一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用的制作方法

本发明涉及一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用。属兽用生物制品领域。

背景技术：

气肿疽梭菌病又俗称为黑腿病，主要感染反刍动物，特别是放牧的新生反刍动物对气肿疽梭菌最敏感。该病病程短，发病急，往往来不及救治就突然死亡。为此，疫苗接种是防控该病的主要手段，而商品化的气种疽疫苗主要是强毒力菌株c54-1和c54-2两株的灭活疫苗。该疫苗在预防动物气肿疽方面虽然取得了一定的效果，但疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应；其在制备过程中涉及强毒力气肿疽梭菌的灭活，存在菌株外泄或灭活不彻底等生物安全隐患。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的气肿疽梭菌病基因工程疫苗，是未来的发展方向。

气肿疽梭菌的主要毒力因子有鞭毛、细胞毒素a(ccta)以及唾液酸酶以及其他毒力因子，包括代表耐氧的溶血素、脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶及不耐氧的溶血素(vileiem,johanssona,schlattery,redheadk,freyj.geneticandfunctionalcharacterizationofthenanasialidasefromclostridiumchauvoei.vetres2011；42(1):2.)。其中，鞭毛与气肿疽的毒力密切相关，且鞭毛蛋白具有良好的免疫原性，能够对气肿疽提供免疫保护反应(chandlerhm,gulasekharamj.theprotectiveantigenofahighlyimmunogenicstrainofclostridiumchauvoeiincludinganevaluationofitsflagellaasaprotectiveantigen.jgenmicrobiol1974；84(1):128-34；tamuray,kijima-tanakam,aokia,ogikuboy,takahashit.reversibleexpressionofmotilityandflagellainclostridiumchauvoeiandtheirrelationshiptovirulence.microbiology1995；141(pt3):605-610.)。已有的研究发现，外源表达的鞭毛蛋白flia(c)能够诱导小鼠产生较好的体液免疫应答和细胞免疫应答(气肿疽nana与flia融合基因亚单位疫苗的制备及免疫效果评价[d].延边大学,2014.)。2012年，joachim等人发现了气肿疽梭菌的一种新型毒素，命名为气肿疽梭菌细胞毒素a(ccta)。该毒素是细菌毒素的杀白细胞素总科、β-微孔形成毒素家族中的一种，在气肿疽梭菌中很保守。进一步的研究发现，天然的ccta以及通过大肠杆菌表达的融合蛋白rccta::nusa和酶切后去掉标签的rccta均具有很强的细胞毒性和溶血活性。针对rccta的兔多克隆抗体能够完全中和rccta和气肿疽培养物的细胞毒性和溶血活性，这说明ccta是气肿疽梭菌的主要细胞毒素和溶血因子。此外，joachim等人还发现利用外源性融合蛋白rccta::ltb免疫的动物能够获得对气肿疽梭菌的免疫保护(freyj,johanssona,sibyllebürki,etal.cytotoxinccta,amajorvirulencefactorofclostridiumchauvoeiconferringprotectiveimmunityagainstmyonecrosis[j].vaccine,2012,30(37),5500-5505)。最新的研究发现，ccta的中间区域(第56位～222位氨基酸，以下成为cctan)能够在真核细胞表达，并可作为核酸疫苗进行免疫，诱导实验动物产生较好的体液免疫应答和细胞免疫应答(齐强.牛气肿疽ccta基因核酸疫苗的制备及免疫效果评价[d].2017.)。

技术实现要素：

本发明目的在于利用构建的表达气肿疽梭菌鞭毛蛋白flia(c)和细胞毒素a(ccta)的无毒片段(第56位～第222位氨基酸)的重组融合蛋白的大肠杆菌制备出无毒性的重组融合蛋白(rfliacctan)，用于预防由气肿疽梭菌感染引起的疾病。

本发明技术方案

1.一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其生产方法及其应用，其特征在于所述菌种为重组表达气肿疽梭菌鞭毛蛋白(flia(c))和细胞毒素a(ccta)的重组融合蛋白(rfliacctan)的大肠杆菌(escherichiacoli)bl21(de3)细胞，该菌株被命名为大肠埃希氏菌bl/ma株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmccno.17319。

