一种检测猪场土壤中是否携带非洲猪瘟病毒的方法与流程

本发明属于家畜病害检测技术领域，具体涉及一种检测猪场土壤中是否携带非洲猪瘟病毒的方法。

背景技术：

非洲猪瘟(African swine fever virus，ASFV)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％，临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾、胃肠粘膜明显出血。

2018年8月3日—15日，中国在辽宁沈阳、河南郑州、江苏连云港3个相隔很远的地区，接连发现3起非洲猪瘟疫情。8月19日，江苏省连云港市海州区某养殖场确诊发生非洲猪瘟疫情，发病615头，死亡88头。8月24日，浙江省温州市乐清市畜牧兽医局报告，某养殖小区3个养殖户的生猪发病430头，死亡340头。9月2日，安徽省宣城市宣州区发生生猪非洲猪瘟疫情。古泉镇某养殖场存栏生猪285头，死亡40头。五星乡某养殖场存栏生猪440头，死亡94头。9月17日，内蒙古第二个旗县发生非洲猪瘟疫情，同时发布了封锁非洲猪瘟疫区的命令。1月23日9时，北京市房山区青龙湖镇、琉璃河镇各一个养殖场排查出非洲猪瘟疫情。2019年1月1日，黑龙江省绥化市明水县发生非洲猪瘟疫情。2019年3月7日，广西贵港一养殖场发生非洲猪瘟疫情。由于现在尚未有有效的非洲猪瘟疫苗和药物，一旦发生疫情只能采取封闭、扑杀、无害化处理、消毒等处置措施，给广大养殖户带来巨大的经济损失。

非洲猪瘟病毒(ASFV)属于非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属，双链DNA病毒。它是目前唯一的DNA虫媒病毒。ASFV对乙醚及氯仿等脂溶剂敏感，对热、腐败、干燥等的抵抗力较强。病毒可在56℃的环境下存活2小时、4℃下存活6个月、在干燥的室温环境下可存活2年，而在-20℃下几乎可无限期的存活。在PH值范围为3至10的环境下，病毒十分稳定。由于非洲猪瘟病毒的这一稳定特性，给猪场复产带来严重挑战，一旦消毒不彻底，猪场环境或土壤中存在存活病毒，复产后再次感染概率为100％。

通常对待疫情区的处理均会采用反复清理、清洗、消毒、空置，这一系列措施能够有效杀灭饲养场所表面的非洲猪瘟病毒，但土壤中的病毒无法得到有效处理，已经有资料表明，非洲猪瘟病毒可随着水流、尿液、粪便等渗透到土壤中导致疫情传播。因此在猪场复产前一旦土壤中存在未杀死的非洲猪瘟病毒，将对复产后的猪场带来严重威胁，甚至再次感染造成损失。

因此如何准确确定饲养环境中是否含有非洲猪瘟病毒，何时解除疫区封锁，合理把握复产时间对生猪养殖业具有重要意义，而目前尚没有较好的方法可以直接检测猪场环境尤其是土壤中的非洲猪瘟病毒，更没有准确的方法可以合理把控发病后猪场的复产时间，疫区猪场复产全靠经验与运气。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明旨在提供一种可以直接检测猪场土壤中非洲猪瘟病毒的方法，以确定发病、清空并经清理、消毒后的猪场是否适合复产。该方法还可以有效排查猪场复产的风险性及风险来源，有针对性的对猪舍周边、生产污区、病死猪处理位置等高风险区域进行排查，并采取有针对性的处理方案。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种检测猪场土壤中是否携带非洲猪瘟病毒的方法，包括将蚯蚓投放在猪舍周边、生产污区、病死猪处理位置、猪场进出入口的土壤中培养，之后再检测蚯蚓体内是否携带非洲猪瘟病毒的步骤。

具体包括以下步骤：

(1)蚯蚓投放场地选择与处理：选择猪舍周边、生产污区、病死猪处理位置、猪场进出入口做为待检测场所，用消毒处理后的纯净水浇透；

(2)蚯蚓投放：将蚯蚓投放至待检测场所，之后用低功率紫外灯照射地面；

(3)蚯蚓回收：投放后培养3-5天，根据蚯蚓粪便位置，挖出蚯蚓，不同区域蚯蚓分开放置，并做好标记，蚯蚓回收数量大于投放总数量的70％；

(4)检测：将回收的蚯蚓粉碎后取样，采用荧光PCR方法检测是否携带非洲猪瘟病毒，若非洲猪瘟病毒检测呈阳性，表明消毒不彻底，对阳性区域继续清理、消毒；若检测非洲猪瘟病毒呈阴性，重复步骤(1)至步骤(4)2-4次，直至所有检测呈阴性。

