水稻根际铁膜微生物DNA的提取试剂及提取方法与流程

本发明属于基因组提取领域，涉及一种水稻根际铁膜微生物dna的提取试剂及提取方法。

背景技术：

水稻的茎和根系具有发达的通气组织，可将叶片光合作用制造的氧气及从外部环境中摄入的氧气输送到根部，以供处于厌氧条件下的根系进行呼吸。同时，向根系输送的氧气会有一部分渗出根的皮层细胞向根际环境扩散，在植物根际周围形成微氧区域，使植物根系处于相对氧化的状态。厌氧土壤中二价铁离子(fe²⁺)被水稻根系分泌的氧气和氧化性物质氧化，形成大量的红褐色或者黄色铁氧化物及其氢氧化物覆盖在根表上，即铁膜。

水稻根表铁膜一般出现在距根尖1.0cm的地方，主要出现在根毛区、根伸长区及根上较靠后部的部位。影响水稻根表铁形成的因素包括：土壤溶液中fe²⁺浓度、根系分泌的氧气和氧化性物质总量以及由此形成的微氧化环境、土壤中无机碳、可溶性盐、土壤有机质、阳离子交换量、碳酸盐含量、ph值、eh值、生长季节、温度和淹水时间长短等。

根表铁膜主要由晶态或无定态铁的氧化物或氢氧化物(如氢氧化铁、纤铁矿与针铁矿)组成。根表铁膜由于含有铁氧化物，可吸附根际环境的金属、类金属元素，作为水稻对重金属吸收的一种有效屏障。

根表铁膜缓解植物受到金属毒害的机制主要有两个方面：一方面即为铁膜的物理化学吸附能力能使有毒元素束缚在植物根表不易被植物吸收；另一方面则是铁膜能提供除有毒元素外的其他元素离子进入植物体内，预先饱和有毒元素的结合位点，减少对有毒离子对植物的毒害。水稻根系作为污染物进入植物体内的重要门户，研究根表铁膜的作用机理及其形成的调控机制有重要意义，为正确评价重金属迁移转化行为提供合理的依据。

现有的研究表明微生物广泛参与了铁膜形成以及其表面元素循环过程。铁氧化细菌和甲烷氧化细菌对于根表铁膜的形成起到了一定的作用。目前针对根表铁膜微生物的研究主要方法为显微观察和富集培养等方面。然而可培养的微生物只占到自然界微生物总量的1％不到。需要全面了解水稻根表铁膜相关微生物就需要利用基于现代分子生物学技术的非培养方法，此类方法需要提取到高质量的环境dna。

由于铁膜具有两性，能吸附带有正负电荷的基团及其离子，并且铁膜上往往吸附有大量的重金属，影响着dna提取溶液离子形态以及细菌裂解，释放的dna也可能被铁膜所吸附，如此造成铁膜dna提取的困难。

技术实现要素：

本发明的首要目的提供一组用于水稻根表铁膜微生物dna提取的试剂，本申请从水稻根际铁膜环境(与水稻根际吸附紧密)及组成(铁氧化物浓度高)特征出发，针对野外样品保存、铁膜分离溶解、微生物滤膜回收、细胞裂解及dna提取过程对所需试剂做了较大改进。

本发明的另一目的在于提供上述试剂在水稻根表铁膜微生物dna提取中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一组用于水稻根表铁膜微生物dna提取的试剂，包括清洗液(fpcb)、溶解液(fpdb)、裂解液(fplb)、洗涤液(fpwb)和洗脱液(fpeb)；该组试剂是根据水稻根际铁膜环境(与水稻根际吸附紧密)及组成(铁氧化物浓度高)特征设计得，其中的清洗液(fpcb)用于洗去根际表面土壤；裂解液(fplb)用于裂解吸附于铁膜上的微生物细胞；洗涤液(fpwb)用于洗去裂解液中可能存在的大量铁等金属离子。

所述的清洗液(fpcb)含有10～15mmtris、1～2mmedta(乙二胺四乙酸)，ph值为7～8。

所述的溶解液(fpdb)含有20～30mm柠檬酸三钠、100～150mm碳酸氢钠和50～100mm连二亚硫酸钠，ph值7～8；

所述的裂解液(fplb)含有100～200mmnacl、100～200mmtris、1～2mm柠檬酸钠、10～20mmcacl2和50～100mmedta，ph值7～8；

