一种从籽粒苋籽中夹带提取并超临界分离纯化角鲨烯的方法与流程

本发明涉及食品医药领域，具体涉及一种从籽粒苋籽中夹带提取并超临界分离纯化角鲨烯的方法。

背景技术：

籽粒苋又名千穗谷，属于苋科、苋属一年生草本植物，籽粒苋籽粒中含脂肪含量为5.73%-8.16%（干料），其中不饱和脂肪酸占比70%-80%，籽粒苋籽油中含有珍贵成分角鲨烯，含量约为7%-8%，角鲨烯是一种脂质不皂化物，属于开链三萜，又称鱼肝油萜，具有提高体内超氧化物歧化酶（SOD）活性、增强机体免疫力、改善性能力、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物质，传统方法是从深海鱼肝脏中提取，成本较高，目前从植物中提取角鲨烯成为趋势，但植物中有机物种类较复杂，特别是植物组织通过脱臭工艺后，角鲨烯通常以生育酚-角鲨烯、甾醇-角鲨烯等聚集化合物存在，由于这些组分间性质相似，分离较为困难，因此如何选择适宜的分离工艺将角鲨烯从这些聚集态化合物中分离出来成为重点。

现有技术中个，如公开号CN104086348A，利用角鲨烯本身的双键能与银离子形成络合物从而将其从原料中分离，其缺点是硝酸银成本较高制约了工业化应用，公开号CN204022706U，利用各物质的沸点差异，采用精馏分子或分子蒸馏的方法提纯角鲨烯，其缺点是高温条件下容易引起角鲨烯的氧化。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种从籽粒苋籽中夹带提取并超临界分离纯化角鲨烯的方法，低温提取，保持角鲨烯原有结构，分离提纯的角鲨烯纯度高，产率高，同时对籽粒苋中高附加值产品进行了粗提纯，提高了籽粒苋的综合利用价值。

本发明的技术方案是，提供一种从籽粒苋籽中夹带提取并超临界分离纯化角鲨烯的方法，包括以下步骤：（1）将籽粒苋籽油脱臭得到籽粒苋脱臭馏出物；（2）以生物酶为原料，对所述籽粒苋脱臭馏出物甲酯化并水洗，得到甲酯液滤液；（3）反相柱层析除去所述甲酯液滤液中的脂肪酸甲酯；（4）利用碱性离子交换树脂对所述步骤（3）中产物进行离子交换，除去生育酚；（5）超临界萃取富集所述步骤（4）中产物，得到角鲨烯精油。

优选地，所述生物酶为硅藻土脂肪酶。

优选地，所述碱性离子交换树脂为强碱性阴离子凝胶型交换树脂，所述强碱性阴离子包括季铵基。

优选地，所述步骤（2）中甲酯化温度为35-45℃。

优选地，所述步骤（5）中超临界萃取的夹带剂为乙醇、乙酸乙酯、丙酮中的一种。

优选地，所述步骤（1）中的脱臭方法为水蒸气蒸馏脱臭。

优选地，所述步骤（2）中在水洗步骤后，还包括4℃冷冻所述水洗后的甲酯液12h后冷析抽滤。

优选地，所述步骤（3）中所用柱层析硅胶尺寸为80-100目。

在实际提取角鲨烯过程中，角鲨烯通常以生育酚-角鲨烯、甾醇-角鲨烯等聚集化合物存在，由于这些组分间性质相似，分离较为困难。

本方案利用脱臭馏出物中各物质的物化性质，精选不同工艺，达到对角鲨烯的分离提纯，同时对副产品中高附加值产品进行了粗提纯，提高了籽粒苋的综合利用价值，在甲酯化过程中，传统方法采用化学酯化法，在浓硫酸的催化作用下酯化，该方法既污染环境，同时设备需要耐强腐蚀，而角鲨烯因含6个双键，极其不稳定，易氧化，本方案采用生物酶法甲酯化，如硅藻土脂肪酶，催化水不溶性酯类的水解、酯化，由于生物酶相较于化学酯化法的活性温度低，硅藻土脂肪酶的最优活性温度为35-45℃，植物油角鲨烯大部分随油脂进入脱臭馏出物，甲酯化过程不破化角鲨烯及其他高附加值物的活性及结构且甲酯化程度高，由于甾醇在酯交换或甲酯化过程中，有一定的溶解度，使得分离物中混有甾醇，且甾醇与生育酚分子量接近，通过分子蒸馏难以分离，而冷析法，通过各物质的熔点不同，本方案中甾醇熔点为165-167℃，生育酚熔点2-3℃，角鲨烯熔点为-75℃，经过4℃冷冻12h，最终将甾醇留在滤饼中，生育酚及角鲨烯留在滤液中。