所述菌种可用来生产气肿疽梭菌鞭毛蛋白和细胞毒素a重组融合蛋白，从而制备气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗，该疫苗用于预防由气肿疽梭菌感染引起的疾病。

2.本发明所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于所述菌种表达的rfliacctan，含有鞭毛蛋白flia(c)和细胞毒素a(ccta)；与野生型细胞毒素a(ccta)相比，只含有无毒片段(第56位～第222位氨基酸)；

所述重组融合蛋白rfliacctan无毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。

3.本发明所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于所述菌种表达的融合蛋白rfliacctan，其编码的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达和可溶表达。

4.本发明所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于所述菌种表达的融合蛋白rfliacctan，其c端含有便于蛋白纯化的标签6组氨酸(6*his)标签。

5.本发明所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种，其特征在于所述气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗的制备方法为：用所述表达rfliacctan的埃希氏大肠菌bl/ma株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加佐剂混合制成。6.本发明权利要求1所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于用于表达融合蛋白rfliacctan的“宿主细胞”，涵盖原核细胞和或真核细胞，可以是产抱子梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽抱杆菌、曹状芽抱杆菌、嗜热溶蛋白芽胞杆菌、炭疽芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌或酵母细胞；

所述宿主细胞优选地是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌bl21(de3)或rosetta(de3)。

本发明有益效果

本发明将气肿疽梭菌鞭毛蛋白flia(c)以及ccta的无毒片段(第56位～第222位氨基酸)进行融合表达，获得了对于动物体无毒的重组融合蛋白(rfliacctan)。本发明进一步公开了含有所述rfliacctan编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明的rfliacctan在小鼠体内完全无毒，且在豚鼠模型中呈现良好的免疫原性和免疫保护性。本发明的rfliacctan或其编码基因能够应用于制备预防气肿疽梭菌感染的基因工程亚单位疫苗。采用本发明提出的一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种可作为制备气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗的理想菌种，这与我国目前商品化的气肿疽梭菌灭活疫苗相比，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。同时，利用该菌种生产融合蛋白的方法稳定性好、耗时短，而且利用该融合蛋白所制备的亚单位疫苗一免后的豚鼠能够抵御致死性气肿疽梭菌强毒菌液的攻击。此外，凭借重组融合蛋白浓度高的优势，在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗，极大方便了联苗的开发。

鉴于我国现有商品化气肿疽梭菌灭活疫苗须采用甲醛灭活脱毒，存在生物安全隐患，也影响了疫苗在田间使用的安全性；同时现行商品化疫苗在生产过程中的时间和培养基成本过高，导致疫苗效力不稳定的问题。因此，本申请一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种，是我国现行气肿疽梭菌灭活疫苗升级换代的理想候选菌种。

综上可见：(1)本发明首次将气肿疽梭菌鞭毛蛋白flia(c)以及ccta融合表达，并实现了在大肠杆菌中的可溶性表达，从而避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了目的蛋白的制备时间和生产成本。(2)选择ccta无毒片段(第56位～第222位氨基酸)，获得了无毒性的重组融合蛋白。(3)对编码重组融合蛋白rfliacctan的基因序列进行了密码子优化，实现了在大肠杆菌中的高效表达和可溶性表达。(4)利用重组表达rfliacctan的大肠杆菌bl21(de3)细胞作为气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种来制备的rfliacctan可作为亚单位疫苗替代传统的培养致病性气肿疽梭菌，大大降低了生产过程中的生物安全风险。

本发明涉及生物材料资源信息

本发明涉及的微生物为：表达气肿疽梭菌鞭毛蛋白flia(c)以及ccta无毒片段(第56位～第222位氨基酸)的重组融合蛋白的大肠埃希氏菌(escherichiacoli)的bl21(de3)细胞株，被命名为大肠埃希氏菌bl/ma株，该菌株已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：cgmccno.17319。

附图说明

图1：rfliacctan表达的sds-page鉴定

m1:proteinmarker；1:bsa(1μg)；2:bsa(2μg)；3:空载体细胞裂解物；4:15℃、16h诱导的细胞裂解物；5:37℃、4h诱导的细胞裂解物；6:空载体细胞裂解物上清；7:15℃、16h诱导的细胞裂解物上清；8:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；9:空载体细胞裂解物沉淀；10:15℃、16h诱导的细胞裂解物沉淀；11:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀；

