一种双生病毒卫星DNA1载体及其育种方法与流程

本发明涉及基因育种技术领域，特别是涉及一种利用双生病毒卫星dna1载体及其育种方法和应用。

背景技术：

双生病毒是单链dna病毒，其在进入寄主细胞后，进行复制与转录。由于双生病毒启动子具有双向性，其能双向转录出双链rna，双链rna在植物细胞内会被rna沉默系统的dcl系列蛋白所识别并切割成大小约为21-24nt的小干扰rnas(sirnas)，sirnas与argonaute(ago)蛋白结合，组成rna诱导的沉默复合体risc。risc携带的sirnas能够特异地与同源的靶标rna结合，诱导转录后的基因水平(ptgs)，病毒载体介导的ptgs称为病毒诱导的基因沉默(vigs)。vigs通过插入一段寄主植物的基因可用于沉默植物的基因，从而研究植物基因的功能。

但是vigs在实际使用过程中存在以下问题：(1)由于vigs靶标寄主基因的mrna，很多基因的本底表达水平很高，造成沉默效率很低；(2)由于vigs依赖于接种病毒于植株成株上，因此不能用于研究参与植物生长发育的早期基因；(3)vigs介导的基因沉默只能用于研究当代植物基因的功能，不能用于研究后代植物基因功能。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种双生病毒卫星dna1载体及其育种方法。本发明是基于病毒诱导的转录水平基因沉默(vitgs)，即通过病毒载体传递sirnas靶标目标基因的启动子区，通过sirnas指导的dna甲基化，使得目标基因启动子区功能受到抑制，目标基因无法转录，从而实现基因失活的目的。

因此，本发明所采用的技术相对于vigs具有以下优点：(1)效率高，通过靶标目标基因的启动子区，直接阻断dna的转录，使目标基因失活；(2)获得新的种质资源，通过收获vitgs靶标目标基因启动子的植株种子，可获得稳定遗传并且失活目标基因的种质资源，可在后代植株中研究目标基因的功能；(3)可以研究烟草植株任何时期表达的基因的功能，通过靶标当代基因的启动子区，获得后代植株可用于分析在不同时期表达基因的功能。

本发明利用双生病毒卫星dna1载体在植物体内特异表达针对目标转基因35s-gfp植株和野生型本氏烟植株的关键启动子序列的sirnas，从而获得35s-gfp失活的转基因植株以及ef1b失活的本氏烟植株，失活ef1b的本氏烟植株提高植物对于双生病毒的抗性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种双生病毒卫星dna1载体，通过分子克隆的方法，插入有35s启动子序列的片段和ef1b启动子序列的片段，其序列分别如seqid：no.1和seqid：no.4所示。

其中，用于扩增35s启动子序列的引物为：35s-pro-f:

cgggatcctgagacttttcaacaaag；35s-pro-r:

ccgctcgagtgtcctctccaaatgaaatgaac，其序列如seqid：no.2-3所示。

其中，用于扩增ef1b启动子序列的引物为：ef1b-pro-f:

cgggatcccaacctggtcataaaccaaatatg；ef1b-pro-r:

ccgctcgagtgtaggtatttggtgggaacaatac，其序列如seqid：no.5-6所示。

利用本发明所述的双生病毒卫星dna1载体的育种方法，包括以下步骤：

(1)根据35s启动子序列片段和ef1b启动子序列片段，设计特异性引物35s-pro-f与35s-pro-r，ef1b-pro-f与ef1b-pro-r；

(2)以35s-gfp本氏烟和野生型本氏烟植物的基因组dna为模板，用特异引物对35s-pro-f/35s-pro-r，ef1b-pro-f/ef1b-pro-r通过pcr方法，获得带有xbai和bamhi酶切位点的pcr产物35s-pro和ef1b-pro；

(3)利用xbai和bamhi分别酶切dna1载体和pcr产物，通过xbai和bamhi酶切位点，构建到病毒载体dna1中，得到重组质粒dna1-35s-pro和dna1-ef1b-pro；

(4)将重组质粒dna1-35s-pro和dna1-ef1b-pro分别电击转化到农杆菌eha105中，得到含重组质粒dna1-35s-pro和dna1-ef1b-pro的eha105农杆菌菌株；