做为具体技术方案，步骤(1)中蚯蚓的投放数量为10-15条/m²。

做为优选技术方案，所述蚯蚓在投入待检场所前需在非洲猪瘟病毒呈阴性的培养基中培养2-7天，投入前随机抽检蚯蚓中非洲猪瘟病毒2-3次，每次检测结果呈阴性后方可投放。

做为优选技术方案，所述步骤(1)中低功率紫外灯照射时间为3-5min，紫外功率为10-20W。

做为具体技术方案，所述步骤(3)中蚯蚓投放后培养期间定期向投放区域中喷洒纯净水，保持土壤湿润。

做为具体技术方案，在步骤(1)中蚯蚓投放之前将投放区域进行松土处理，以便于蚯蚓钻入土壤内部。

做为具体技术方案，所述步骤(1)中的待检测场所按3-10m²/块分别编号。

做为具体技术方案，所述步骤(4)中蚯蚓的粉碎过程采用低温研磨粉碎。

做为具体技术方案，所用蚯蚓为孵化10天之后尚未性成熟的蚯蚓。

该检测方法可用于检测猪场土壤中的病毒，包括猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒等。

本发明可用于检测非洲猪瘟疫情前后猪场周边环境土壤中的非洲猪瘟病毒，提前防范风险或延迟猪场复产，能有效检测出猪场及周边土壤中的病毒，检测方法简单、高效，本发明具有以下优势：

检测效率高，准确性高

由于直接检测土壤中是否存在非洲猪瘟病毒难度较大，需要大量且频繁的采样，且无法准确测定土壤中是否存在非洲猪瘟病毒，目前仍未有行之有效的方法来准确检测土壤中的非洲猪瘟病毒。本发明采用蚯蚓作为病毒富集对象，由于蚯蚓主要以泥土中的物质为食物，将蚯蚓投放在可能含有非洲猪瘟病毒的土壤中，随着蚯蚓的进食、代谢、钻洞，将土壤中的非洲猪瘟富集到身体内外，大大提高土壤中非洲猪瘟病毒的检测效率和准确性。

对养殖场风险预判，降低养殖户损失

该方法可在非洲猪瘟发生后的猪场或周边猪场进行养殖风险预判。当养殖场周边存在非洲猪瘟疫情后，疫区周边养殖场除增加养殖区的消毒外，可以采用该方法进行预判，判定养殖场周边的土壤中是否存在非洲猪瘟病毒，及时处理，提前防范，有效应对，能够大大降低发病风险，减少经济损失。针对疫区养殖户，在清理、消毒、静置后，检测疫区地下土壤中是否仍有非洲猪瘟病毒存活，能够及时把握复产时间，减少经济损失。

针对性强，对猪场及周边的消毒工作做到有的放矢

由于病毒看不见摸不着，因此在对猪场的日常消毒过程中具有一定的盲目性，可能大力度消毒的区域并没有病毒，而被忽略的死角或场所却携带有病毒，这在一定程度上增加了猪场的运营成本。采用本发明的方法可以有针对性的对猪场的各个区域进行消毒，划出消毒重点区域和安全区域，消毒工作有的放矢，节约运营成本。

附图说明

图1实施例3中荧光定量检测的扩增曲线图；

图2实施例4中荧光定量检测的扩增曲线图；

图3实施例5中荧光定量检测的扩增曲线图；

图4实施例6中荧光定量检测的扩增曲线图。

具体实施例

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，需要指出的是，以下实施方式仅是以例举的方式对本发明所做的解释性说明，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。

实施例1

一种检测猪场土壤中是否携带非洲猪瘟病毒的方法，包括将蚯蚓投放在猪舍周边或生产污区或病死猪处理位置或猪场进出入口的土壤中培养，之后再检测蚯蚓体内外是否携带非洲猪瘟病毒的步骤。

该方法先将蚯蚓投放到猪舍周边或生产猪舍周边或生产污区或病死猪处理位置或猪场进出入口的土壤，培养后将蚯蚓回收，检测蚯蚓体内外是否含有非洲猪瘟病毒。该方法简单易行，检测成本低，效率高，可有效预防养殖场感染非洲猪瘟病毒。

