甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测方法与流程

本发明涉及一种检测人体组织样品中的甲型流感病毒(flua)和乙型流感病毒(flub)的方法。具体来说，针对flua，本发明提供用于检测甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9中的至少一种的引物、探针和其它相关试剂。针对flub，本发明提供用于检测乙型流感病毒的引物、探针和其它相关试剂。
背景技术：
：流感在全世界的局部暴发或流行病中是常见的。流行病随时都有可能出现，但通常集中在高湿度的月份。它们突然发生，几乎没有预兆。受影响的人数可能从几百到几十万不等。流行病可能是短暂的，持续几天或几周，但是更大的流行病则可持续几个月。虽然流感在大多数个体中是一种轻度疾病，但它对老年人或虚弱的个体来说却会危及生命。流行病导致了生产力的巨大损失。世界卫生组织(who)委托建立了一个国际通信实验室网络，以监测传染性病毒中的抗原变化和感染的传播。根据世界卫生组织的调研和数据，甲型和乙型流感病毒占流感检测的大多数。人类甲型和乙型流感病毒几乎每年冬天都会在北美、东亚和东南亚造成季节性疾病流行。丙型流感感染通常会引起轻度呼吸道疾病，并且认为不会引起流行病。丁型流感病毒只会影响牛，并且未发现它会感染人或给人带来疾病。基于病毒表面上的以下两种蛋白质，将甲型流感病毒分成各种亚型：血凝素(h)和神经氨酸酶(n)。有18种不同的血凝素亚型和11种不同的神经氨酸酶亚型。甲型流感病毒可以进一步分解成不同的病毒株。甲型流感病毒属于正粘病毒科(orthomyxoviridae)的正粘病毒属，这是一种具有螺旋对称性的ssrna包膜病毒。甲型流感病毒的基因组是分段的，具有8个rna片段。甲型流感病毒上存在四种抗原，即血凝素(ha)、神经氨酸酶(na)、核衣壳(np)和基质(m)蛋白。na是一种类型特异性抗原，以a、b和c三种形式存在，为人类流感病毒的分类提供了基础。基质蛋白包围核衣壳并占颗粒质量的35-45％。ha介导病毒对细胞受体的附着。神经氨酸酶分子在包膜中以较少的数量存在。甲型流感病毒是人类季节性流感的主要成员，能够感染所有年龄的人并引起甚至可能导致死亡的严重疾病。季节性流感是由甲型流感病毒引起的一种重要的全球人类呼吸道疾病，一年四季普遍存在于热带地区，而温带地区主要发生在冬季，具有一定的季节性流行病特征。目前存在两种甲型流感病毒亚型在人类中传播，其可导致全球大流行性感染，即h1n1和h3n2。此外，h5n1和h7n9也被认为是重要的亚型，因为在人类中，h5n1和h7n9感染可能引起严重的疾病并且具有高死亡率。乙型流感病毒是病毒科正粘病毒科中的另一个属。乙型流感病毒基因组长14548个核苷酸并由8段线性负义单股rna组成。分成多部分的基因组被衣壳化，每段处于单独的核衣壳中，并且核衣壳被一个包膜包围。乙型流感病毒不分亚型，但可以进一步分解为谱系和病毒株。目前，基于表面糖蛋白血凝素的抗原性质，乙型流感病毒存在两种共循环谱系。这些谱系被称为乙型/山形(yamagata)/16/88样病毒和乙型/维多利亚(victoria)/2/87样病毒。乙型流感病毒的衣壳被包膜包裹，而其病毒粒子则由包膜、基质蛋白、核蛋白复合物、核衣壳和聚合酶复合物组成。甲型和乙型流感病毒感染通过呼吸道飞沫传播。病毒颗粒与呼吸道上皮细胞结合，后者富含病毒受体。存在于病毒颗粒上的神经氨酸酶通过释放已经被上皮细胞表面上存在的粘液结合的病毒颗粒来帮助感染过程。流感的典型症状出现在感染后，并且包括明显的发烧、头痛、畏光、颤抖、干咳、不适、肌痛和喉咙干痒。发烧是连续的，持续3天左右。虽然乙型流感病毒的症状和治疗与甲型流感病毒的症状和治疗相似，但乙型流感病毒引发严重并发症的几率低于甲型流感病毒。甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9都是高度传染性的并且能够引起严重的并发症。其中一种甲型流感亚型h5n1特别受到关注，因为它比其它甲型流感亚型和乙型流感病毒更快地发生突变，已被证实具有高致病性，会在男性中引起严重疾病。因此，为了实时监测突变，重要的是区分甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9与乙型流感病毒。现如今存在可用于检测甲型和乙型流感病毒的rna的rt-pcr分析，其提供最大的灵敏度和特异性。此外，可以对pcr产物进行测序以进行病毒株鉴定。最敏感和最受欢迎的样本是鼻咽拭子。然而，考虑到在获取鼻咽拭子时所涉及的困难，咽拭子和鼻拭子更为常用。鉴于上述情况，有必要开发一种具有高准确度和高稳定性的分析，用于同时检测可疑样品中的甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9中的至少一种和乙型流感病毒。技术实现要素：本发明的目的是提供一种检测方法，用于检测可疑样品中甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9的基质基因(下文称“m基因”)的存在，以及用于同时检测可疑样品中乙型流感病毒的非结构基因(下文称“ns基因”)的存在。更确切地说，如果可疑样品含有甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9中的至少一种，那么本发明将检测到这至少一种亚型。如果可疑样品含有乙型流感病毒的至少一种病毒株，那么本发明将检测到这至少一种病毒株。另外，如果可疑样品含有甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1中的至少一种和乙型流感病毒，那么本发明将分别检测到这些。具体来说，本发明的目的是提供指定的引物和探针，用于分别检测可疑样品中甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9以及乙型流感病毒的存在。