所述的洗涤液(fpwb)含有50～100mmnacl和10～20mmtris，ph值7～8；

所述的洗脱液(fpeb)是去离子水，ph值7～8；优选含有5～10mmtris。

上述的试剂可用于提取水稻根表铁膜微生物的dna，具体包括以下步骤：

(1)野外采集水稻根部样品，去除根际土后，放入容器中，冰上保存运回实验室；

(2)加入去离子水浸没水稻根部，震荡培养，然后倒掉去离子水，重复该操作若干次，直至水稻根部表面土壤被去除干净；

(3)加入清洗液，震荡，然后倒掉清洗液，重复该操作若干次，去除铁膜表面吸附的金属离子；

(4)加入溶解液，放入55～60℃水浴几个小时，该步用于溶解根表铁膜；然后将该溶解液用滤膜过滤，以去除溶液里面的离子成分，保留微生物及颗粒铁氧化物；

步骤(4)所述的滤膜为混合纤维素滤膜或玻璃纤维素膜，其孔径优选0.22μm；

(5)取滤膜，加入液氮，研磨至滤膜破碎为止，加入直径为0.7mm和0.15mm的石榴石，并加入裂解液，震荡5～10分钟；再加入溶菌酶，35～37℃水浴0.5～1.0小时；然后再加入蛋白酶k和sds，35～40℃摇床震荡0.5～1.0小时，后放入60～65℃水浴锅中水浴1～2个小时；

该步骤中，采用两种粒径的石榴石对微生物细胞的破碎效果比采用单一粒径的好；

步骤(5)中，滤膜与两种石榴石的重量比为1.0:(1.0-1.5):(1.0-1.5)；

(6)水浴后的溶液放入细胞破碎仪中进一步裂解细胞，然后离心，取上清液；加入与上清液相同体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，上下颠倒混匀，并震荡几十秒，再次离心，取上清液；

步骤(6)所述离心的具体参数是，4～8℃，10000～12000转/分钟，离心15～20分钟；

步骤(6)所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿、异戊醇三者的体积比为25:24:1；

(7)加入与上清液相同体积的无水乙醇，混匀后转移至硅胶膜离心柱；加入2倍上清液体积的洗涤液，抽吸滤过，该加入清洗液和抽吸滤过的操作重复若干次；

(8)用乙醇溶液洗涤离心柱，然后将离心柱离心，甩干硅胶薄膜上的乙醇；往离心柱中加入预热的洗脱液，室温孵育几分钟，然后离心，沉淀即为水稻根表铁膜微生物的dna；

步骤(8)所述的乙醇溶液，其体积百分比为70～75％；

步骤(8)所述离心的具体参数是，4～8℃，10000～12000转/分钟，离心2～10分钟；

步骤(8)所述的预热，优选65℃预热。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

目前仍未有针对水稻根际铁膜微生物dna的提取方法，利用本发明提供的方法提取出的dna完整度高，电泳条带主要在15000bp以上。提取出的dna可达到对16srrna和aioa等基因的定量及高通量测序要求。

附图说明

图1是水稻铁膜实物图。

图2是水稻铁膜微生物dna琼脂糖凝胶电泳结果。

图3是水稻铁膜微生物16srrna基因pcr产物琼脂糖凝胶电泳结果。

图4是水稻铁膜微生物微物种组成。

图5是水稻铁膜aioa基因物种组成。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种水稻根际铁膜微生物dna的提取试剂，包括清洗液fpcb、溶解液fppb、裂解液fplb、洗涤液fpwb、洗脱液fpeb。

清洗液fpcb制备：称取1.2gtris，3gedta，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节ph值为7.5，加入去离子水定容至1l。

溶解液fppb制备：称取8.8g柠檬酸三钠,10.5g碳酸氢钠和10.4g连二亚硫酸钠，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节ph值为8.0，加入去离子水定容至1l。每次实验新鲜配制。

裂解液fplb制备：称取11.7gnacl，24.2gtris，0.6g柠檬酸钠，1.1gcacl2，14.6gedta，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节ph值为8.0，加入去离子水定容至1l。

洗涤液fpwb制备：称取9.84gnacl，并加入800ml去离子水，取10ml1mtris溶液，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节ph值为8.0，加入去离子水定容至1l。洗脱液fpeb：取10ml1mtris溶液至于容器中，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节ph值为8.0，加去离子水定容至1l。