生育酚又名维生素E，含有酚羟基，因而具有一定微弱酸性，角鲨烯为长链烯烃，不具备酸碱性基团，在溶液中显中性，本方案中层析中固定相换成具有碱性的树脂，利用生育酚的弱酸性，当混合溶液通过层析柱时，离子树脂对弱酸性生育酚具有选择性吸附作用，进行离子交换，而对中性的角鲨烯不具有任何暂留效应，因而最终达到对聚集化合物中生育酚的分离作用，而维生素E的酸性极弱，所以采用强碱性阴离子交换树脂，同时考虑到生育酚分子量较大，载体型离子交换树脂利用率较低，故采用凝胶型树脂。

本发明的有益效果在于，有效除去提取过程中以生育酚-角鲨烯、甾醇-角鲨烯聚集化合物中的生育酚、甾醇，这个过程反应条件温和，避免角鲨烯氧化，所得角鲨烯纯度高，提取率高，同时对籽粒苋中高附加值产品进行了粗提纯，提高了籽粒苋的综合利用价值。

附图说明

图1为各实施例中树脂分离能力测试结果；

图2为不同夹带剂对角鲨烯分离能力测试。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

提取籽粒苋籽油：称取100g籽粒苋籽，粉碎至1mm，同时烘干得到籽粒苋籽粉备用；然后用旋转榨油机压榨，得到第一油相和油饼；将所述油饼与50ml石油醚混合，85℃加热回流2h，过滤得到滤液和滤渣，滤液减压蒸馏除去石油醚，所述石油醚循环使用，得到第二油相；合并所述第一油相与第二油相，均匀搅拌得到初榨籽粒苋籽油备用；

水蒸气蒸馏脱臭：将上一步骤中所得的籽粒苋籽油置于水蒸气蒸馏脱臭装置中，启动真空泵，当整个系统绝对压力在100Pa以下时，打开加热器，将油缓缓加热至180℃，然后开启直接蒸汽导管旋塞，通入直接蒸汽，在不引起油飞溅的情况下，调节通气量至最大且流量恒定，保持一段时间后，关闭蒸汽旋塞，将油温调至室温后通入空气，破除真空，最后完成脱臭工艺得到籽粒苋脱臭馏出物；

甲酯化脱臭馏出物 ：将脱臭馏出物溶于200ml石油醚中，加入100ml甲醇，均匀搅拌12h；加入2%，3000U/g的硅藻土脂肪酶放入40℃摇床中反应24h；5000r/min离心3min，除去硅藻土脂肪酶，得到酯化液。

冷析分离甾醇：将酯化液，水洗干燥后，置于4℃冷冻12h，冷析后，抽滤，滤饼即为植物甾醇粗品，收集甲酯液滤液。

反相液液分层层析分离脂肪酸甲酯：将硅胶土Gelite（80目）与装有二氯二甲基硅烷的小烧杯同时放在干燥器中静置2天，如漂浮在水面则说明已硅烷化，用甲醇洗涤至洗液与溴酚蓝指示剂不呈酸性，在110℃干燥4h；将处理后的100g硅藻土装入柱中；将固定相通过柱子直至正好滴出，然后将流动相通过柱子至底部滴出为止；将样品装入柱子中，用流动相进行层析分离，每次定量收集流出液，各脂肪酸流出柱子的顺序是由低碳链到高碳链脂肪酸甲酯。

离子交换树脂分离生育酚：本方案中使用的树脂为美国Amberlite IRA-400q强碱性阴离子交换树脂，在苯乙烯一二乙烯苯共聚基体上带有季铵基，将树脂用水浸泡24h充分溶胀，再将树脂装入吸附柱中，用水淋洗至洗出液不出现白色沉淀为止，用3倍床体积（BV）的5%HCL溶液，以4BV/h的速度淋洗，用去离子洗至pH=6，再用3BV NaOH溶液以4BV/h的速度淋洗，流出液pH=8。取出树脂、抽滤，真空干燥至恒重，待用，将所得甲酯液滤液与无水乙醇，摇匀充分溶解，逐渐滴加入柱中，每隔一段时间，取样分析检测浓度，得到角鲨烯粗油。