图2：rfliacctan表达的westernblot(采用抗his抗体)鉴定结果

m2:westernblotmarker；1:空载体细胞裂解物；2:15℃、16h诱导的细胞裂解物；3:37℃、4h诱导的细胞裂解液；4:15℃、16h诱导的细胞裂解物上清；5:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:15℃、16h诱导的细胞裂解物沉淀；7:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀；

图3：m1:proteinmarker；1:15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；2:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；3:流穿液；4:洗涤液；5:20mm咪唑洗脱液；6:50mm咪唑洗脱液；7：300mm咪唑洗脱液本发明具体实施方式

1.本发明所述气肿疽梭菌鞭毛蛋白flia(c)和细胞毒素a(ccta)重组融合蛋白(rfliacctan)，其中：

(1)术语“flia”意指气肿疽梭菌鞭毛蛋白flia(c)，“cctan”意指含有细胞毒素a(ccta)的无毒片段(第56位～第222位氨基酸)。“flia”和“cctan”还涵盖一个或多个修饰(包括化学修饰和基因修饰)的flia(c)和ccta的无毒片段。术语“基因修饰”意指缺失、置换或添加一个或多个氨基酸碱基。

本发明的方法可以用来产生任何flia(c)和ccta的同源物或其衍生物，包括例如flia(c)氨基酸序列seqidno.2(genbank编号ahc53287.1)和ccta氨基酸序列seqidno.4(genbank编号：afn27591.1)的多肽及其衍生物。术语“衍生物”包含氨基酸突变如添加、置换、缺失或截短一个或多个氨基酸残基。

序列2

序列4

rfliacctan可以包含多肽序列，所述多肽序列是与上文提到的flia(c)和ccta序列具有至少50％序列同一性的同源物或衍生物。

rfliacctan可以包含seqidno.2和seqidno.4中任一者的衍生物或与本文中确定的登录号相对应的多肽序列之一的衍生物。其中所述衍生物具有一个或多个点突变和/或一个或多个额外的氨基酸残基。在另一个方面，所述重组融合蛋白可以包含多肽序列，所述多肽序列与seqidno.1和seqidno.2的序列或与本文中确定的登录号相对应的多肽序列列之一具有至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列同一性。

(2)术语“序列同一性”指确定参考氨基酸序列和查询序列之间的同一性，其中将序列如此比对，从而获得最高级级别的匹配，并且所述序列同一性可以使用计算机程序(例如blastp、blastn、fasta)中代码化的公开技术或方法计算。同一性百分数值可以在完整氨基酸序列范围内或氨基酸序列的某个区域内计算。

(3)rfliacctan可以在n末端或c末端或在内部位置含有额外的氨基酸残基。额外的氨基酸残基可以旁侧分布有一个或多个蛋白酶切割位点，可以作为可检测标签发挥作用和或允许与固相支持物结合，例子是his标签。

(4)编码所述rfliacctan的核酸分子可以根据本专利任选地包含调节元件。如本文所用的术语“调节元件”指基因表达的调节元件，包括转录和翻译，并且包括元件如tata框、启动子、增强子、核糖体结合位点等。所述调节元件可以包含一个或多个同源调节元件和/或异源调节元件。“同源调节元件”是涉及在所述野生型细胞中核酸分子或多肽的基因表达的调节元件。“异源调节元件”是不涉及在所述野生型细胞中核酸分子或多肽的基因表达的调节元件。此外，也可以使用诱导型表达的调节元件，如诱导型启动子。

(5)编码所述rfliacctan的核酸分子可以设计成有利于在宿主细胞、特别是细菌宿主细胞、优选的是大肠杆菌细胞中高水平表达，如根据大肠杆菌表达系统进行密码子优化等。另一方面，本发明可任意使用包含编码所述rfliacctan的核酸分子的表达载体，载体可以适于在体外和/或在体内表达所述重组融合蛋白。所述载体可以是用于瞬时和/或稳定基因表达的载体，可以另外包含调节元件和/或选择标记，可以是病毒来源的、噬菌体来源或细菌来源的。例如，所述表达载体可以是pet30a载体。