溶菌酶反应液(50mg/ml)的制备：称取5g溶菌酶加入溶菌酶缓冲液(成分为tris-hcl缓冲液(ph值8.0)定容至10ml，制成50mg/ml溶液。

蛋白酶反应液的制备：称取20g蛋白酶k粉加入蛋白酶k缓冲液(成分为tris-hcl缓冲液(ph值8.0)定容至100ml，制成20mg/ml溶液。

实施例2

提取水稻根表铁膜微生物基因组dna，pcr扩增16srrna基因，高通量测序鉴定微生物群落组成。采用实施例1提供的提取试剂进行提取，共9个水稻根表铁膜样品，步骤如下：

(1)野外采集新鲜的水稻根际样品，去除大部分根际土后，放入50ml离心管中，冰上保存运回实验室。水稻根际铁膜见图1。

(2)往50ml离心管加入灭菌去离子水后，放入摇床。150转/分钟，震荡10分钟后，倒去液体，如此反复操作多次，直至根部表面土壤被去除干净。

(3)往50ml离心管加入清洗液fpcb，放入摇床。150转/分钟，震荡10分钟后，倒去液体，如此反复操作两次，去除铁膜表面吸附的金属离子。

(4)往50ml离心管加入30ml的溶解液fpdb，放入60℃水浴锅孵育1小时，每隔10分钟混匀一次。

(5)将根从离心管中夹取出来，溶液应用真空泵结合玻璃过滤器过滤到直径47mm孔径0.22μm的混合纤维素酯上(millipore公司，型号gswp04700)。此步骤去除溶液里面的离子成分，保留微生物及颗粒铁氧化物。

(6)待滤膜上溶液抽干后，降滤膜置放于新的50ml离心管中，加入液氮，并用不锈钢研磨棒上次搅动，重复多次，直至玻璃纤维素膜破碎为止。

(7)加入5g直径0.7mm以及5g直径0.15mm的石榴石以及20mlfplb裂解，震荡5分钟。

(8)加入2ml溶菌酶反应液(50mg/ml)，37℃水浴2小时，加入1ml蛋白酶k(20mg/ml)和10ml20％sds继续37℃摇床震荡1小时后放入65℃水浴锅中，每隔10分钟拿出震荡一次，持续1小时。

(9)以上含有反应液的50ml离心管放入fastprep-24破碎仪(美国mp公司)(5挡，破碎1分钟)进一步裂解细胞。

(10)50ml离心管4℃，10000转/分钟，离心15分钟后，上清转入新的50ml离心管中。

(11)按1：1的体积比加入苯酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，上下颠倒，并震荡30秒后，4℃，10000转/分钟，离心15分钟后，上清转入新的50ml离心管中。

(12)按1：1的体积比加入100％乙醇，用真空泵结合powervac^tmmanifoldminisystem系统(mobio公司)进行抽吸滤过，将以上混合液过滤到2ml硅胶膜离心柱(omega公司)。

(13)加入750ulfmwb清洗液后，进行抽吸滤过。此步反复进行三次。

(14)用75％的乙醇清洗一次后，将离心柱置于4℃，10000转/分钟，离心5分钟，甩干硅胶薄膜上的酒精。

(15)加入50ul65℃预热的洗脱液fmeb，室温孵育离心柱滤膜5分钟后，4℃，10000转/分钟，离心2分钟，收集dna。

(16)dna用水平电泳及nanodrop检测dna的质量及浓度。水稻根际铁膜微生物dna琼脂糖凝胶电泳结果见图2。

(17)dna保存于-70度。

(18)取1μldna为模板，扩增16srrna基因的v4区。515f(5’-gtgccagcmgccgcggtaa-3’)+806r(5’-ggactachvgggtwtctaat-3’)为引物进行pcr扩增。pcr扩增体系总体积为50μl，反应体系的组成为：各1μl上下游引物(浓度10μm),2μl10×extag反应液(上海大连宝生物公司),1μl(0.5u)的extag酶(上海大连宝生物公司),2μldntps(2.5mm),以及5μl灭菌水。pcr程序为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，重复变性、退火、延伸步骤共28个循环，然后72℃继续延伸5min。水稻根际铁膜微生物16srrna基因pcr产物琼脂糖凝胶电泳结果见图3。

(19)16srrna基因的pcr产物经cyclepurekit试剂盒(omega公司)纯化后，送到深圳易科吉生物科技有限公司进行高通量测序，所用仪器为ilumina公司的hiseq2500测序仪。

(20)获取的16srrna序列进行原始的质量控制后，在qiime软件中分析微生物的物种组成信息。水稻根际铁膜微生物组成见图4。

利用本发明提供的方法提取出的dna完整度高，电泳条带主要在15000bp以上。以提取出的dna成功进行16srrna的pcr反应，条带约为500bp左右，并对16srrna基因扩增子进行高通量测序后发现，微生物群落的多样性很高，物种组成复杂，并且不同样品之间也反应出一定的差异，说明本发明提供的dna提取方法，对水稻根际铁膜上不同类型的微生物效果很好。

