一种多肽及其衍生物、应用、核苷酸序列、重组表达载体、组合物的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多肽及其衍生物、应用、核苷酸序列、重组表达载体、组合物。

背景技术：

现有的大部分生物必然经历衰老的过程。在机体衰老的过程中，皮肤是外在表现较为明显的器官之一，随着年龄的增长，皮肤会发生退行性变化，例如弹性消退、含水量减少、萎缩、出现皱纹等。

皮肤衰老是皮肤组织经历了一系列复杂的生物学过程，各种内源性生理因素和外源性环境因素共同作用的结果。皮肤的主要构成为表皮层、真皮层和皮下脂肪。其中，真皮层中的成纤维细胞会分泌胶原蛋白，以保持皮肤的强度和弹性。一般来说，皮肤中的胶原蛋白高达85％以上，其中主要含有ⅰ型胶原蛋白(collageni)、ⅱ型胶原蛋白和iii型胶原蛋白。胶原蛋白的存在与皮肤健康程度，保水及弹性等有着密切的关系。皮肤衰老的组织学改变主要是胶原蛋白的减少和流失。当胶原蛋白降解的速度大于其生成的速度时，皮肤便会出现松弛、产生皱纹等明显衰老特征。

技术实现要素：

针对随着年龄增长，皮肤出现松弛、衰老的问题，本发明提供了一种多肽及其衍生物、应用、核苷酸序列、重组表达载体、组合物。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种多肽，包括以下序列：

gly-his-lys-his-lys-ser-ser-ser-pro-ser-cys-ala-cys-gly(seqidno1)。

另一方面，本发明提供了一种多肽衍生物，所述多肽衍生物为如上所述的多肽的修饰产物。

另一方面，一种核苷酸序列，包括编码如上所述的多肽或如上所述的多肽衍生物的核苷酸序列。

可选的，包括以下核苷酸序列中的一种或多种：

ggccauaaacauaaaagcagcagcccgagcugugcauguggu(seqidno2)

ggccauaaacacaaaaguaguaguccgagcugugcauguggu(seqidno3)

ggccauaaacauaaaagcagcagcccgagcugugcauguggc(seqidno4)

ggccauaaacacaaaagcaguagcccgagcugugcauguggu(seqidno5)

ggucauaaacacaaauguagcuguccgagcugugcauguggu(seqidno6)

ggccauaaacauaaaucaucaagcccgucaugugcauguggc(seqidno7)。

另一方面，本发明提供了一种重组表达载体，包括如上所述的核苷酸序列对应序列的重组表达载体。

另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，包括如上所述的重组表达载体。

另一方面，本发明提供了一种组合物，包括分散载体，以及如上所述的多肽或如上所述的多肽衍生物。

可选的，所述分散载体包括水、缓冲盐溶液、脂肪醇、固体蜡、乙二醇、甘油或有机酯中的一种或多种。

另一方面，本发明提供了一种组合物，包括如上所述的多肽或如上所述的多肽衍生物，以及至少一种治疗某疾病的有效剂量的药物活性成分。

另一方面，本发明提供了如上所述的多肽或如上所述的多肽衍生物在制备外用护肤品中的应用。

本发明提供了一种新的多肽，该多肽具有较好的促进胶原蛋白分泌的功能，同时由于分子量较小，可以自由透过角质层，增加真皮层细胞的活力，加快细胞增殖，逐渐修复体内流失的胶原蛋白，使皮下组织坚强，伤口迅速愈合，进而达到除皱抗衰老的目的。

附图说明

图1是本发明多肽处理的纤维细胞的显微镜照片；

图2是本发明对照组处理的纤维细胞的显微镜照片；

图3是本发明提供的细胞数量增长趋势对比图；

图4是本发明提供的i型胶原蛋白的含量对比图；

图5是本发明提供的ii型胶原蛋白的含量对比图；

图6是本发明提供的iii型胶原蛋白的含量对比图；

图7是本发明提供的tgfβ1含量的含量对比图；

图8是本发明提供的igf-1含量的含量对比图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如本文所用，术语“肽”的含义是被本专业领域的技术人员所熟知的。通常情况下，肽是两个或多个氨基酸由酰胺键链接，酰胺键则由一个氨基酸的氨基与相邻氨基酸的羧基构成。本文所述的多肽可包含天然存在的氨基酸或者非天然存在的氨基酸。可被修饰成其类似物，衍生物，功能模拟物，伪肽等诸如此类包含至少两个氨基酸的聚合物。

