猪IgA+B细胞类别转换标志物序列及检测方法与流程

本发明涉及一种猪iga⁺b细胞类别转换重组的标志物序列，以及猪iga⁺b细胞类别转换重组的检测方法。

背景技术：

iga⁺b细胞类别转换重组三种关键产物是指b细胞在iga类别转换重组过程中所产生的转录产物：α胚系转录本(αgerm-linetranscripts,αglt)，即iαcα；iga类别转换后转录本α(post-switchtranscriptsα,pstα)，即iμcα和α环形转录本(αcircletranscripts,αct)，即iαcμ。

黏膜免疫应答，尤其是分泌型免疫球蛋白a(siga)对于抵抗病原感染，维持机体健康及微生态平衡具有至关重要的作用。肠道黏膜是人和动物体最大的黏膜组织，肠道派伊尔集合淋巴结(peyer’spatches,pp结)是由小肠黏膜淋巴组织有序集合而成，是肠道黏膜免疫发生及iga抗体产生的主要部位。肠系膜淋巴结(mln)也是肠道重要的免疫组织，对于维持肠道免疫应答有重要作用。

b细胞经抗原刺激后，需要经过抗体类别转换重组(csr)和亲和力成熟(shm)两个重要过程才能形成高亲和力iga⁺b细胞。在iga类别转换重组(igacsr)过程中，编码免疫球蛋白(ig)的重链恒定区的外显子由编码igm的cμ转变为编码iga的cα，而结合抗原的可变区保持恒定。iga抗体类别转换重组起始于一种可诱导的非编码α胚系转录本(αglt)-iαcα的产生，在细胞内高表达的激活诱导的胞苷脱氨酶(aicda,aid)的作用下，基因组sμ和sα转换区dna分别双股断裂，经过断端修复与连接，使原来间隔于sμ和sα的dna序列被切除，形成一个环形产物，由于其上面有启动子(iα)，在降解前短暂编码α环形转录本(αct)-iαcμ；而两个远端转换区序列连接在一起，形成最终的转换重组产物，编码iga类别转换后转录本α(pstα)-iμcα，使b细胞由起初表达的igm抗体变为表达iga抗体。这个过程中，αglt、pstα，尤其是αct是体内外类别转换重组的最直接证据。

目前，黏膜免疫研究多以小鼠为模型，这三种转录产物早已成熟应用于体内外评价iga⁺b细胞类别转换重组。但是，猪的黏膜免疫研究甚少，猪iga⁺b细胞类别转换重组的研究目前仍为空白，研究工具的匮乏很大程度上阻碍了猪黏膜免疫学发展。猪不仅是一种重要的经济动物；也能够作为大动物模型，弥补传统实验动物模型如小鼠、大鼠和兔等小动物的不足，应用于科学研究中。发展和完善研究工具、研究方法对于猪黏膜免疫学的发展进步至关重要。猪αglt、pstα，尤其是αct的检测作为体内外iga⁺b细胞类别转换重组的最直接证据，对于评价猪黏膜免疫应答具有十分重要意义。该方法可用作病原感染、疫苗免疫和各类因子、佐剂对iga⁺b细胞分化和黏膜免疫应答活化情况的评价指标。为发掘和选择有效的黏膜免疫佐剂、疫苗和免疫策略提供依据。

发明目的

本发明提供一种可作为检测猪iga黏膜免疫应答活化情况的标志物，以及检测的方法和可能的用途。

本发明的猪iga黏膜免疫应答活化情况的标志物为：

1)猪α胚系转录本αglt，其基因序列为seqidno.8；

2)猪iga类别转换后转录本α短序列pstα-1，其基因序列为seqidno.9；

3)猪iga类别转换后转录本α长序列pstα-2，其基因序列为seqidno.10；

4)猪α环形转录本αct，其基因序列为seqidno.11。

本发明的猪iga类别转换重组的检测方法是从待检猪的淋巴组织样品中提取rna并反转录，再以所得到的cdna为待检模板，用引物序列seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7进行扩增，根据扩增产物的核酸电泳图中是否出现特定条带对照dna分子量标准确定待检猪待检iga⁺b细胞类别转换重组情况。

引物序列：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6或/和seqidno.7可用于猪iga类别转换重组的检测。

本发明所述的任一标志物序列可在制备用于检测猪iga黏膜免疫活化情况的试剂中的应用。

本发明所公开的引物序列seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7中任一个或其任意的组合可在制备用于评价猪iga黏膜免疫活化情况的试剂中的应用。