(6)编码所述rfliacctan的核酸分子或表达载体可以通过宿主细胞表达。如本文所用，术语“宿主细胞”涵盖适合翻译所述核酸分子或所述载体的原核细胞和/或真核细胞。所述宿主细胞不仅包括不表达flia(c)和/ccta或其同源物的宿主细胞，也涵盖表达两种毒素或同源物的宿主细胞，如野生型。如本文所用，术语“宿主细胞”涵盖可以是产抱子梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽抱杆菌、曹状芽抱杆菌、嗜热溶蛋白芽胞杆菌、炭疽芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌或酵母细胞。优选地，宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌bl21(de3)或rosetta(de3)。本发明用所述表达flia(c)和ccta重组融合蛋白的埃希氏大肠菌bl21(de3)，被命名为bl/ma株。

2.大肠埃希氏菌bl/ma株的构建、表达及鉴定

(1)基因合成

根据根据气肿疽flia(c)(序列1)和ccta(序列3)的天然基因序列，经密码子优化后，将含有flia(c)的编码基因和含有ccta的中间区域(第56位～222位氨基酸)的编码基因进行串联表达，从而获得了对于动物体无毒的重组融合蛋白。同时，在重组融合蛋白c端添加纯化所用氨基酸标签编码序列。用化学合成的方法，合成了该段基因序列。

(2)重组融合蛋白表达载体的构建

以人工合成的基因为模板，采用设计的引物对进行pcr扩增到的目的dna条带，经回收后，与原核表达载体同时采用双酶切消化后进行连接，得到插目的基因的原核表达载体。将连接好的质粒转化dh5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。

(3)表达重组融合蛋白的基因工程菌株的构建

将提取得到的质粒，转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经pcr鉴定，含有目的dna片段后，获得阳性菌株，并加入等体积的50％甘油lb，-70℃冻存。

(4)重组融合蛋白的表达与鉴定

将大肠埃希氏菌(e.coli)bl/ma株接种于4ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，振荡培养，当od600为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mmm的iptg溶液分别置于37℃和15℃诱导培养4h和16h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体温重加10ml裂解液[0.02mol/ltris缓冲液(ph值7.2)，0.3mol/lnacl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400w。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心10min，收集上清。取30μl上清加入10μl的4×sds-page上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％sds-page电泳，同时，采用抗his抗体，对其进行westernblot鉴定，最终确定表达的最优化条件。

4.重组融合蛋白的纯化

将大肠埃希氏菌bl/ma株接种于1l含有卡那霉素的lb液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养od600为0.6～0.8时，根据上述确定的最优表达条件，进行诱导表达并收集菌体进行纯化。

5.重组融合蛋白对小鼠的毒力试验

通过测定rfliacctan对小鼠的毒力，以验证该融合蛋白在体内的实际减毒效果。对纯化的蛋白进行蛋白含量检测：用bca法检测蛋白含量(piercetmbcaproteinassaykit，tg268883)。应不低于0.5mmg/ml。经sds-page检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度应不低于85％。将纯化的rfliacctan，分别以不同的剂量，经尾静脉接种16～18g的icr小鼠，每剂量注射5只，0.2ml/只，观察5天，记录小鼠存活情况。

6.重组融合蛋白的免疫效果检测

对纯化的蛋白进行蛋白含量检测：用bca法检测蛋白含量(piercetmbcaproteinassaykit，tg268883)。将双相油佐剂(如206佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30min，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用pbs(ph值7.20.01mol/l)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(v/v)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装，最终制成浓度为50μg/ml的疫苗。同时，用同样剂量的pbs与佐剂混匀，作为对照疫苗。

对分装后的亚单位疫苗按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录进行以下检验：

(1)性状

外观应为乳白色乳剂。

剂型应为呈水包油包水型(w/o/w)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，应不破乳，并且管底析出的水相应不多于0.5ml。

黏度按《中国兽药典》(中国兽药典委员会编，中华人民共和国兽药典，2015年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录进行测定，应符合规定。