指定的探针和引物对甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9以及乙型流感病毒具有特异性。此过程中也包括具有核酸外切酶水解能力的模板依赖性聚合酶。根据本发明，此目的通过一种检测可疑样品中甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9中的至少一种和/或乙型流感病毒的存在的方法来达成，所述方法包含以下步骤：(a)提供怀疑含有甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9的m基因和/或乙型流感病毒的ns基因的样品；(b)提供对甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9的m基因具有特异性的一对引物，其包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自下组：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8；并且所述反向引物选自下组：seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17和seqidno:18；(c)提供对乙型流感病毒的nb基因具有特异性的一对引物，其包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自下组：seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25；并且所述反向引物选自下组：seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35和seqidno:36；(d)用逆转录酶和模板依赖性聚合酶扩增可疑样品中所含的核酸；(e)在步骤(d)期间，将两个不同探针与可疑样品中所含的核酸退火，形成杂交产物，其中对甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9具有特异性的第一探针选自下组：seqidno:9和seqidno:10；并且对乙型流感病毒具有特异性的第二探针选自下组：seqidno:27和seqidno:28；以及(f)检测由rt-pcr产物产生的两个不同信号，分别作为甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9和/或乙型流感病毒的靶核酸的存在的指示。根据本发明，由杂交产物产生的信号可以通过荧光检测系统检测。两个不同信号中对第一探针具有特异性的一个信号指示甲型流感亚型h1n1、n3n2、h5n1和/或h7n9的存在，而对第二探针具有特异性的另一个信号指示乙型流感病毒的存在。提供此
发明内容是为了简要地标识本发明的一些方面，这些方面将在下面的具体实施方式中进一步加以描述。此
发明内容不旨在标识本公开的关键或必要特征，也不旨在限制任何权利要求的范围。术语“方面”将被理解为是“至少一个方面”。上文所描述的方面和本文中所描述的本公开的其它方面通过示例的方式示出，并且不限于附图。附图说明图1展示了4种甲型流感亚型的m基因引物序列区域。图2展示了实施例1的动力学pcr生长曲线。图3展示了实施例2的动力学pcr生长曲线。图4展示了实施例3的动力学pcr生长曲线。图5展示了实施例4的特异性测试结果。具体实施方式以下仅说明本发明的原理。因此，应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种布置，这些布置虽然未在本文中明确描述或示出，但体现了本发明的原理并被包括在其精神和范围之内。此外，本文中所叙述的所有实例和条件语言主要明确地旨在仅用于教学目的以辅助读者理解本公开的原理和由发明人所提供的概念以深入该领域，并且应被理解为不限于这些具体叙述的实例和条件。此外，本文中叙述本公开的原理、方面和实施例以及其特定实例的所有陈述都打算涵盖其结构和功能等效物。另外，这些等效物旨在包括当前已知的等效物以及未来将被开发的等效物，即，任何后来被开发的执行相同功能的要素，无关结构。除非本文另有明确说明，否则附图未按比例绘制。为了确保该方法可以成功地开展，本发明提供了一种pcr或实时pcr分析，以便使用具有缀合的小沟结合物(minorgroovebinder，mgb)配体的taqman探针进行快速鉴定。在此类分析中，用不同的荧光报道分子标记类型特异性探针确保了类型特异性荧光的检测。在此分析中施加的taq聚合酶是具有核酸外切酶水解功能的dna依赖性聚合酶。通过荧光报道分子的片段的数量来检测荧光信号，所述荧光报道分子的片段通过dna依赖性聚合酶的核酸外切酶水解从与靶核酸杂交的探针上切割下来。引物和/或探针包含经过修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。目前，h1n1和h3n2是两种常见的甲型流感亚型，其导致在人类中传播的全球大流行性感染。另一方面，尽管h5n1和h7n9是不常见的甲型流感亚型，但它们极有可能在人类中引起严重疾病并导致高死亡率。因此，尽早检测这四种甲型流感亚型非常重要，以便尽早开始治疗。此外，由于这四种亚型都很重要，因此不需要将它们中的任何一种与可疑样品中的其它亚型区分开来。本发明公开了一种检测为所有四种甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9所共有并存在于其中的特定序列的方法。如果本发明对可疑样品的检测结果是阳性的，那么意味着存在至少一种亚型。然后可以开始早期治疗。m基因(seqidno:1)存在于甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9中，并且以二聚体的形式被转译成位于病毒包膜下方的基质蛋白(下文称为“m蛋白”)，并与病毒核糖核蛋白(viralribonucleoprotein，vrnp)复合物相互作用，从而在内核组分与膜蛋白之间形成桥梁。