VbMYB基因及其编码蛋白与应用的制作方法

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种正调控花色苷合成的乌饭vbmyb基因及其编码蛋白与应用。

背景技术：

乌饭（vacciniumbracteatumthunb.）为杜鹃花科多年生常绿灌木，广泛分布于我国南方各省区的丘陵地带或海拔400～1400m的山坡林内或灌木丛，其果、根和叶均具有很高的药用价值，是一种具有很有开发利用前景的野生果树。乌饭树果实富含多种营养成分，具有抗衰老、抗氧化、抗癌防癌、抗菌抗病毒等功能。我们研究发现乌饭果实具有很强的花色苷合成和积累能力（每100g成熟乌饭果实含有500mg以上花色苷）。

花色苷合成主要受myb、bhlh和wd40等转录因子协同调控。其中，myb是调控花色苷合成的关键转录因子。鉴定出参与乌饭果实花色苷生物合成调控的myb转录因子，对于阐明乌饭果实花色苷合成调控机制具有重要意义，同时也可为其他植物的基因工程改良提供优异的基因资源，具有重要的理论和应用价值。然而，乌饭果实花色苷生物合成调控因子myb未见报道。

技术实现要素：

本发明从乌饭中获得vbmyb基因，构建vbmyb基因重组表达载体，构建带有vbmyb基因的工程菌株，目的在于提供一种正调控花色苷合成的乌饭vbmyb基因及其编码蛋白与应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

乌饭vbmyb基因，所述基因的核苷酸序列为seqidno:1。

所述基因编码的氨基酸序列为seqidno:2。

制备含有乌饭vbmyb基因的重组表达载体pcambia1302-vbmyb。

制备含有乌饭vbmyb基因的基因工程菌gv3101-vbmyb。

进一步地，将乌饭vbmyb基因应用于植物花色苷生物合成的基因工程和育种中。

本发明的优点在于：

本发明提供一种来源于乌饭的一种正调控花色苷合成的乌饭vbmyb基因核苷酸序列、编码蛋白及含有该基因的重组质粒和重组基因工程菌，本发明可应用于基因工程育种，用于培育花色苷含量改变的培育植物新品种。

附图说明

图1为乌饭vbmyb基因对烟草叶片积累花色苷的影响。

具体实施方式

实施例1乌饭vbmyb基因克隆

通过比较转录组学手段从乌饭果实中发现一个表达量与乌饭果皮花色苷积累呈正相关的基因，命名为vbmyb。以成熟的乌饭果实为材料进行rna提取和cdna合成。以特异引物对vbmyb18-f1：ggcagcttacatgaaaattctcc和vbmyb18-r1：caaacaaagaaatgcttgccg，进行pcr扩增获得vbmyb。pcr反应体系为50μl，成分包括为：i-5tm2xhigh-fidelitymastermix25μl，上下游引物(10μm)各2μl，cdna1μl，h2o20μl。pcr程序为：90℃预变性3min，35个循环的98℃15s，56℃15s和72℃20s，72℃5min。

vbmyb基因序列如下：

ggcagcttacatgaaaattctccatgtgcttattaagttgcatgattcaattaaagggtgctaccgtgctacgttggtacatgattaggaaaatggacagagttccattaggagtgagaaagggtacttggactaaggaagaagactgtcttctcaagaagtgcattgagaagcatggagaggggaagtggcaccaagttccttacaaagcaggattgaatagatgcaggaaaagttgtaggctgagatggttgaattatctgaggccaaatataaagagaggaaattttactgtggatgaaattgatctcattatcaggcttcataagctcctgggcaatagatggtcgttaattgcgggtagacttccaggaagaacatcgaacgacgtgaaaaattactggaatacccatctaaaagggaaatcgacggaccaaagtagagaggtacagaaatctaaaacgaccccgaatacgactgaaaggaccacaatcatacggcctcgaccacaaaccttctccaaaaatcaacatgttttgatgggtagtactgtcattgcagataatattcaaacaagagatccaaatctctcgaacccatcccaaacacaaccaccgggggatgatgatggaacattgtggtgggatgacatgttgttcaattatgaaattagcagagatatgatgacgtggaccaatgacggagcaaatgaggaggccatgatggtggataaccgtgaagaagcaaaatcaggtacacaaggagctggtggggatcattacagttgtgttcaagaagatcagaatgattggagtaacatttttatggataatgtggacctttgggatattttaggtgatgaacaagcagtactgtaatgtttagcatttctctggaataattagtatccgtcgatttttacgctttatgatttgtataaacaaaactagtttacgccaccgtacacgcatggagtctcctgtttgtgctatttttcagcacattaatgaaaaattctagtagtggcccaaagcccaacttagtgtccatatataagaccttgatatgttctagaattagtagaatggaaaaccctgttcgtgcgtctcaatcccgagagccagcggcaagcatttctttgtttg