实施例3

提取水稻根表铁膜基因组dna，实时荧光定量pcr确定砷氧化aioa基因的拷贝数。采用实施例1提供的提取试剂进行提取，步骤如下：

(1)野外采集新鲜的水稻根际样品，去除大部分根际土后，放入50ml离心管中，冰上保存运回实验室。

(2)往50ml离心管加入灭菌去离子水后，放入摇床。150转/分钟，震荡10分钟后，倒去液体，如此反复操作多次，直至根部表面土壤被去除干净。

(3)往50ml离心管加入清洗液fpcb，放入摇床。150转/分钟，震荡10分钟后，倒去液体，如此反复操作两次，去除铁膜表面吸附的金属离子。

(4)往50ml离心管加入30ml的溶解液fpdb，放入60℃水浴锅孵育1小时，每隔10分钟混匀一次。

(5)将根从离心管中夹取出来，溶液应用真空泵结合玻璃过滤器过滤到直径47mm孔径0.22μm的混合纤维素酯上(millipore公司，型号gswp04700)。此步骤去除溶液里面的离子成分，保留微生物及颗粒铁氧化物。

(6)待滤膜上溶液抽干后，降滤膜置放于新的50ml离心管中，加入液氮，并用不锈钢研磨棒上次搅动，重复多次，直至玻璃纤维素膜破碎为止。

(7)加入5g直径0.7mm以及5g直径0.15mm的石榴石以及20mlfplb裂解，震荡5分钟。

(8)加入2ml溶菌酶反应液(50mg/ml)，37℃水浴2小时，加入1ml蛋白酶k(20mg/ml)和10ml20％sds继续37℃摇床震荡1小时后放入65℃水浴锅中，每隔10分钟拿出震荡一次，持续1小时。

(9)以上含有反应液的50ml离心管放入fastprep-24破碎仪(美国mp公司)(5挡，破碎1分钟)进一步裂解细胞。

(10)50ml离心管4℃，10000转/分钟，离心15分钟后，上清转入新的50ml离心管中。

(11)按1：1的体积比加入苯酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，上下颠倒，并震荡30秒后，4℃，10000转/分钟，离心15分钟后，上清转入新的50ml离心管中。

(12)按1：1的体积比加入100％乙醇，用真空泵结合powervac^tmmanifoldminisystem系统(mobio公司)进行抽吸滤过，将以上混合液过滤到2ml硅胶膜离心柱(omega公司)。

(13)加入750ulfmwb清洗液后，进行抽吸滤过。此步反复进行三次。

(14)用75％的乙醇清洗一次后，将离心柱置于4℃，10000转/分钟，离心5分钟，甩干硅胶薄膜上的酒精。

(15)加入50ul65℃预热的洗脱液fmeb，室温孵育离心柱滤膜5分钟后，4℃，10000转/分钟，离心2分钟，收集dna。

(16)dna用水平电泳及nanodrop检测dna的质量及浓度。dna保存于-70度。

(17)各取0.5uldna，为模板，扩增aioa基因。m1-2f(5’-ccacttctgcatcgtgggntgyggnta-3’)和m3-2rm2-1r(5’-ggagttgtaggcgggcckrttrtgdat-3’)为引物进行实时定量pcr实验。pcr扩增体系总体积为25μl，反应体系的组成为：12.5μl2×iqsybrgreensupermix(bio-rad)，各1μl上下游引物(浓度10μm)，补足灭菌水至25μl。pcr程序为95℃预变性15秒，95℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸30秒，重复变性、退火、延伸步骤共40个循环，然后72℃继续延伸5min。在每个循环的尾端获取荧光值，并在反应完成计算65至95℃的溶解曲线，确定pcr扩增的特异性。

(18)根据标准质粒计算每个样品的aioa基因拷贝数。水稻根际铁膜微生物aioa基因的拷贝数见表1。

表1：水稻铁膜aioa基因拷贝数

利用本发明提供的方法获取的铁膜微生物dna，能成功应用于砷氧化基因aioa的实时定量pcr检测中，获得的aioa基因拷贝数范围为1.08e+07～1.78e+08/ul之间，表明通过本发明提取的dna的可用于环境砷氧化基因的检测。