附图说明

图1：猪派伊尔集合淋巴结αglt、pstα和αct扩增结果(电泳图)；

图2：猪肠系膜淋巴结αglt、pstα和αct扩增结果(电泳图)；

图3：猪αglt、pstα和αct序列结构图；

图4：猪αglt、pstα和αct扩增方法批内重复检测结果(电泳图)；

图5：猪αglt、pstα和αct扩增方法批间重复检测结果(电泳图)。

具体实施方式

以下结合具体实例和附图说明对本发明做进一步说明

本发明的猪iga类别转换重组的pcr检测方法是先将待检猪的淋巴组织样品通过trizol法或rna提取试剂盒提取rna，取2μgrna加入1μl反转录引物oligo(dt)于65℃水浴锅中孵育5分钟，取出后于冰浴中静置2分钟，之后将混合物加入含有反转录酶、dntp、rna酶抑制剂和反应缓冲液的预混体系，于42℃水浴锅中反转录1小时，70℃加热5分钟使反转录酶失活。以所得到的cdna为待检模板，用本专利提供的引物和反应条件进行扩增，扩增产物以浓度1.5％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，根据扩增产物的核酸电泳图中是否出现特定条带对照dna分子量标准确定待检猪样品中αglt、pstα和αct表达状况。

实施例1.α胚系转录本，α环形转录本和转换后转录本αpcr引物的设计与合成。

利用已知的猪抗体重链区基因组序列(登录号：ab699686和ab699687)和已发表的相关文献，预测基因组上编码igm和iga的重链恒定区(cμ和cα)前的启动子区iμ和iα所在位置。并分别在iμ预测序列上设计引物pf，iα预测序列上设计引物gf和cf1，在cμ序列上设计引物cr1和cr2，在cα序列上设计引物gr和pf。所设计引物由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。七条引物序列和对应的序列编号分别为：

实施例2.反应条件的确定

首先，设置不同的退火温度(54℃-65℃)扩增，筛选αglt和pstα扩增的最适退火温度，通过优化筛选最终确定αglt和pstα的最佳退火温度分别为58℃-61℃和61℃-64℃。

对于αct，首先设置不同的退火温度(54℃-58℃)进行第一轮扩增，用第一轮的产物作为模板，设置不同的退火温度(60℃-65℃)进行第二轮pcr扩增，筛选两轮pcr的最佳退火温度。通过优化筛选最终确定第一、二轮pcr的最佳退火温度分别为54℃-56℃和58℃-61℃。

以最佳退火温度扩增pp结和肠系膜淋巴结中αglt、pstα和αct，结果分别如图1和图2所示。

实施例3.pcr扩增产物的测序。

将3μl的pcr产物与1μlp-lb-simplevector载体混合，在t4dna连接酶及连接缓冲液的作用下，室温连接5分钟。将反应后混合物转化至dh5α感受态细胞中，挑选阳性克隆，提取重组质粒送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序。结果显示αglt产物长度为242bp，其中含有iα区111bp，cα区131bp；pstα有两个产物，分别为251bp和515bp，其中分别含iμ区146bp和410bp，cα区105bp；αct产物长度为359bp，其中含有iα区271bp，cμ区88bp。三种产物结构示意图如图3所示，测序结果如下：

α胚系转录本(αgerm-linetranscripts,αglt)，即iαcα。

seqidno.8：

actccagctcctatgcagcggctgggcagatggacctgcggtgtggggccacaaggcccgagaggcctgggcctctcccagccaccgtggaccctctggcagcttgagcagtgtctgaaaccagccccaaaatcttcccactgactctggggagcagcgagcctgccggatatgtggtcatcgcctgcctggtccgggacttcttcccgtcagagcccctgacagtaacctggagccctagt。

iga类别转换后转录本α短序列(post-switchtranscriptsα,pstα)，即iμcα-1。

seqidno.9：

gcacgattttcagttggcccgcttcccctcgtgattaggacagacgcgggcactctggcccagccgtcttggctcagtatctgcaggcgtccgtctcgggacggagctcaggggaagagcgtgactccagttgaacgtgatagtcgtgtctgaaaccagccccaaaatcttcccactgactctggggagcagcgagcctgccggatatgtggtcatcgcctgcctggtccgggacttcttcccgtcagagc。

iga类别转换后转录本α长序列(post-switchtranscriptsα,pstα-2)，即iμcα。

seqidno.10：

gcacgattttcagttggcccgcttcccctcgtgattaggacagacgcgggcactctggcccagccgtcttggctcagtatctgcaggcgtccgtctcgggacggagctcaggggaagagcgtgactccagttgaacgtgatagtcggtgcgttgagaggagacccagtcgggtgtcgagtcagaaggggcccggggcccgaggccctgggcaggacggcccgtgccctgcatcacgggcccagcgtcctagaggcaggactctggtggagagtgtgagggtgcctggggcccctccggagctggggccgtgcggtgcaggttgggctctcggcgcggtgttggctgtttctgcgggatttggaggaattcttccagtgatgggagtcgccagtgaccgggcaccaggctgtgtctgaaaccagccccaaaatcttcccactgactctggggagcagcgagcctgccggatatgtggtcatcgcctgcctggtccgggacttcttcccgtcagagc。