超临界萃取富集角鲨烯：将萃取后的角鲨烯粗油放置于超临界萃取设备中进行超临界萃取，流体萃取压力为35MPa，萃取温度35℃，CO2流量为10L/h,萃取时间为3h，其中夹带剂为无水乙醇，用量为乙醇：角鲨烯粗油=5:1，再经超临界二氧化碳萃取，将得到的产物于6℃的环境中冷冻20分钟，再将冷冻后的原液放置于1200r/min的高速冷冻离心机中离心10分钟，除去杂质，放入温度35℃真空箱抽真空5小时，得到高含量角鲨烯精油。

实施例2

提取籽粒苋籽油：称取100g籽粒苋籽，粉碎至1.5mm，同时烘干得到籽粒苋籽粉备用；然后用旋转榨油机压榨，得到第一油相和油饼；将所述油饼与50ml石油醚混合，85℃加热回流2h，过滤得到滤液和滤渣，滤液减压蒸馏除去石油醚，所述石油醚循环使用，得到第二油相；合并所述第一油相与第二油相，均匀搅拌得到初榨籽粒苋籽油备用；

水蒸气蒸馏脱臭：将上一步骤中所得的籽粒苋籽油置于水蒸气蒸馏脱臭装置中，启动真空泵，当整个系统绝对压力在100Pa以下时，打开加热器，将油缓缓加热至180℃，然后开启直接蒸汽导管旋塞，通入直接蒸汽，在不引起油飞溅的情况下，调节通气量至最大且流量恒定，保持一段时间后，关闭蒸汽旋塞，将油温调至室温后通入空气，破除真空，最后完成脱臭工艺得到籽粒苋脱臭馏出物；

甲酯化脱臭馏出物 ：将脱臭馏出物溶于200ml石油醚中，加入100ml甲醇，均匀搅拌12h；加入2%，2000U/g的硅藻土脂肪酶放入45℃摇床中反应24h；5000r/min离心3min，除去硅藻土脂肪酶，得到酯化液。

冷析分离甾醇：将酯化液，水洗干燥后，置于4℃冷冻12h，冷析后，抽滤，滤饼即为植物甾醇粗品，收集甲酯液滤液。

反相液液分层层析分离脂肪酸甲酯：将硅胶土Gelite（100目）与装有二氯二甲基硅烷的小烧杯同时放在干燥器中静置2天，如漂浮在水面则说明已硅烷化，用甲醇洗涤至洗液与溴酚蓝指示剂不呈酸性，在110℃干燥4h；将处理后的100g硅藻土装入柱中；将固定相通过柱子直至正好滴出，然后将流动相通过柱子至底部滴出为止；将样品装入柱子中，用流动相进行层析分离，每次定量收集流出液，各脂肪酸流出柱子的顺序是由低碳链到高碳链脂肪酸甲酯。

离子交换树脂分离生育酚：本方案中使用的树脂为酸性阴离子交换树脂，将树脂用水浸泡24h充分溶胀，再将树脂装入吸附柱中，用水淋洗至洗出液不出现白色沉淀为止，用3倍床体积（BV）的5%HCL溶液，以4BV/h的速度淋洗，用去离子洗至pH=6.5，再用3BV NaOH溶液以4BV/h的速度淋洗，流出液pH=7。取出树脂、抽滤，真空干燥至恒重，待用，将所得甲酯液滤液与无水乙醇，摇匀充分溶解，逐渐滴加入柱中，每隔一段时间，取样分析检测浓度，得到角鲨烯粗油。

超临界萃取富集角鲨烯：将萃取后的角鲨烯粗油放置于超临界萃取设备中进行超临界萃取，流体萃取压力为35MPa，萃取温度35℃，CO2流量为10L/h,萃取时间为3h，其中夹带剂为乙酸乙酯，用量为乙酸乙酯：角鲨烯粗油=5:1，再经超临界二氧化碳萃取，将得到的产物于6℃的环境中冷冻20分钟，再将冷冻后的原液放置于1200r/min的高速冷冻离心机中离心10分钟，除去杂质，放入温度35℃真空箱抽真空5小时，得到高含量角鲨烯精油。