本发明一实施例提供了一种多肽，包括以下序列：

gly-his-lys-his-lys-ser-ser-ser-pro-ser-cys-ala-cys-gly(seqidno1)。

所述多肽为短肽，能够被较好的吸收，同时能够促进胶原蛋白分泌的功能，可以在不伤肌肤、不刺激肌肤的情况下，增加细胞的活力，加快细胞增殖，逐渐修复体内流失的胶原蛋白，使皮下组织坚强，伤口迅速愈合，进而达到除皱抗衰老的目的。

如本领域技术人员所公知的，上述多肽中，各氨基酸缩写所代表的氨基酸如表1所示：

表1

本发明另一实施例提供了一种多肽衍生物，所述多肽衍生物为如上所述的多肽的修饰产物。

如本文所用的术语“衍生物”是指母体分子如多肽的一种变型。例如多肽的衍生物，可以包括相对于多肽而言一个或多个氨基酸被取代的一种变型。还可以包括对于多肽的修饰，包含但不限于非天然存在的氨基酸、d型氨基酸、氨基和/或羧基末端(n-或c-末端)修饰的氨基酸，特别是对于在n-末端的氨基和/或c-末端的羧基的修饰、脂肪酸修饰、肽模拟物和伪肽等诸如此类的修饰物。

如本文所述，本发明提供的多肽，可以是由标准的20个天然存在的氨基酸构成，也可以由其他天然和/或非天然存在的氨基酸构成。如本文所述的多肽一般使用常规术语。本文所描述的多肽，除非指明n端或c-末端具有特定的修饰，否则一个包含特定氨基酸序列的多肽，则包括不加修饰的和修饰的氨基和/或羧基末端，这是被本领域的专业技术人员所熟知的。一个特定的氨基酸序列的多肽可以包括修饰的氨基酸和/或额外的氨基酸，除非n-和/或c-末端包含妨碍进一步添加氨基酸的修饰。这样的修改包括，例如，n-末端的乙酰化和/或c-末端的酰胺化。

如本文所述，本发明的多肽可以通过改造修饰，形成多肽衍生物。正如本领域技术人员所熟知的，可以对多肽进行各种改造修饰。典型的改造修饰包含但不限于，n-末端乙酰化、c-末端酰胺化、d型氨基酸替换、非天然氨基酸替换、脂肪酸修饰或以上各种修饰改造的组合。本发明包括任何被众所周知的多肽的修饰改造。例如，多肽衍生物可以包括对于多肽的化学修饰，如烷基化、酰基化、氨基甲酰化、碘化或其他任何产生多肽衍生物的改造修饰。多肽的改造修饰可以包含改造过的氨基酸，例如，羟基脯氨酸或羧基谷氨酸，并且可以包括以非肽键相连的氨基酸。

对于本发明的多肽的其它修饰改造可采用非天然氨基酸对多肽中的天然氨基酸进行取代，非天然氨基酸包含但不限于，2-氨基脂肪酸(aad)、3-氨基脂肪酸(βaad)、β-丙氨酸，β-氨基丙酸(βala)、2-氨基丁酸(abu)、4-氨基丁酸、哌啶羧酸(4abu)、6-氨基己酸(acp)、2-氨基庚酸(ahe)、2-氨基异丁酸(aib)、3-氨基异丁酸(βaib)、2-氨基庚二酸(apm)、2,4-二氨基丁酸(dbu)、锁链素(des)，2,2'-二氨基庚二酸(dpm)，2,3-二氨基丙酸(dpr)，n-乙基甘氨酸(etgly)、n-乙基天冬酰胺(etasn)，羟赖氨酸(hyl)、异羟赖氨酸(ahyl)、3-羟脯氨酸(3hyp)、4-羟基脯氨酸(4hyp)、异锁链素(ide)、异-异亮氨酸(aile)、n-甲基甘氨酸(megly)、n-甲基异亮氨酸(meile)、6-n-甲基赖氨酸(melys)、n-甲基缬氨酸(meval)、正缬氨酸(nva)、正亮氨酸(nle)和鸟氨酸(orn)。当然，所有被修饰改造的α-氨基酸可以被相应的β-，γ-或ω-氨基羧酸所取代。

