量份，去离子水40质量份，纳米二氧化锆0.8质量份；将硝酸铈溶于20质量份的去离子水中，氢氧化钠溶于20质量份的去离子水中，将两份溶液混合，搅拌均匀，在高压环境中在140℃下反应48h后，去除一半的上清液，加入等体积的去离子水，加入纳米二氧化锆，搅拌均匀后，140℃下反应48h，过滤取固体物质，洗涤后干燥，在空气气氛中500℃焙烧3h，得到改性纳米二氧化锆。
实施例3
一种干细胞体外诱导培育视网膜神经节细胞的方法，包括：s11.取自体干细胞制成单细胞悬液；s12.将单细胞悬液计数后用分化培养基将其稀释成10-5~10-3cells/ml的干细胞悬液，接种到培养皿中，获取拟胚体；s13.将拟胚体增殖后转移到诱导分化培养基中，在37℃、5%co2、饱和湿度下进行干预分化培养，所述诱导分化培养基为：每ml含有bfgf10ng、bdnf20ng、cntf20ng、n2supplement1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为dmem/f12培养基，所述dmem/f12培养基是由dmem培养基和f12培养基按照体积比1:1混合而成。所述培养基中还包括银杏内酯5ng。所述银杏内酯为银杏叶提取物经进一步提取而得，所述银杏叶提取物的制备方法为：s31.取银杏叶，加入90%的乙醇进行第一次提取，提取4h，所述银杏叶同90%的乙醇的质量比为1:12，得到第一提取液；经过第一次提取的银杏叶，再加入60%的乙醇进行第二次提取，提取4h，所述银杏叶同60%乙醇的质量比为1：10，得到第二提取液；经过第二次提取的银杏叶，再加入40%的乙醇进行第三次提取，提取3h，所述银杏叶同40%的乙醇的质量比为1：5；s32.合并提取液后浓缩提取液至原体积的一半，加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取分离出的有机相，浓缩成浸膏后加去离子水稀释，所述浸膏同去离子水的体积比为1:80，得到混合液；|s33.混合液上ads-17柱，先用水洗，直至流出液无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩至浸膏，再用体积浓度为70%的乙醇结晶，得到银杏叶提取物。所述银杏内酯经过进一步提取后加入到培养基中，所述进一步提取的方法为：s41.将硅藻土在持续搅拌条件下缓慢加入乙酸乙酯中，再加入银杏叶提取物，于80℃加热回流5h，过滤浓缩，得到浓缩液；所述硅藻土：乙酸乙酯：银杏叶提取物=1.2:30:1；s42.向浓缩液中加入去离子水，静置分层后，取出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；s43.洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯，加入无水乙醇使其溶解，再加入去离子水是含醇量为60%，静置，得到结晶物，烘干得到银杏内酯。所述硅藻土为改性硅藻土，所述改性硅藻土的制备方法为：s51.将硅藻土加入到ph=0.5的硝酸溶液中，配置成重量百分比浓度为50%的浆液，经煮沸、冷却、抽滤、洗涤、干燥、煅烧，得到预改性硅藻土；s52将预改性硅藻土加入到重量百分比浓度为30%的硝酸铁溶液中，配置成重量百分比浓度为50%的浆液，干燥后在600℃下焙烧10h，得到二次预改性硅藻土；s53.将纳米二氧化锆与二次预改性硅藻土通过气流分散混合，得到改性硅藻土。所述s52中干燥温度为120℃，焙烧温度为600℃，焙烧时间为6h。所述s53中焙烧温度为600℃，焙烧时间为10h。所述二次预改性硅藻土和纳米二氧化锆的质量比为1:0.05。所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述改性二氧化锆的制备方法为：所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述纳米二氧化锆的改性方法为：取硝酸铈2质量份，氢氧化钠10质量份，去离子水50质量份，纳米二氧化锆1质量份；将硝酸铈溶于25质量份的去离子水中，氢氧化钠溶于25质量份的去离子水中，将两份溶液混合，搅拌均匀，在高压环境中在140℃下反应48h后，去除一半的上清液，加入等体积的去离子水，加入纳米二氧化锆，搅拌均匀后，140℃下反应48h，过滤取固体物质，洗涤后干燥，在空气气氛中600℃焙烧3h，得到改性纳米二氧化锆。
实施例4
实施例4同实施例1不同之处在于，所述银杏内酯为银杏内酯b。
实施例5
实施例5同实施例1不同之处在于，所述硅藻土未经改性。
实施例6
实施例6同实施例1不同之处在于，所述二氧化锆未经改性。
实施例7
实施例7同实施例1不同之处在于，所述培养基中不含银杏内酯。
对比例1
对比例1同实施例1不同之处在于，所述银杏叶提取时未在乙酸乙酯加入硅藻土。
实验例
通过分析不同实施例和对比例对应方法的干细胞分化为视网膜神经节细胞的分化率和移植后的存活率，优选实施方案。
分化率指视网膜神经节细胞占分化一段时间后的细胞总数的比例；
移植后存活率为：以小鼠为研究对象，根据实施例1~7和对比例中的方法制得视网膜神经节细胞后，移植入小鼠的视网膜内，3周后，解剖小鼠，对小鼠视网膜内的移植细胞进行计数。
表1干细胞分化培养和移植效果
从表1可以看出，实施例1~3中干细胞的分化率均高于对比例中的分化率，表明将银杏内酯作为培养基的组成成分可以有效的促进干细胞向视网膜神经节细胞分化。
实施例4中加入的是进过提纯的银杏内酯b，其分化率明显低于实施例1~3，表明仅含有银杏内酯b并不能有效的促进干细胞向视网膜神经节细胞分化；实施例5中的硅藻土未改性，而实施例1~3中的银杏内酯制备过程中，硅藻土为改性硅藻土，表明采用改性硅藻土作为提高干细胞向视网膜干细胞分化的分化率有一定的作用；实施例6中的二氧化锆未经改性，其分化率也低于实施例1~3，表明改性的二氧化锆可以有效提高干细胞分化为视网膜神经节细胞效果；实施例7中的培养基中不含有银杏内酯，其分化率显著低于实施例1~3，表明了在培养基中增加银杏内酯，可以显著提高干细胞的分化率。。
实施例1~3中采用了由银杏内酯作为诱导干细胞向视网膜神经节细胞分化的主要诱导因子，提高了分化率。
实施例1~3中的移植后细胞的存活率显著的高于对比例，并高于实施例4~6，表明采用实施例1~3中培养基，可以有效的提高移植后细胞的成活率。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，以上实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。