(2)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

(3)安全检验用体重350～450g健康豚鼠2只，各皮下注射疫苗2.0ml，观察10日，应全部健活。

(4)效力检验

按《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部)附录中气肿疽灭活疫苗的标准进行，具体如下：

用体重350～450g健康豚鼠6只，取其4只，肌肉注射疫苗1.0ml，剩余2只作注射对照疫苗。免疫后21日，取4只免疫组豚鼠和2只对照组豚鼠，分别肌肉注射培养24h的气肿疽梭菌强毒菌液至少0.2ml，观察10d。对照组豚鼠应于72h内全部死亡，免疫豚鼠应至少保护3只。

实施例

以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。

实施例1——大肠埃希氏菌bl/ma株的构建、表达及鉴定

1.基因合成

本申请根据根据根据气肿疽flia(c)(序列1)和ccta(序列3)的天然基因序列，经密码子优化后，将含有flia(c)的编码基因和含有ccta的中间区域(第56位～第222位氨基酸)的编码基因进行串联。同时，在串联基因的3’端添加纯化所用氨基酸标签编码序列，用化学合成的方法，合成该段基因序列gfliacctan(序列5)。氨基酸序列详见序列6。

序列1

序列3

序列5

序列6

2.重组融合蛋白表达载体的构建

以人工合成的gttc-tcnαnc为模板，采用引物对1f/1r(序列7/序列8)进行pcr扩增。

其中上游引物1f序列为：

5’-ggcatatggcaggcaaatctatg-3’23(序列7)，其5’端引入限制性内切酶ndeⅰ位点及保护性碱基；

下游引物1r序列为：

5’-ggaagcttttagtggtgatg-3’20(序列8)，其5’端引入限制性内切酶hindiii位点及保护性碱基。

pcr体系为：5×primebuffer(mg2+plus)10μl，dntps4μl，上、下游引物各1μl，primehs聚合酶1μl，dna模板2μl，补充ddh2o至50μl体系。pcr反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共33个循环；最后72℃环延伸10min。

扩增得到的目的dna条带，经回收后，采用ndeⅰ/hindiii双酶切消化，与经过相同酶切消化的pet30a载体连接，得到插入gfliacctan的阳性克隆pet30a-gfliacctan。

3.表达rfliacctan的基因工程菌株的构建

将提取得到的质粒，转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经pcr鉴定，含有目的dna片段后，命名为大肠埃希氏菌bl/ma株，并加入等体积的50％甘油lb，-70℃冻存,该菌株已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：cgmccno.17319。

实施例2——rfliacctan的表达和鉴定

1.rfliacctan的表达

将大肠埃希氏菌(e.coli)bl/ma株接种于4ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，置于37℃，当od600为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mm的iptg溶液分别置于37℃和15℃诱导培养4h和16h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体温重加10ml裂解液[0.02mol/ltris缓冲液(ph值7.2)，0.3mol/lnacl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400w。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心10min，收集上清。取30μl上清加入10μl的4×sds-page上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％sds-page电泳，结果见图1。从图1可以看出，在15℃的条件下，rfliacctan大量存在于菌体裂解液的上清中，呈可溶性表达，约占目的蛋白总表达量的30％。rfliacctan的最适诱导表达条件为15℃，诱导表达16h。

2.rfliacctan的鉴定

采用上述步骤中诱导条件下的rfliacctan，采用抗his抗体，对其进行westernblot鉴定，结果见图2。从图2可知，15℃、16h诱导的细胞裂解上清中，rfliacctan表达量最高。由于细胞裂解上清中呈可溶性表达的重组融合蛋白，空间结构与野生型蛋白最为接近。综合sds-page和westernblot鉴定结果，进一步确定目的蛋白的最适诱导表达条件为15℃，诱导表达16h。

实施例3——rfliacctan的纯化

将大肠埃希氏菌bl/ma株接种于1l含有卡那霉素的lb液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养od600为0.6～0.8时，将温度降至15℃，加入终浓度为0.5mm的iptg溶液诱导培养16h。菌液培养完成后，以5000r/min离心5min收集菌体，按每克菌体湿重加10ml裂解液(ph值7.20.02mol/ltris缓冲液，0.3mol/lnacl)的比例重悬菌体，4℃条件下用低温高压均质机以800bar的压力破碎菌体3次。裂解液经4℃10000r/min离心30min，收集上清液。按照ni-ida亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的rfliacctan进行纯化。如图3所示，收集纯度较高的6-7泳道的洗脱液，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的目的蛋白rfliacctan。