(5)将含dna1-35s-pro和dna1-ef1b-pro的eha105分别与含中国番茄黄化曲叶病毒tylccnv的eha105菌液以1:1的比例混合后，用一次性注射器吸取上述混合液tylccnv+dna1-35s-pro浸润35s-gfp本氏烟叶片背面，吸取tylccnv+dna1-ef1b-pro浸润野生型本氏烟叶片背面；

(6)浸润后的烟草植株放于温室培养：温度为25℃，相对湿度为70％，光周期为16小时光照：8小时黑暗。

(7)接种20天后，观察35s-gfp本氏烟植物中的gfp荧光，紫外灯下，35s-gfp植物为绿色，接种tylccnv+dna1-35s-pro的植物为红色；确定红色的植物，进行留种；对接种tylccnv+dna1-ef1b-pro接种的植物进行ef1b-pro表达水平测定，明确其转录已经下的植株进行留种。

本发明的病毒载体产生的sirnas，能够与寄主植物的dna结合，指导靶标dna甲基化，诱导转录水平的基因沉默(tgs)。基于双生病毒这一特性，本发明在双生病毒卫星dna1载体上插入目标基因的启动子序列，诱发病毒诱导tgs(vitgs)，从而可以特异沉默植物基因的表达，由于dna甲基化介导的转录失活没有改变dna序列，还能够稳定遗传到后代，加之双生病毒不会种传，因此该方法是一种高效的失活烟草基因的育种方法。

利用病毒诱导tgs(vitgs)沉默内源基因是在rna沉默介导dna甲基化的基础上进一步发展，将含有特定靶标基因的启动子序列连接到病毒载体上，产生相应的sirnas，因此能够介导靶标基因的沉默。由于dna甲基化介导的基因沉默能够稳定遗传，因此获得含有特定靶标基因下调或失活的后代植株。为了测试这一技术是否有效，本发明选用35s启动子，发现带有35s启动子的双生病毒卫星dna1(dna1-35s-pro)载体能够有效地抑制gfp的表达，并且后代植物gfp保持失活状态，植物不会发出绿色荧光。

本方法能够快速获得稳定遗传的、靶标基因失活的、无病毒残留的后代植物，可用于研究植物抗病性育种。

本发明利用双生病毒卫星dna1载体失活寄主基因ef1b，获得产生抗双生病毒的后代植株，具有重要的生产意义。目前，还未有关于利用dna1载体获得基因失活的稳定遗传的后代，相比于其他技术，该方法由于以下优点：快速、安全、高效、实用。

相对于转基因的育种过程，本发明能够在短时间获得失活转基因的烟草材料和抗双生病毒的材料，这为烟草育种提供一种新的方法。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的双生病毒卫星dna1载体及其育种方法作进一步说明。

附图说明

图1为tylccnv+dna1和tylccnv+dna1-35s-pro侵染35s-gfp植物30天后的表型图及播种7天和30天后的表型图，该图是在uv灯下进行拍摄；

图2为使用gfp抗体检测gfp蛋白的表达情况(wb:gfp)；样品采集于tylccnv+dna1和tylccnv+dna1-35s-pro侵染35s-gfp植物30天后的新叶。考马斯亮蓝染色的rubisco大亚基作为蛋白上样对照，m为蛋白分子量标准。

具体实施方式

一种利用双生病毒卫星dna1载体失活转基因和内源基因的育种方法，其具体操作如下：

(1)根据35s启动子序列片段和ef1b启动子序列片段(序列分别如seqid：no.1和seqid：no.4所示)，设计特异性引物35s-pro-f与35s-pro-r(其序列如seqid：no.2-3所示)，ef1b-pro-pro-f与ef1b-pro-pro-r(其序列如seqid：no.5-6所示)；

(2)以35s-gfp本氏烟(稳定转入了35s-gfp的本氏烟植株)和野生型本氏烟植物的基因组dna为模板，用特异引物对35s-pro-f/35s-pro-r，ef1b-pro-f/ef1b-pro-r通过pcr方法，获得带有xbai和bamhi酶切位点的pcr产物35s-pro和ef1b-pro；