实施例4

提取水稻根表铁膜微生物基因组dna，以砷氧化aioa基因为目标分子，pcr测序结合克隆文库确定水稻根表铁膜砷氧化菌的物种组成。采用实施例1提供的提取试剂进行提取，步骤如下：

(1)野外采集新鲜的水稻根际样品，去除大部分根际土后，放入50ml离心管中，冰上保存运回实验室。

(2)往50ml离心管加入灭菌去离子水后，放入摇床。150转/分钟，震荡10分钟后，倒去液体，如此反复操作多次，直至根部表面土壤被去除干净。

(3)往50ml离心管加入清洗液fpcb，放入摇床。150转/分钟，震荡10分钟后，倒去液体，如此反复操作两次，去除铁膜表面吸附的金属离子。

(4)往50ml离心管加入30ml的溶解液fpdb，放入60℃水浴锅孵育1小时，每隔10分钟混匀一次。

(5)将根从离心管中夹取出来，溶液应用真空泵结合玻璃过滤器过滤到直径47mm孔径0.22μm的混合纤维素酯上(millipore公司，型号gswp04700)。此步骤去除溶液里面的离子成分，保留微生物及颗粒铁氧化物。

(6)待滤膜上溶液抽干后，降滤膜置放于新的50ml离心管中，加入液氮，并用不锈钢研磨棒上次搅动，重复多次，直至玻璃纤维素膜破碎为止。

(7)加入5g直径0.7mm以及5g直径0.15mm的石榴石以及20mlfplb裂解，震荡5分钟。

(8)加入2ml溶菌酶反应液(50mg/ml)，37℃水浴2小时，加入1ml蛋白酶k(20mg/ml)和10ml20％sds继续37℃摇床震荡1小时后放入65℃水浴锅中，每隔10分钟拿出震荡一次，持续1小时。

(9)以上含有反应液的50ml离心管放入fastprep-24破碎仪(美国mp公司)(5挡，破碎1分钟)进一步裂解细胞。

(10)50ml离心管4℃，10000转/分钟，离心15分钟后，上清转入新的50ml离心管中。

(11)按1：1的体积比加入苯酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，上下颠倒，并震荡30秒后，4℃，10000转/分钟，离心15分钟后，上清转入新的50ml离心管中。

(12)按1：1的体积比加入100％乙醇，用真空泵结合powervac^tmmanifoldminisystem系统(mobio公司)进行抽吸滤过，将以上混合液过滤到2ml硅胶膜离心柱(omega公司)。

(13)加入750ulfmwb清洗液后，进行抽吸滤过。此步反复进行三次。

(14)用75％的乙醇清洗一次后，将离心柱置于4℃，10000转/分钟，离心5分钟，甩干硅胶薄膜上的酒精。

(15)加入50ul65℃预热的洗脱液fmeb，室温孵育离心柱滤膜5分钟后，4℃，10000转/分钟，离心2分钟，收集dna。

(16)dna用水平电泳及nanodrop检测dna的质量及浓度。dna保存于-70度。

(17)取1μldna为模板，扩增aioa基因。m1-2f(5’-ccacttctgcatcgtgggntgyggnta-3’)和m3-2r(5’-tgtcgttgccccagatgadnccyttytc-3’)为引物进行pcr扩增。pcr扩增体系总体积为50μl，反应体系的组成为：各1μl上下游引物(浓度10μm),2μl10×反应液(上海大连宝生物公司),1μl(0.5u)的extag酶(上海大连宝生物公司),2μldntps(2.5mm),以及5μl灭菌水。pcr程序为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸2分钟，重复变性、退火、延伸步骤共28个循环，然后72℃继续延伸8min。

(18)aioa基因的pcr产物经cyclepurekit试剂盒(omega公司)纯化后，送到广州擎科生物科技有限公司进行文库构建及克隆，测序所用仪器为abi3730xl。

测序后获得的aioa基因序列与ncbi-nr数据库进行比对后获取物种信息。水稻根际铁膜aioa基因物种组成见图5。

利用本发明提供的方法获取的铁膜微生物dna，以编码砷氧化酶的aioa基因为目标分子，通过pcr、克隆文库及构建过程，分析了铁膜微生物aioa基因的物种组成情况：主要为未培养微生物，在可鉴定物种的微生物组成上以acidovorax(食酸菌属)为优势种群。以上结果表明，利用本发明提供的方法提取的dna，可成功用于水稻铁膜根际微生物aioa基因的物种组成分析，为鉴定铁膜砷氧化菌组成及相对丰度提供信息。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。