α环形转录本(αcircletranscripts,αct)，即iαcμ。

seqidno.11：

actccagctcctatgcagcggctgggcagatggacctgcggtgtggggccacaaggcccgagaggcctgggcctctcccagccaccgtggaccctctggcagcttgagcaggtgggtcccagaggctgctcaggcctcagctcctgcacagccaggccacaccggggcctcctgggctggaagcatggaaggaaggcaggtaccaaaacaaggaggaggagaaggaggaaggaggggccctctagccccgaggaccgagggcaggatgaacccagaacatccaggacttcccgtccgtcctgagaggcggcaagtacttggcctcctcccgggtgctcctaccctctgtgagcatcccc。

实施例4.重复性验证

用已确定的方法检测检测pp结αglt、pstα和αct，批内重复性检测为一个样品做3个重复检测，结果如图4所示；批间重复性检测为分三次对样品进行检测，结果如图5所示；表明该检测方法的重复性良好。

本发明提供的基于pcr技术检测猪iga类别转换标志物的方法，可作为猪iga⁺b细胞分化及黏膜免疫应答活化情况的评价。本技术完善了猪iga黏膜免疫应答的评价方法，对猪黏膜免疫学的发展有重要意义。此外，本技术还为评价病原体及疫苗，尤其是黏膜免疫疫苗、佐剂等对机体iga黏膜免疫应答活化情况提供了可靠方法，从而为发掘和选择有效的黏膜免疫佐剂、疫苗和免疫方法提供科学依据。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>猪iga+b细胞类别转换标志物序列及检测方法

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(gf)

<400>1

actccagctcctatgcagcg20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(gr)

<400>2

actagggctccaggttactgt21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(pf)

<400>3

gcacgattttcagttggccc20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(pr)

<400>4

gctctgacgggaagaagtcc20

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(cf1)

<400>5

ctgaggccgcaccaccag18

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(cr1)

<400>6

agatggacacggacttggtg20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(cr2)

<400>7

ggggatgctcacagagggta20

<210>8

<211>242

<212>dna

<213>α胚系转录本(αglt)

<400>8

actccagctcctatgcagcggctgggcagatggacctgcggtgtggggccacaaggcccg60

agaggcctgggcctctcccagccaccgtggaccctctggcagcttgagcagtgtctgaaa120

ccagccccaaaatcttcccactgactctggggagcagcgagcctgccggatatgtggtca180

tcgcctgcctggtccgggacttcttcccgtcagagcccctgacagtaacctggagcccta240

gt242

<210>9

<211>251

<212>dna

<213>iga类别转换后转录本α短序列(pstα-1)

<400>9

gcacgattttcagttggcccgcttcccctcgtgattaggacagacgcgggcactctggcc60

cagccgtcttggctcagtatctgcaggcgtccgtctcgggacggagctcaggggaagagc120

gtgactccagttgaacgtgatagtcgtgtctgaaaccagccccaaaatcttcccactgac180

tctggggagcagcgagcctgccggatatgtggtcatcgcctgcctggtccgggacttctt240

cccgtcagagc251

<210>10

<211>515

<212>dna

<213>iga类别转换后转录本α长序列(pstα-2)

<400>10

gcacgattttcagttggcccgcttcccctcgtgattaggacagacgcgggcactctggcc60

cagccgtcttggctcagtatctgcaggcgtccgtctcgggacggagctcaggggaagagc120

gtgactccagttgaacgtgatagtcggtgcgttgagaggagacccagtcgggtgtcgagt180

cagaaggggcccggggcccgaggccctgggcaggacggcccgtgccctgcatcacgggcc240

cagcgtcctagaggcaggactctggtggagagtgtgagggtgcctggggcccctccggag300

ctggggccgtgcggtgcaggttgggctctcggcgcggtgttggctgtttctgcgggattt360

ggaggaattcttccagtgatgggagtcgccagtgaccgggcaccaggctgtgtctgaaac420

cagccccaaaatcttcccactgactctggggagcagcgagcctgccggatatgtggtcat480

cgcctgcctggtccgggacttcttcccgtcagagc515

<210>11

<211>359

<212>dna

<213>α环形转录本(αct)

<400>11

actccagctcctatgcagcggctgggcagatggacctgcggtgtggggccacaaggcccg60

agaggcctgggcctctcccagccaccgtggaccctctggcagcttgagcaggtgggtccc120

agaggctgctcaggcctcagctcctgcacagccaggccacaccggggcctcctgggctgg180

aagcatggaaggaaggcaggtaccaaaacaaggaggaggagaaggaggaaggaggggccc240

tctagccccgaggaccgagggcaggatgaacccagaacatccaggacttcccgtccgtcc300

tgagaggcggcaagtacttggcctcctcccgggtgctcctaccctctgtgagcatcccc359