vrnp携带宿主范围的决定子。m蛋白与病毒rna和vrnp接触，从而促进rnp复合物的形成并引起rnp与核基质的解离。m基因通过将病毒组分募集到组装位点而在组装过程中起重要作用，并且在包括病毒颗粒的形成的芽殖过程中起必不可少的作用。靶向m蛋白以赋予交叉亚型保护作用的新型疫苗已被证明是有希望的。因此，鉴于m基因存在于甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9中，本发明中所公开的所有引物和探针全都选自所有四种亚型的m基因并对其具有特异性，如图1中所示。更确切地说，用于检测甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9的正向引物选自以下群组：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8；并且反向引物选自以下群组：seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17和seqidno:18。探针是seqidno:9和seqidno:10的群组中的一个，其也对m基因具有特异性。荧光信号的存在指示样品中的甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9。ns基因存在于甲型流感病毒和乙型流感病毒中，所述病毒在复制阶段表达ns蛋白。然而，乙型流感病毒的ns基因的独特生物活性表现为其抑制前体mrna加工的缺陷和与甲型流感病毒的ns基因的<20％序列一致性。ns蛋白是在乙型流感病毒中发现的同源二聚体rna结合蛋白，它是病毒复制的必需因子。在复制阶段期间，ns蛋白结合mrna的poly-a尾部以使其保持在细胞核中。鉴于乙型流感病毒的ns基因(seqidno:19)在乙型/山形/16/88样和乙型/维多利亚/2/87样流感病毒中是高度保守的，所以本发明中所公开的对乙型流感病毒具有特异性的引物和探针序列选自ns基因。ms2，一种ssrna噬菌体，通常在初步逆转录过程后用作生物实验和病毒/病原体检测中的内部对照。包括内部对照的应用，其用于监测靶病毒的充分加工和rt-pcr反应中抑制因子的存在，以防止由于抑制或人为错误导致的假阴性结果。因此，在以下实施例中，将ms2作为内部对照添加到含有待检测的甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1、h7n9和/或b型流感病毒的检测管中。由逆转录产生的ms2的全长互补dna如由seqidno:37所表示。使用taqman探针的本发明比传统方法灵敏，其中本发明的检测限(下文称为lod)对于甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9以及乙型流感病毒可达到101个拷贝。因此，本发明适合甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9以及乙型流感病毒的快速且明确的检测。在本发明的一个实施例中，提供了一系列用于测试已知浓度(病毒颗粒拷贝数)样品中的甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9以及乙型流感病毒的lod的步骤，包含以下步骤：(a)从103病毒拷贝数到102和101制备甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9中的至少一种亚型的两个连续单一稀释液，其中这三个连续稀释液含有甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9的m基因；(b)从103病毒拷贝数到102和101制备乙型流感病毒的至少一种亚型的两个连续单一稀释液，其中这三个连续稀释液含有乙型流感病毒的ns基因；(c)提供对甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9的m基因具有特异性的一对引物，其包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自下组：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8；并且所述反向引物选自下组：seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17和seqidno:18；(d)提供对乙型流感病毒的ns基因具有特异性的一对引物，其包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自下组：seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25；并且所述反向引物选自下组：seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35和seqidno:36；(e)将ms2添加到甲型流感病毒和乙型流感病毒的所有连续稀释液中，然后向所有连续稀释液中添加ms2的一对引物作为内部对照，这对引物包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自下组：seqidno:38、seqidno:39、seqidno:40和seqidno:41；并且所述反向引物选自下组：seqidno:43、seqidno:44、seqidno:45和seqidno:46；(f)用逆转录酶和模板依赖性聚合酶扩增甲型流感病毒、乙型流感病毒和内部对照的已知浓度样品中所含的核酸；(g)在步骤(f)期间，将两个不同探针与已知浓度样品中所含的核酸退火，形成杂交产物，其中对甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9具有特异性的第一探针选自下组：seqidno:9和seqidno:10；并且对乙型流感病毒具有特异性的第二探针选自下组：seqidno:27和seqidno:28；(h)在步骤(f)期间，使得对ms2具有特异性的探针退火，形成杂交产物，其中探针序列如seqidno:42所示；以及(i)检测由杂交产物产生的三个不同信号，这三个信号分别作为甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9和/或乙型流感病毒以及内部对照的靶核酸的存在的指示。