实施例4——rfliacctan对小鼠的毒力试验

通过测定rfliacctan对小鼠的毒力，以验证该重组融合蛋白在体内是否有毒性。将纯化的rfliacctan分别10μg、50μg和100μg三个剂量，经尾静脉接种16～18g的icr小鼠，每剂量注射5只，0.2ml/只。结果接种以上三种剂量的小鼠均健活且无不良反应。该结果表明，rfliacctan在小鼠体内是无毒的，被确定为无毒重组融合蛋白。

实施例5——重组融合蛋白的免疫效果检测

对纯化的蛋白进行蛋白含量检测：用bca法检测蛋白含量(piercetmbcaproteinassaykit，tg268883)，获得的纯化蛋白rfliacctan的浓度可达0.76mg/ml。将双相油佐剂(如206佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30min，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用pbs(ph值7.20.01mol/l)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(v/v)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装，最终制成浓度为50μg/ml的疫苗。同时，用同样剂量的pbs与佐剂混匀，作为对照疫苗。

对分装后的亚单位疫苗按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录进行以下检验：

(1)性状

外观为乳白色乳剂。

剂型为呈水包油包水型(w/o/w)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，不破乳，并且管底析出的水相应不多于0.3ml。

黏度按《中国兽药典》附录进行测定，符合规定。

(2)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，无细菌生长。

(3)安全检验用体重350～450g健康豚鼠2只，各皮下注射疫苗2.0ml，观察10日，2/2健活。

(4)效力检验

按《中国兽药典》附录中气肿疽灭活疫苗的标准进行，具体如下：

用体重350～450g健康豚鼠6只，取其4只，肌肉注射疫苗1.0ml，剩余2只作注射对照疫苗。免疫后21日，取4只免疫组豚鼠和2只对照组豚鼠，分别肌肉注射培养24h的气肿疽梭菌强毒菌液0.3ml，观察10d。对照组豚鼠在48h内2/2死亡，免疫豚鼠在10d后仍4/4存活。

因此，本发明生产的rfliacctan，在抗原含量低至50μg/只的情况下，免疫后的豚鼠能够抵抗致死性气肿疽梭菌强毒菌液的攻击。

序列表

<110>中国兽医药品监察所

<120>一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>429

<212>dna

<213>气肿疽梭菌鞭毛蛋白(clostridiumchauvoeiflagellum)

<400>1

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<210>2

<211>143

<212>prt

<213>气肿疽梭菌鞭毛蛋白(clostridiumchauvoeiflagellum)

<400>2

alaglylyssermetglulysleuserserglyleuargileasnarg

151015

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202530

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

<210>3

<211>954

<212>dna

<213>气肿疽梭菌细胞毒素a(clostridiumchauvoeiflagellum)

<400>3

atgataaaaagaatattaatgcttgctttagcaacaacaactatatttagcttaacttta60

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gagtctttcatacttaattggaaaaaccatactgttgagcatgcaggatattaa954

<210>4

<211>317

<212>prt

<213>气肿疽梭菌细胞毒素a(clostridiumchauvoeicytotoxinccta)

<400>4

metilelysargileleumetleualaleualathrthrthrilephe

151015

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202530

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354045

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65707580

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

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290295300

leuasntrplysasnhisthrvalgluhisalaglytyr

305310315

<210>5

<211>1704

<212>dna

<213>气肿疽梭菌鞭毛蛋白和细胞毒素a融合蛋白(clostridiumchauvoeigfliacctan)

<400>5

catatggcaggcaaatctatggagaaactgagcagcggtctgcgtatcaaccgtgctggc60

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caccaccaccatcactaaaagctt1704

<210>6

<211>565

<212>prt

<213>气肿疽梭菌鞭毛蛋白和细胞毒素a融合蛋白(clostridiumchauvoeigfliacctan)

<400>6

hismetalaglylyssermetglulysleuserserglyleuargile

151015

asnargalaglyaspaspalaalaglyleualaileserglulysmet

202530

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354045

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65707580

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530535540

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545550555560

hishishishishis

565

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工合成引物(1f)

<400>7

ggcatatggcaggcaaatctatg23

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工合成引物1r(1r)

<400>8

ggaagcttttagtggtgatg20