实施例2

一种检测猪场土壤中是否携带非洲猪瘟病毒的方法，具体包括以下步骤：

(1)蚯蚓投放场地选择与处理：选择猪舍周边或生产污区或病死猪处理位置活猪场进出入口做为待检测场所，用消毒处理后的纯净水浇透；

(2)蚯蚓投放：将蚯蚓投放至待检测场所，之后用低功率紫外灯照射地面；

(3)蚯蚓回收：投放后培养3-5天，根据蚯蚓粪便位置，挖出或引诱出蚯蚓，不同区域蚯蚓分开放置，并做好标记，蚯蚓回收数量大于投放总数量的70％；

(4)检测：将回收的蚯蚓粉碎后，采用荧光PCR方法检测是否携带非洲猪瘟病毒，若非洲猪瘟病毒检测呈阳性，表明消毒不彻底，对阳性区域继续清理、消毒；若检测非洲猪瘟病毒呈阴性，重复步骤(1)—步骤(4)2-4次，直至所有检测呈阴性。

实施例3

一种检测猪场土壤中是否携带非洲猪瘟病毒的方法，具体包括以下步骤：

(1)蚯蚓投放场地选择与处理：选择农业农村部公布的某发病猪舍周边、生产污区、病死猪处理位置做为待检测场所，用消毒处理后的纯净水浇透土壤表层；检测时间为该养殖场非洲猪瘟疫情爆发处理后一周，测定日平均气温15-20℃，适合蚯蚓生长；对被检测区域按3-5m²的大小进行标记，共标记检测区域10块，编号从1-10顺序编号，检测面积、检测位置、蚯蚓投入量如下表1所示；

(2)蚯蚓投放：按照每平方10-15条的数量投放蚯蚓，共投放蚯蚓560条，蚯蚓投放前先对蚯蚓进行净化培养后抽样检测蚯蚓中非洲猪瘟病毒呈阴性；之后将蚯蚓投放至待检测区域，投放后用低功率紫外灯照射地面，紫外灯功率为16w，照射时间为5min；所有蚯蚓均钻入土壤，投放有效；

(3)蚯蚓回收：每天浇水，保持测量位置土壤湿润，投放后培养3天，根据蚯蚓粪便位置，挖出蚯蚓，不同区域蚯蚓分开放置，并做好标记，蚯蚓回收数量如表1所示，每个测量点回收比例大于70％，有效；

(4)检测：将每个区域回收的蚯蚓全部粉碎后取样，采用荧光PCR方法进行检测，检测是否含有非洲猪瘟病毒。

检测结果如表1、图1所示。

表1本例中各检测点蚯蚓投放量及检测结果表

由图1与表1可知，该被检测猪舍粪便堆积区域检测出非洲猪瘟病毒，该区域消毒不彻底，需进一步加大消毒力度，猪场入口、围墙外侧未检测出非洲猪瘟病毒，病死猪处理区，猪场草坪存在可疑情况，其他检测区域非洲猪瘟病毒呈阴性，综合分析，在后续的消毒处理过程中应加大对粪便堆积区，病死猪处理区，猪场草坪位置的消毒处理频率与力度。该猪场尚不能进行复产，不能解除封锁。

实施例4

一种检测猪场土壤中是否携带非洲猪瘟病毒的方法，具体包括以下步骤：

(1)蚯蚓选种与净化：蚯蚓产地：湖南邵阳，将蚯蚓放置已经净化消毒后的培养基中，培养7天，抽样检测蚯蚓中非洲猪瘟病毒均呈阴性；

(2)蚯蚓投放场地选择与处理：选择农业农村部公布的某发病猪场周边、生产污区、病死猪处理位置做为待检测场所，对被检测区域按3-5m²的大小进行标记，共标记检测区域11块，编号从1-11顺序编号，检测面积、检测位置、蚯蚓投入量如下表1所示；将土壤表层松动，松动深度为3-5cm表层，用消毒处理后的纯净水浇透；检测时间为该养殖场非洲猪瘟疫情爆发处理后第9天，检测时白天平均气温11-17℃，晚平均气温10-14℃，适合蚯蚓生长；

(3)蚯蚓投放：按照每平方15条的数量投放蚯蚓，共投放蚯蚓690条，投放后用低功率紫外灯照射地面，紫外照射功率为20W，照射时间为3min；所有蚯蚓均钻入土壤，投放有效；

(4)蚯蚓回收：每天浇水，浇水需控制水温20-35℃，所用水需进行消毒处理；土壤湿度以轻抓土壤可有少量水挤出为宜，投放后培养3天，根据蚯蚓粪便位置，挖出蚯蚓，11个不同区域的蚯蚓分开放置，并做好标记，蚯蚓总回收数量576条回收率83％，大于70％，回收有效，如表1所示；