(3)利用xbai和bamhi分别酶切dna1载体和pcr产物，通过xbai和bamhi酶切位点，构建到病毒载体dna1中，得到重组质粒dna1-35s-pro和dna1-ef1b-pro。

(4)将重组质粒dna1-35s-pro和dna1-ef1b-pro分别电击转化到农杆菌eha105中，得到含重组质粒dna1-35s-pro和dna1-ef1b-pro的eha105农杆菌菌株；

(5)将含dna1-35s-pro和dna1-ef1b-pro的eha105分别与含中国番茄黄化曲叶病毒(tylccnv)的eha105菌液以1:1的比例混合后，用一次性注射器吸取上述混合液tylccnv+dna1-35s-pro浸润35s-gfp本氏烟叶片背面，吸取tylccnv+dna1-ef1b-pro浸润野生型本氏烟叶片背面；

(6)浸润后的烟草植株放于温室培养，培养条件为：温度为25℃，相对湿度为70％，光周期为16小时光照：8小时黑暗。

(7)接种20天后，观察35s-gfp本氏烟植物中的gfp荧光，紫外灯下，35s-gfp植物因为转入gfp为绿色，接种tylccnv+dna1-35s-pro的植物由于35s启动子失活，gfp不再表达，植物中的叶绿素自发荧光为红色；确定红色的植物，进行留种。对接种tylccnv+dna1-ef1b-pro接种的植物进行ef1b-pro表达水平测定，明确其转录已经下的植株进行留种。

(8)播种t1代植物，对于tylccnv+dna1-35s-pro沉默的35s-gfp植株，后代中由于35s启动子失活，gfp不能表达，植物自发为红色荧光，但是pcr能够检测gfp条带；对于tylccnv+dna1-ef1b-pro沉默的本氏烟植株，后代由于ef1b-pro的启动子失活，ef1b-pro不能表达，后代植物表现出对双生病毒的抗性。

图1中a为tylccnv+dna1和tylccnv+dna1-35s-pro侵染35s-gfp植物30天后的表型图，该图是在uv灯下进行拍摄；b为从(a)图中采收的种子，播种后7天和30天后的表型。通过图1可以明显看出tylccnv+dna1由于侵染35s-gfp植物后不会种传，没有影响植物的表型。tylccnv+dna1-35s-pro侵染的35s-gfp植物由于产生针对35s启动子的sirnas，诱导rna指导的甲基化，使得35s-gfp植物由于35s启动子发生甲基化，gfp基因不能表达，所以植物表现出红色，该图是在uv灯下进行拍摄。

图2结果明确表明dna1诱导的gfp表达失活，即由于gfp转录受到了抑制，因此gfp蛋白也就无法翻译出来。说明这个载体从分子的水平抑制gfp基因转录，使其无法翻译成蛋白的功能。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>一种双生病毒卫星dna1载体及其育种方法和应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>346

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgagacttttcaacaaaggataatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctat60

ctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattg120

cgataaaggaaaggctatcattcaagatctctctgccgacagtggtcccaaagatggacc180

cccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagt240

ggattgatgtgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgca300

agacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggaca346

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgggatcctgagacttttcaacaaag26

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccgctcgagtgtcctctccaaatgaaatgaac32

<210>4

<211>417

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caacctggtcataaaccaaatatgtggtcactagcaccaaatattgcagcagtaaactgt60

cgagtgttcaagtcatttccatcaagagaaccaaatctatcaagccactgagttggacta120

ggattttccacctcttctacccactcagatgtcatatctatgtcatcaagttggagggga180

tcttcctccgtaggtttagaaaccaaataccgtgctaacttcagattatagtttatataa240

acaaggtccagaagggtttccttgtcaatcttattgcgcctctcagagtggatttgttga300

aatgtgctccaatgtcgttcaaaagtgaatgtactgcatacctggctaagtattctaatg360

gcgactctctgcaacgtaggagcagcatcaccgtattgttcccaccaaatacctaca417

<210>5

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgggatcccaacctggtcataaaccaaatatg32

<210>6

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ccgctcgagtgtaggtatttggtgggaacaatac34