另一种修饰改造是对本发明的多肽进行脂肪酸修饰。因此，可以对本发明的多肽进行包括c2，c4，c6，c8，c10，c12，c14，c16，c18，c20或更长碳链的脂肪族基团酰化。多肽也可利用异戊二烯化和/或磷脂酰肌醇(pi)等方式进行修饰改造。其它氨基酸，多肽或蛋白质的修饰对于本技术领域的技术人员是熟知的(参见，例如：glazeretal.,chemicalmodificationofproteins:selectedmethodsandanalyticalprocedures,elsevierbiomedicalpress,amsterdam(1975))

本发明的多肽或其衍生物可以使用本领域技术人员所熟知的方法制备，包括众所周知的化学合成的方法。因此，当多肽或其衍生物包含一个或多个非标准氨基酸，则极有可能是通过化学合成法制备而来。除了使用化学合成的方法制备多肽或其衍生物，还可以通过编码核酸表达来制备。这对于制备只含有天然氨基酸的多肽或其衍生物特别适用，在这种情况下可以使用众所周知的核酸编码多肽序列的制备方法(参见sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,thirded.,coldspringharborlaboratory,newyork(2001)；ausubeletal.,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwileyandsons,baltimore,md(1999))。多肽可以在生物体中表达，并通过公知的纯化技术进行纯化。

因此，本发明另一实施例提供了一种核苷酸序列，包括编码如上所述的多肽或如上所述的多肽衍生物的核苷酸序列。

在一些实施例中，所述核苷酸序列包括以下核苷酸序列中的一种或多种：

ggccauaaacauaaaagcagcagcccgagcugugcauguggu(seqidno2)

ggccauaaacacaaaaguaguaguccgagcugugcauguggu(seqidno3)

ggccauaaacauaaaagcagcagcccgagcugugcauguggc(seqidno4)

ggccauaaacacaaaagcaguagcccgagcugugcauguggu(seqidno5)

ggucauaaacacaaauguagcuguccgagcugugcauguggu(seqidno6)

ggccauaaacauaaaucaucaagcccgucaugugcauguggc(seqidno7)。

需要说明的是，以上仅为本发明多肽的核酸表达的其中几种实现方式，实际表达时，所述多肽的核酸表达不限于上述核苷酸序列。

因此，如本文所公开的，当多肽含有一个或多个标准氨基酸可替换位点时，可用已知方法从表达载体中表达多肽。

本发明的另一实施例提供了一种重组表达载体，包括如上所述的核苷酸序列对应序列的重组表达载体。

如上所述的核苷酸序列为rna序列，可根据该rna序列编码本发明的多肽或其衍生物的脱氧核苷酸对应序列，并将其克隆到合适的载体，尤其是表达载体，得到重组表达载体，从而在宿主细胞中进行表达，或者利用体外转录/翻译反应，从而提供了一种获取大量多肽或其衍生物的方法。所述重组肽可以视需要生产带标记的融合体，如his-tag标记，以便于识别和纯化。合适的载体、宿主细胞、体外转录/翻译系统和标记序列是被该领域的技术人员所熟知的并且有市售商品。

在多顺反子表达载体中，多肽或其衍生物可以表达为单一拷贝，或视需要表达为具有肽序列多重拷贝的单一开放读码框。在此情况下，可通过表达含有肽序列多重拷贝的开放读码框得到肽，从而表达为具有此肽多重拷贝的多肽。此多肽可经翻译后处理得到本发明的多肽或其衍生物，比如，通过工程设计肽拷贝间的适当蛋白水解切割位点，将多肽切割为本发明的多肽或其衍生物。尽管此重组方法一般用于仅含有天然氨基酸的多肽或其衍生物，但此方法用于经适当工程设计的宿主表达非天然氨基酸也是可以理解的。此外，重组表达的多肽或其多肽衍生物可采用已知的化学修饰方法选择性修饰引入需要的氨基酸，或n端和/或c端修饰。(参见glazeretal.,supra,1975)。