在本发明的另一个实施例中，提供一种检测一个可疑样品中甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9中的至少一种和/或乙型流感病毒的存在的方法，所述方法包含以下步骤：(a)提供怀疑含有甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9的m基因和/或乙型流感病毒的ns基因的样品；(b)提供对甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9的m基因具有特异性的一对引物，其包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自下组：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8；并且所述反向引物选自下组：seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17和seqidno:18；(c)提供对乙型流感病毒的ns基因具有特异性的一对引物，其包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自下组：seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25；并且所述反向引物选自下组：seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35和seqidno:36；(d)提供ms2和ms2的一对引物作为内部对照，这对引物包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自下组：seqidno:38、seqidno:39、seqidno:40和seqidno:41，并且所述反向引物选自下组：seqidno:43、seqidno:44、seqidno:45和seqidno:46；(e)用逆转录酶和模板依赖性聚合酶扩增可疑样品和内部对照中所含的核酸；(f)在步骤(e)期间，将两个不同探针与可疑样品中所含的核酸退火，形成杂交产物，其中对甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9具有特异性的第一探针选自下组：seqidno:9和seqidno:10；并且对乙型流感病毒具有特异性的第二探针选自下组：seqidno:27和seqidno:28；(g)在步骤(e)期间，使得对所述ms2具有特异性的探针退火，形成杂交产物，其中所述探针序列如seqidno:42所示；以及(h)检测由杂交产物产生的三个不同信号，这三个信号分别作为甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9和/或乙型流感病毒以及内部对照的靶核酸的存在的指示。实施例1甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9的lod在此实施例中使用已知浓度的h3n2颗粒作为甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9的代表。从103拷贝数到102和101拷贝数制备两个连续稀释液。使用具有seqidno:5(f)和seqidno:18(r)的引物扩增甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9的m基因。在此实施例中还使用了具有seqidno:9的探针。所述探针也可以用seqidno:10替换。关于内部对照，使用具有seqidno:39(f)和seqidno:45(r)的引物扩增ms2。在此实施例中还使用了具有seqidno:42的探针。引物和探针序列显示于表1中。表1.引物序列进行扩增并在rochelightcycler96实时系统(罗氏分子系统公司(rochemolecularsystems,inc.))上实时测量和监测扩增。每个反应混合物的体积是20μl，并且在以下条件下扩增：表2.参考样品的扩增条件反应混合物首先在50℃下进行2分钟逆转录。实际扩增反应首先在95℃下孵育2分钟，然后根据以下示意图进行50个循环：95℃1秒→60℃1秒图2显示给定的一对引物、探针以及内部对照的动力学pcr生长曲线。当103、102和101的h3n2颗粒的生长曲线超过阈值时，最初可检测到明确且特定的信号。在这样的条件和引物序列下，检测限可达到101拷贝数。换句话说，如果可疑样品被甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9感染，所有这些亚型都含有m基因序列，那么爬坡曲线(climbingcurve)将显示在动力学pcr生长曲线中。同时，也可检测到ms2信号，作为适当过程的代表。实施例2乙型流感病毒的lod马来西亚(malaysia)2506/2004病毒株是一种乙型/维多利亚/2/87样流感病毒株，在此实施例中被用作乙型流感病毒的两个谱系的代表。从103病毒拷贝数到102和101拷贝数制备两个连续稀释液。使用具有seqidno:22(f)和seqidno:33(r)的引物扩增乙型流感病毒的可疑ns基因。