氨基酸序列：

mcllscmiqlkgatvlrwymirkmdrvplgvrkgtwtkeedcllkkciekhgegkwhqvpykaglnrcrkscrlrwlnylrpnikrgnftvdeidliirlhkllgnrwsliagrlpgrtsndvknywnthlkgkstdqsrevqkskttpntterttiirprpqtfsknqhvlmgstviadniqtrdpnlsnpsqtqppgdddgtlwwddmlfnyeisrdmmtwtndganeeammvdnreeaksgtqgaggdhyscvqedqndwsnifmdnvdlwdilgdeqavl

实施例2含vbmyb基因的重组质粒和重组基因工程菌的制备

利用特异引物对：acgggggactcttgacatgtgcttattaagttgcatgattc(划线部分为ncoi酶切位点)和attcgagctggtcaccttacagtactgcttgttcatcacc（划线部分为bsteii酶切位点），以实施例1中获得的产物为模板进行pcr反应，pcr反应体系为50μl，成分包括为：i-5tm2xhigh-fidelitymastermix25μl，上下游引物(10μm)各2μl，模板dna1μl，h2o20μl。pcr程序为：90℃预变性3min，35个循环的98℃15s，56℃15s和72℃20s，72℃5min。。将获得的pcr产物回收后，采用aidlabonestepseamlesscloningkit将目的片段连接到经ncoi和bsteii酶切的pcambia1302载体中，测序验证，获得含vbmyb基因的重组质粒。然后将阳性质粒导入农杆菌菌株gv3101中，获得含vbmyb基因的重组基因工程菌，即含有超量表达载体的农杆菌菌株gv3101-vbmyb。

实施例3基因功能验证

选择烟草叶片验证vbmyb基因功能。

1、实验方法：用注射缓冲液（含10mmmes,10mmgcl2,100μm乙酰丁香酮）将gv3101-vbmyb、gv3101-psmyb10.1（申请号201811595512.1）和gv3101-psbhlh（申请号201811595512.1）重悬至od600为0.7，并在室温条件下静置4h。

将gv3101-vbmyb和gv3101-psmyb10.1分别与gv3101-psbhlh菌液等体积混合。随后，选取长势优良普通烟草，以叶片中心叶脉为分界线，用无针头注射器将gv3101-vbmyb、gv3101-psbhlh、gv3101-psmyb10.1+gv3101-psbhlh或gv3101-vbmyb+gv3101-psbhlh菌液注射在叶片两侧，烟草于14h:10h光暗周期、24℃和70％空气湿度的条件下培养13天。

2、实验结果：

分析结果如图1显示，注射gv3101-vbmyb、gv3101-psmyb10.1+gv3101-psbhlh或gv3101-vbmyb+gv3101-psbhlh农杆菌的烟草叶片均积累花色苷，着紫红色。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，与vbmyb的dna序列具有90％以上同源性的dna分子、由该蛋白衍生的蛋白的经过一个或几个氨基酸残基的改变蛋白质、含有vbmyb基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌及其他依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院果树研究所

<120>vbmyb基因及其编码蛋白与应用

<130>6

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1145

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggcagcttacatgaaaattctccatgtgcttattaagttgcatgattcaattaaagggtg60

ctaccgtgctacgttggtacatgattaggaaaatggacagagttccattaggagtgagaa120

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aaattgatctcattatcaggcttcataagctcctgggcaatagatggtcgttaattgcgg360

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aaaggaccacaatcatacggcctcgaccacaaaccttctccaaaaatcaacatgttttga540

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attatgaaattagcagagatatgatgacgtggaccaatgacggagcaaatgaggaggcca720

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acagttgtgttcaagaagatcagaatgattggagtaacatttttatggataatgtggacc840

tttgggatattttaggtgatgaacaagcagtactgtaatgtttagcatttctctggaata900

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tagaatggaaaaccctgttcgtgcgtctcaatcccgagagccagcggcaagcatttcttt1140

gtttg1145

<210>2

<211>284

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metcysleuleusercysmetileglnleulysglyalathrvalleu

151015

argtrptyrmetilearglysmetaspargvalproleuglyvalarg

202530

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354045

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505560

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245250255

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260265270

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275280

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggcagcttacatgaaaattctcc23

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

caaacaaagaaatgcttgccg21

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列

<400>5

acgggggactcttgacatgtgcttattaagttgcatgattc41

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<212>dna

<213>人工序列

<400>6

attcgagctggtcaccttacagtactgcttgttcatcacc40