本发明的另一实施例提供了一种宿主细胞，包括如上所述的重组表达载体。

通常，所述宿主细胞包括如细菌、酵母菌、哺乳动物或者昆虫细胞等。对于本发明的多肽或其多肽衍生物的大规模生产，通过细菌进行生产是特别有益的，作为示例，如大肠杆菌。

本发明的另一实施例提供了一种组合物，包括分散载体，以及如上所述的多肽或如上所述的多肽衍生物。

所述组合物可以不同物理形式存在，如溶液、分散液、悬浮液等液体形式，或是呈膏状等半固体形式以及泡沫、凝胶等形式。

在一些实施例中，所述分散载体包括水、缓冲盐溶液、脂肪醇、固体蜡、乙二醇、甘油或有机酯中的一种或多种。

将多肽通过分散载体进行分散液化，尤其适用于化妆品或护肤品领域，能够提高其与皮肤的接触附着和渗透效率。

在其他实施例中，所述组合物中也可加入表面活性剂或是其他化妆品或护肤品领域常用辅料。

本发明的另一实施例提供了一种组合物，包括如上所述的多肽或如上所述的多肽衍生物，以及至少一种治疗某疾病的有效剂量的药物活性成分。

由于所述多肽本身链段较短，具有较好的可吸收特性，通过将所述多肽与药物活性成分联用，尤其适用于提高药物的吸收效率。

本发明的另一实施例提供了如上所述的多肽或如上所述的多肽衍生物在制备外用护肤品中的应用。

以下通过实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

本实施例用于说明本发明公开的多肽的扩增制备方法，包括以下操作步骤：

将如碱基序列seqidno2对应的脱氧核苷酸序列连接到大肠杆菌pbad/hisb载体，该载体大小为4092bp，载体上带有his-tag标签及肠激酶的酶切位点等，在转化表达后收集产物进行蛋白纯化，来获得多肽。

进行蛋白纯化和操作步骤包括：

a.细菌中的目的蛋白诱导表达后，离心沉淀细菌，去除上清液。

b.每克细菌沉淀湿重加入4ml非变性裂解液，添加蛋白酶抑制剂，充分重悬细菌。

c.上述溶液中加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20℃保存。

d.将上述溶液至于冰上超声裂解细菌，离心取上清。

e.装柱，1ml非变性裂解液平衡ni柱2次。

f.步骤d中的上清过ni柱。

g.用0.5ml非变性洗涤液洗ni柱5次。

h.用0.5ml非变性洗脱液洗脱ni柱6-10次。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的his标签蛋白样品。对该蛋白样品进行肠激酶酶切，体系为：

i.25mmtris-hclph8.0；

ii.温度25℃；

iii.过夜酶切12h-16h，收集酶切产物，得到多肽。

活性功能验证：

通过培养基培养成纤维细胞，将同一培养基分割形成多个实验组培养基和对照组培养基，在多个实验组培养基中分别添加多肽，至培养基中多肽浓度为0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml，在对照组培养基中加入生理盐水。

(1)对3天内各培养基进行取样统计其细胞数量，得到如图3所示结果。

取第3天0.1mg/ml实验组培养基中培养基样本进行显微镜观察，得到显微镜照片如图1所示；取第3天对照组培养基中培养基样本进行显微镜观察，得到显微镜照片如图2所示。

由图1～图3所示的结果可知，本发明提供的多肽能够有效促进成纤维细胞的分裂，且成纤维细胞的扩增效果与添加的多肽的浓度呈正相关。

(2)对3天内各培养基进行取样并统计其细胞内ⅰ型胶原蛋白含量，得到如图4所示结果。

由图4所示的结果可知，本发明提供的多肽能够有效促进成纤维细胞内ⅰ型胶原蛋白的分泌，提高ⅰ型胶原蛋白的含量。

(3)对3天内各培养基进行取样并统计其细胞内ⅱ型胶原蛋白含量，得到如图5所示结果。

由图5所示的结果可知，本发明提供的多肽能够有效促进成纤维细胞内ⅱ型胶原蛋白的分泌，提高ⅱ型胶原蛋白的含量。

(4)对3天内各培养基进行取样并统计其细胞内ⅲ型胶原蛋白含量，得到如图6所示结果。

由图6所示的结果可知，本发明提供的多肽能够有效促进成纤维细胞内ⅲ型胶原蛋白的分泌，提高ⅲ型胶原蛋白的含量。

(5)对3天内各培养基进行取样并统计其细胞内tgfβ1含量，得到如图7所示结果。

由图7所示的结果可知，本发明提供的多肽能够有效促进成纤维细胞内tgfβ1的分泌，提高tgfβ1的含量。

(6)对3天内各培养基进行取样并统计其细胞内igf-1含量，得到如图8所示结果。

由图8所示的结果可知，本发明提供的多肽能够有效促进成纤维细胞内igf-1的分泌，提高igf-1的含量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>深圳爱生再生医学科技有限公司

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