在此实施例中还使用了具有seqidno:28的探针。所述探针也可以替换为seqidno:27。关于内部对照，使用具有seqidno:39(f)和seqidno:45(r)的引物扩增ms2。在此实施例中还使用了具有seqidno:42的探针。引物和探针序列显示于表3中。表3.引物序列进行扩增并在rochelightcycler96实时系统(罗氏分子系统公司)上实时测量和监测扩增。每个反应混合物的体积是20μl，并且在以下条件下扩增：表4.参考样品的扩增条件反应混合物首先在50℃下进行2分钟逆转录。实际扩增反应首先在95℃下培育2分钟，并且然后根据以下示意图进行50个循环：95℃1秒→60℃1秒图3显示给定的一对引物、探针以及内部对照的动力学pcr生长曲线。当103、102和101的马来西亚2506/2004颗粒的生长曲线超过阈值时，最初可检测到明确且特定的信号。在此条件下检测限可达到101拷贝数。换句话说，如果可疑样品被含有ns基因序列的乙型流感病毒感染，那么爬坡曲线将显示在动力学pcr生长曲线中。同时，也可检测到ms2信号以作为适当过程的代表。实施例3甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9以及乙型流感病毒检测本发明公开了一种分别检测四种甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9中的至少一种和/或乙型流感病毒的存在的方法。优选地，本发明不包含样品制备步骤。在从可疑样品(其可以是咽/鼻拭子或鼻咽拭子)纯化或分离出核酸之后，所述核酸含于样品收集缓冲液中。此实施例提供一种检测方法，其用于检测在具有流感样症状的未知患者的可疑样品中甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9的m基因的存在，其中可疑样品的核酸含于样品收集缓冲液中，如上文所提及。同时也检测到乙型流感病毒的ns基因的存在。更准确地说，如果可疑样品含有甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9中的至少一种，那么检测结果将反映出这样一种结果，即在这个可疑样品中至少存在一种甲型流感病毒亚型，不管存在的是这四种亚型中的哪一种。另外，如果可疑样品含有乙型流感病毒的至少一种病毒株，那么本发明也将同时检测到这至少一种病毒株。而且另外，如果可疑样品含有甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9中的至少一种和/或乙型流感病毒，那么这些病毒将会被分别检测到。为检测甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9中的至少一种，使用具有seqidno:5(f)和seqidno:18(r)的引物扩增甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9的m基因。在此实施例中还使用了具有seqidno:9的探针。关于内部对照，使用具有seqidno:39(f)和seqidno:45(r)的引物扩增ms2。在此实施例中还使用了具有seqidno:42的探针。引物和探针序列显示于表1中。为检测乙型流感病毒，使用具有seqidno:22(f)和seqidno:33(r)的引物扩增乙型流感病毒的可疑ns基因。在此实施例中还使用了具有seqidno:28的探针。关于内部对照，使用具有seqidno:39(f)和seqidno:45(r)的引物扩增ms2。在此实施例中还使用了具有seqidno:42的探针。引物和探针序列显示于表3中。进行扩增并在rochelightcycler96实时系统(罗氏分子系统公司)上实时测量和监测扩增。每个反应混合物的体积是20μl，并且在以下条件下扩增：表5.参考样品的扩增条件反应混合物首先在50℃下进行2分钟逆转录。实际扩增反应首先在95℃下孵育2分钟，然后根据以下示意图进行50个循环：95℃1秒→60℃1秒图4显示给定的一对引物、探针以及内部对照的动力学pcr生长曲线。在图4中，检测结果显示，可疑样品含有甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n2和h7n9中的至少一种以及乙型流感病毒。然后用测序程序处理可疑样品，并且结果显示可疑样品含有甲型流感h3n2和乙型流感病毒马来西亚2506/2004。实施例4甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9以及乙型流感病毒的随机检测在此实施例中，提供一种针对本发明的检测特异性的测试。临床检测的特异性是指所述检测能够正确鉴定没有疾病/症状的那些样品的能力。因此，具有100％特异性的检测能够正确地鉴定所有没有疾病/症状的样品。具有80％特异性的检测正确地报告80％没有疾病/症状的样品为检测阴性(真阴性)，但是20％没有疾病/症状的样品被错误地鉴定为检测阳性(假阳性)。为了测试本发明的特异性，在此实施例中提供4个不属于正粘病毒科物种的样品，如下所列。每个物种的tcid50高于1.43*105/ml。表6.4个样品的样品列表no.11型副流感病毒no.22型副流感病毒no.33型副流感病毒no.4人类柯萨奇病毒(coxsackievirus)a16在这4个样品中使用相同的制备程序和扩增条件，包括指定的引物和探针，其分别对甲型流感h1n1、h3n2、h5n1和h7n9(引物：seqidno:5和seqidno:18；探针：seqidno:9)和乙型流感病毒(引物：seqidno:22和seqidno:33；探针：seqidno:28)具有特异性。在此实施例中还使用了ms2颗粒、引物和探针(引物：seqidno:39和seqidno:45；探针：seqidno:42)作为内部对照。