实施例3

提取籽粒苋籽油：称取100g籽粒苋籽，粉碎至1mm，同时烘干得到籽粒苋籽粉备用；然后用旋转榨油机压榨，得到第一油相和油饼；将所述油饼与80ml石油醚混合，85℃加热回流2h，过滤得到滤液和滤渣，滤液减压蒸馏除去石油醚，所述石油醚循环使用，得到第二油相；合并所述第一油相与第二油相，均匀搅拌得到初榨籽粒苋籽油备用；

水蒸气蒸馏脱臭：将上一步骤中所得的籽粒苋籽油置于水蒸气蒸馏脱臭装置中，启动真空泵，当整个系统绝对压力在100Pa以下时，打开加热器，将油缓缓加热至180℃，然后开启直接蒸汽导管旋塞，通入直接蒸汽，在不引起油飞溅的情况下，调节通气量至最大且流量恒定，保持一段时间后，关闭蒸汽旋塞，将油温调至室温后通入空气，破除真空，最后完成脱臭工艺得到籽粒苋脱臭馏出物；

甲酯化脱臭馏出物 ：将脱臭馏出物溶于200ml石油醚中，加入100ml甲醇，均匀搅拌12h；加入2%，4000U/g的硅藻土脂肪酶放入35℃摇床中反应24h；5000r/min离心3min，除去硅藻土脂肪酶，得到酯化液。

冷析分离甾醇：将酯化液，水洗干燥后，置于4℃冷冻12h，冷析后，抽滤，滤饼即为植物甾醇粗品，收集甲酯液滤液。

反相液液分层层析分离脂肪酸甲酯：将硅胶土Gelite（90目）与装有二氯二甲基硅烷的小烧杯同时放在干燥器中静置2天，如漂浮在水面则说明已硅烷化，用甲醇洗涤至洗液与溴酚蓝指示剂不呈酸性，在110℃干燥4h；将处理后的100g硅藻土装入柱中；将固定相通过柱子直至正好滴出，然后将流动相通过柱子至底部滴出为止；将样品装入柱子中，用流动相进行层析分离，每次定量收集流出液，各脂肪酸流出柱子的顺序是由低碳链到高碳链脂肪酸甲酯。

离子交换树脂分离生育酚：本方案中使用的树脂为美国Amberlite IRA-400q强碱性阴离子交换树脂，在苯乙烯一二乙烯苯共聚基体上带有季铵基，将树脂用水浸泡24h充分溶胀，再将树脂装入吸附柱中，用水淋洗至洗出液不出现白色沉淀为止，用3倍床体积（BV）的5%HCL溶液，以4BV/h的速度淋洗，用去离子洗至pH=6，再用3BV NaOH溶液以4BV/h的速度淋洗，流出液pH=7.5。取出树脂、抽滤，真空干燥至恒重，待用，将所得甲酯液滤液与无水乙醇，摇匀充分溶解，逐渐滴加入柱中，每隔一段时间，取样分析检测浓度，得到角鲨烯粗油。

超临界萃取富集角鲨烯：将萃取后的角鲨烯粗油放置于超临界萃取设备中进行超临界萃取，流体萃取压力为35MPa，萃取温度35℃，CO2流量为10L/h,萃取时间为3h，其中夹带剂为丙酮，用量为丙酮：角鲨烯粗油=5:1，再经超临界二氧化碳萃取，将得到的产物于6℃的环境中冷冻20分钟，再将冷冻后的原液放置于1200r/min的高速冷冻离心机中离心10分钟，除去杂质，放入温度35℃真空箱抽真空5小时，得到高含量角鲨烯精油。

实施例4

不同离子交换树脂对生育酚分离的影响

在反相液液分层层析分离脂肪酸甲酯过程中，为直观表示各分离工艺的分离性能，引用保留率这一概念，首先保留率的计算公式为：保留率=（m1×c1）/（m2×c2）×100%，m1为产物中物质总量，c1为产物中目标物质的量，m2为原料中物质总量，c2为原料中目标物质的量。同时在超临界萃取中引用萃取率这一概念，萃取率=萃取成分总量/原料质量×100%

本文中为验证生育酚分离工艺理论的正确性，采用两种不同属性的树脂进行实验，其实验结果如图1所示，表明强碱性离子树脂分离，保留率高。

在超临界萃取工艺中为寻找最合适的夹带剂，采用不同夹带剂进行实验，同时得到在不同夹带剂下，每种夹带剂重复三次实验，得出萃取率的平均值，结果如图2，可知，无水乙醇作为夹带剂最优。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。