玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用的制作方法

本发明属于基因领域，具体涉及玉米转录因子zmereb160基因及其应用。

背景技术：

干旱、盐渍、高温等非生物胁迫严重影响玉米的生长和产量，由于逆境在玉米的整个生长周期有可能发生，玉米在长期的进化中，逐渐建立起相应的抗性机制。为了提高玉米的耐旱、耐盐等能力成为了育种中迫切的需要，挖掘玉米中具有应用价值的抵抗环境胁迫的功能基因，培育耐旱的玉米种质资源具有重要研究意义。转录因子ap2/erebp家族参与了植物细胞发育、激素应答和非生物逆境反应，该类基因表达对提高玉米在干旱胁迫下的耐性起着重要的作用。

大豆中gmerf3、gmerf057在烟草转基因中，提高了烟草对盐和干旱的耐性gmerf7能提高大豆的耐旱性。小麦erebp转录因子w17基因可以显著增强转基因拟南芥耐寒性。这些研究表明，ap2家族蛋白参与了非生物胁迫的应答，可以增强植物对干旱的耐性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为：如何提供新的玉米转录因子zmereb160基因及其应用。

本发明的技术方案为：

玉米转录因子zmereb160基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

玉米转录因子zmereb160蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

玉米转录因子zmereb160基因在提高玉米耐干旱能力上的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

zmereb160基因是通过全基因组关联分析，与在干旱胁迫处理下的相对电导率表型性状进行关联分析，发现的候选耐旱基因。zmereb160基因在玉米受到干旱胁迫的诱导，并且表达上调。说明该基因对干旱胁迫具有应答，参与了玉米耐旱的作用。通过在拟南芥转基因zmereb160的过表达株系中发现，增强了转基因植株在幼苗时期对渗透胁迫的耐性。

附图说明

图1zmereb160基因在peg胁迫处理下表达分析；

图2zmereb160转基因拟南芥渗透胁迫处理，wt：拟南芥野生型，l3、l4和l5是zmereb160转基因拟南芥株系。

具体实施方式

实施例1zmereb160基因的筛选和克隆

选择68份玉米自交系材料，种子播种于含有草炭土的营养钵中，每份自交系种植30钵，每钵2粒种子。在温室中培养，待玉米苗长至三叶一心期时，进行胁迫处理。对照每4天浇一次水，干旱胁迫停止浇水。10天后测定相对电导率，3次重复。相对电导率测定方法按照张宪政主编的《作物生理研究法》。相对电导率的抗旱系数计算如下：

耐寒系数＝干旱测定值/对照测定值。

68份玉米自交系用iluminamaizesnp55k芯片测定基因信息，通过软件plink对芯片数据进行质控，获得了40580个snps，挑选在玉米10条染色体上均匀分布的2642个snps，用structure软件进行群体遗传结构划分，并用spagedi软件进行亲缘关系计算。最后通过tassel软件进行全基因组关联分析，采用mlm混合模型。

利用全基因组关联分析玉米苗期干旱胁迫处理，找到与相对电导率关联位点，在这个位点找了候选基因zmereb160。根据网站上b73的基因组设计引物扩增zmereb160:

上游引物：5’-cgaagcttatgtgcggcggcgccatcctgtc-3’(seqidno.3)；

下游引物：5’-gcgtcgacggtagaaaccagcagacatgggcatg-3’(seqidno.4)。

基因序列全长1098bp。利用kod-plusneo，吉853cdna为模板扩增基因。扩增体系：50μl，引物各1.5μl(引物浓度10μmol/l)，cdna：200ng；25mmmgso4：3μl；2mmdntps：5μl，10xpcrbuffer：5μl；kod-plusneo：1μl。

反应程序：

pcr扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳。pcr产物进行胶回收后，与pmd18t载体连接。连接产物转化e.colitop10感受态，感受态涂布在lb(kan⁺⁾平板上。从平板上挑选菌落送公司测序验证。经测序，zmereb160基因序列如seqidno.1所示。其编码的蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

实施例2zmereb160基因在干旱胁迫下转录表达分析

玉米自交系吉853播种于含有蛭石的营养钵中，待长至三叶一心期时，把玉米苗放置含有20％(w/v)peg6000的营养液中，进行胁迫处理，取0和3小时的样品，用hipure植物rna小量提取试剂盒(magen，中国)提取总rna，用m-mlv反转录酶合成cdna第一链，用玉米actin基因作为内参，进行荧光定量分析zmereb160基因在胁迫下的表达。采用2-^-δδct进行数据分析。结果表明，zmereb160基因表达量上调，zmereb160基因受干旱诱导表达(见图1)。

实施例3转基因zmereb160植物的构建及渗透胁迫处理

zmereb160通过hindiii和sali限制性内切酶重pmd18t载体切下，并同时用这两个酶酶切superpcambia1300-gfp载体，用胶回收试剂盒回收酶切产物。然后，用t4dnaase连接zmereb160和superpcambia1300-gfp载体；连接产物转化e.colitop10感受态，感受态涂布在lb(kan⁺⁾平板上。从平板上挑选菌落送公司测序验证。提取测序正确的克隆，并通过冻融法转化农杆菌gv3101。

农杆菌法转化拟南芥

1)农杆菌菌种吸取20μl加于3mlyeb(kan+、rif+)中；

2)28℃，200rpm，摇24h；

3)取摇好的菌，12,000rpm，1min离心收集菌株，去上清

4)将沉淀用1ml5％蔗糖1/2ms溶液重悬，再次收集菌株

5)最后仍用1ml5％蔗糖1/2ms溶液重悬，同时加入0.2μlsilwet77，充分混匀后，即可侵染拟南芥。

6)待拟南芥种子成熟后，收获种子。

7)种子播种在含有50mg/l潮霉素的1/2ms培养基平板上，挑取抗性苗。

8)pcr鉴定抗性苗(引物用上述扩增基因的引物)，反复筛选抗性苗和pcr鉴定，直至获得纯合子t3代种子。

转基因zmereb160拟南芥渗透胁迫处理

拟南芥野生型和转基因zmereb160拟南芥种子经过表面消毒后，播种在1/2ms培养基上，4℃处理3天。然后放置于21℃光照培养箱培养5天，把野生型和转基因拟南芥移到含有400mm甘露醇的1/2ms培养上垂直培养6天。从图2可以看到，野生型拟南芥的根生长受到了一致，转基因拟南芥明显比野生型根长。实验表明，zmereb160基因增强了拟南芥对渗透胁迫的耐性。zmereb160基因的表达，能增强植物的耐旱性。

序列表

<110>吉林省农业科学院

<120>玉米转录因子zmereb160基因及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1098

<212>dna

<213>玉米(zeamays)

<400>1

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<213>玉米(zeamays)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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