进行扩增并在rochelightcycler96实时系统(罗氏分子系统公司)上实时测量和监测扩增。每个反应混合物的体积是20μl，并且在以下条件下扩增：表7.参考样品的扩增条件反应混合物首先在50℃下进行2分钟逆转录。实际扩增反应首先在95℃下孵育2分钟，然后根据以下示意图进行50个循环：95℃1秒→60℃1秒图5显示给定的一对引物、探针以及内部对照的动力学pcr生长曲线。在图5中，这四个样品的检测结果显示，没有样品被检测和识别为是甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1和h7n9，也没有样品被检测和识别为是乙型流感病毒，但能正常检测到每个物种的内部对照。因此，本发明的特异性能够在鉴定甲型流感亚型h1n1、h3n2、h5n1或h7n9以及乙型流感病毒方面达到100％特异性校正。序列表<110>元昌生技医疗私人股份有限公司(credobiomedicalpteltd)单易志(shann,yih-jyh)苏家欣(su,chia-hsin)<120>甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测方法<130>w90050/215426<160>46<170>patentin3.5版<210>1<211>984<212>dna<213>甲型流感病毒<400>1agatgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcgtcccgtcaggccccc60tcaaagccgagatcgcacagagacttgaagatgtctttgctgggaagaacaccgatcttg120aggctctcatggaatggctaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattt180taggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttg240tccaaaatgcccttaatgggaatggggatccaaataacatggacagagcagttaaactgt300atagaaagcttaagagggagataacattccatggggccaaagaaatagcactcagttatt360ctgctggtgcacttgccagttgtatgggcctcatatacaacaggatgggggctgtgacca420ctgaagtggcatttggcctggtatgcgcaacctgtgaacagattgctgactcccagcata480ggtctcataggcaaatggtgacaacaaccaatccactaataagacatgagaacagaatgg540ttctggccagcactacagctaaggctatggagcaaatggctggatcgagtgagcaagcag600cagaggccatggaggttgctagtcaggccaggcaaatggtgcaggcaatgagagccattg660ggactcatcctagctccagtgctggtctgaaagatgatcttcttgaaaatttgcaggcct720atcagaaacgaatgggggtgcagatgcaacgattcaagtgatcctcttgttgttgccgca780agtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtctttttttcaaatgc840atttatcgtctctttaaacacggtctgaaaagagggccttctacggaaggagtaccagag900tctatgagggaagaatatcgaaaggaacagcagaatgctgtggatgctgacgatagtcat960tttgtcaacatagagctggagtaa984<210>2<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>2atgagycttctaaccgaggtcgaaacg27<210>3<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>3ttcgacctcggttag15<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>4cttctaaccgaggtcgaaacg21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>5tcaggccccctcaaagccga20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>6ccrtcaggccccctcaaagc20<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>7ccctcaaagccgagatcg18<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>8atgagycttctaaccgaggtcg22<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>9ttcacgctcaccgtgcc17<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>10tttgtgttcacgctcaccgtgcc23<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>11cgtctacgctgcagtcctcgctcac25<210>12<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>12gcgaggactgcagc14<210>13<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>13ggtcttgtctttagccattccatgagag28<210>14<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>14catggaatggctaaag16<210>15<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>15cgctgcagtcctcgctcac19<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>16cgctgcagtcctcgctcact20<210>17<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>17taatacgactcactatagggcgtctacgctgc32<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>18ctacgctgcagtcctcgctca21<210>19<211>1066<212>dna<213>乙型流感病毒<400>19tgtttagtcactggcaaacagagaaaaatggcgaacaacaacatgaccacaacacaaatt60gaggtgggtccgggagcaaccaatgccaccataaactttgaagcaggaattctggagtgc120tatgaaaggctttcatggcaaagagcccttgactatcccggtcaagaccgcctaaacaga180ctaaaaagaaaattagagtcaagaataaagacccacaacaaaagtgagcctgaaagtaaa240aggatgtcccttgaagagagaaaagcaattggagtaaaaatgatgaaagtactcctattt300atgaatccgtctgctgaaattgaagggtttgagccatactgtatgaacagttcctcaaat360agcaactgtacgaaatacaattggaccgattacccttcaacaccagagaggtgccttgat420gacatagaggaagaaccagaggatgttgatggcccaactgaaatagtattaagggacatg480aacaacaaagatgcaaggcaaaagataaaggaggaagtaaacactcagaaagaagggaag540ttccgtttgacaataaaaagggatatacgtaatgtattgtccttgagagtgttggtaaat600ggaacattcctcaaacaccccaatggatacaagtccttgtcaactctgcatagattgaat660gcatatgaccagagtggaaggcttgttgctaaacttgttgccactgatgatcttacagtg720gaggatgaagaagatggccatcggatcctcaactcactcttcgagcgtctcaatgaagga780cattcaaagccaattcgagcagctgaaactgcggtgggagtcttatcccaatttggtcaa840gagcaccgattatcaccagaagagggagacaattagattggtcacggaagaactttatct900tttaagtaaaagaattgatgataacatactattccacaaaacagtgatagctaacagctc960cataatagctgacatggttgtatcattatcattattagaaacattgtatgaaatgaagga1020tgtggttgaagtgtacagcaggcagtgcttgtgaatttaaaataaa1066<210>20<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>20gatgttgatggcccaactgaaatag25<210>21<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>21ggatgaagaagatggccatc20<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>22aagatggccatcggatcctc20<210>23<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>23ctcaaytcactcttcgagcgtc22<210>24<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>24ccatcggatcctcaaytcactc22<210>25<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>25atgaagaagatggccatcgg20<210>26<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>26ggaggatgaagaagatgg18<210>27<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>27caattcgagcagctgaaa18<210>28<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>28ccaattcgagcagctgaaactgcg24<210>29<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>29caccgattatcacca15<210>30<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>30ctcttctggtgataatcggtgctc24<210>31<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>31ttctggtgataatcggtgctc21<210>32<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>32aaccatgtcagctattatggagctg25<210>33<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>33ggtgataatcggtgctcttgacc23<210>34<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>34tctaattgtctccctcttctg21<210>35<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>35attgtctccctcttctggtg20<210>36<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>36gataatcggtgctcttgacc20<210>37<211>1207<212>dna<213>噬菌体ms2<400>37aatgccatttttaatgtctttagcgagacgctaccatggctatcgctgtaggtagccgga60attccattcctaggaggtttgacctgtgcgagcttttagtacccttgatagggagaacga120gaccttcgtcccctccgttcgcgtttacgcggacggtgagactgaagataactcattctc180tttaaaatatcgttcgaactggactcccggtcgttttaactcgactggggccaaaacgaa240acagtggcactacccctctccgtattcacggggggcgttaagtgtcacatcgatagatca300aggtgcctacaagcgaagtgggtcatcgtggggtcgcccgtacgaggagaaagccggttt360cggcttctccctcgacgcacgctcctgctacagcctcttccctgtaagccaaaacttgac420ttacatcgaagtgccgcagaacgttgcgaaccgggcgtcgaccgaagtcctgcaaaaggt480cacccagggtaattttaaccttggtgttgctttagcagaggccaggtcgacagcctcaca540actcgcgacgcaaaccattgcgctcgtgaaggcgtacactgccgctcgtcgcggtaattg600gcgccaggcgctccgctaccttgccctaaacgaagatcgaaagtttcgatcaaaacacgt660ggccggcaggtggttggagttgcagttcggttggttaccactaatgagtgatatccaggg720tgcatatgagatgcttacgaaggttcaccttcaagagtttcttcctatgagagccgtacg780tcaggtcggtactaacatcaagttagatggccgtctgccgtatccagctgcaaacttcca840gacaacgtgcaacatatcgcgacgtatcgtgatatggttttacataaacgatgcacgttt900ggcatggttgtcgtctctaggtatcttgaacccactaggtatagtgtgggaaaaggtgcc960tttctcattcgttgtcgactggctcctacctgtaggtaacatgctcgagggccttacggc1020ccccgtgggatgctcctacatgtcaggaacagttactgacgtaataacgggtgagtccat1080aatctcagccatgcatcgaggggtacaatccgtatggccaacaactggcgcgtacgtaaa1140gtctcctttctcgatggtccataccttagatgcgttagcattaatcaggcaacggctctc1200tagatag1207<210>38<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>38tggcgcgtacgtaaagtctcct22<210>39<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>39ctggcgcgtacgtaaagtctcc22<210>40<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>40gcgcgtacgtaaagtctcctttctc25<210>41<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>41gcattaatcaggcaacggctctc23<210>42<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>42ccctcaaccggagtttgaagcatg24<210>43<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>43gccagttccgccattgtcg19<210>44<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>44gtcgccag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