(5)检测：将每个区域回收的蚯蚓全部粉碎后取样，采用荧光PCR方法进行检测，以确定是否含有非洲猪瘟病毒。

荧光PCR检测的扩增曲线图如图2所示，结果如表2所示。

表2本例中各检测点蚯蚓投放量及检测结果表

由图2、表2可知，该被检测猪场病死猪处理区域，非洲猪瘟病毒检测呈阳性，粪便堆积区域存在可疑情况，猪场入口、围墙外侧检测结果呈阴性，属于相对安全区域。对于该猪场今后的消毒工作中，需加大对粪便堆积区域、病死猪处理区域的消毒强度和频率。该猪场目前尚不能复产，不能解除封锁，需进一步消毒、净化处理，尤其是对病死猪处理区与粪便堆积区做进一步的消毒。同时，在病死猪处理区与粪便堆积区的蚯蚓通过紫外线、高盐进行捕杀，防止由于蚯蚓的活动导致进一步的交叉污染。

实施例5

一种检测猪场土壤中是否携带非洲猪瘟病毒的方法，该方法可用于对未感染非洲猪瘟病毒的猪场做风险评估，具体包括以下步骤：

(1)蚯蚓投放场地选择与处理：选择猪舍周边、生产污区、猪场进出口位置做为待检测场所，用消毒处理后的纯净水浇透；

(2)蚯蚓投放：将蚯蚓投放至待检测场所，投放数量及投放位置如表3所示，投放后用低功率紫外灯照射投放区域地面；紫外灯照射功率为10w，照射时间5min；

(3)蚯蚓回收：投放后培养5天，根据蚯蚓粪便位置，挖出蚯蚓，不同区域蚯蚓分开放置，并做好标记，蚯蚓回收数量大于投放总数量的70％；

(4)检测：将每个区域回收的蚯蚓全部粉碎后取样，采用荧光PCR方法进行检测，以确定是否含有非洲猪瘟病毒。

检测结果如表3所示，荧光定量检测的扩增曲线图如图3所示。

表3本例中各检测点蚯蚓投放量及检测结果表

表3、图3可知，所检测猪场的所有被检测区域非洲猪瘟病毒检测均呈阴性，表明该猪场相对安全，土壤中未检测出非洲猪瘟病毒，无需恐慌，只需做好日常消毒工作即可。

为进一步验证试验效果，采用本实施例的方法重复检测相同区域位置2次，检测结果显示非洲猪瘟病毒呈阴性。该猪场相对安全，感染非洲猪瘟病毒的风险较低。

实施例6

一种检测猪场土壤中是否携带非洲猪瘟病毒的方法，该方法可用于对非洲猪瘟疫区的猪场标记风险位置，为疫情猪场后续有针对性的消毒工作做指导，该方法具体包括以下步骤：

(1)蚯蚓选择：分别选择孵化10天至性成熟前(未成熟)的蚯蚓与成熟蚯蚓做为投放蚯蚓，随机抽样检测蚯蚓非洲猪瘟病毒呈阴性；

(1)蚯蚓投放场地选择与处理：选择农业农村部公布的某发病猪场周边、生产污区、猪场进出口位置做为待检测场所，用消毒处理后的纯净水浇透；

(2)蚯蚓投放：将两种不同生长阶段的蚯蚓投放至待检测场所，投放数量及投放位置如表4所示，投放后用低功率紫外灯照射投放区域地面，紫外灯功率16w，处理时间4min；

(3)蚯蚓回收：投放后培养3天，根据蚯蚓粪便位置，挖出或用诱导剂引诱出蚯蚓，不同区域蚯蚓分开放置，并做好标记，蚯蚓回收数量大于投放总数量的70％；

(4)检测：将每个区域回收的蚯蚓全部粉碎后取样，采用荧光PCR方法进行检测，以确定是否含有非洲猪瘟病毒。

表4本例中各检测点蚯蚓投放种类数量及检测结果表

表4为本实施例中非洲猪瘟病毒检测结果，荧光定量检测的扩增曲线如图4所示。

由表4可知，在粪便堆积区检测出非洲猪瘟病毒呈阳性，该区域风险较高，应着重对该区域进行消毒处理。编号为4的区域检测出非洲猪瘟病毒，并且所采用的的蚯蚓为已经性成熟的蚯蚓，为预防该区域蚯蚓已经繁殖，并防止蚯蚓卵中含有非洲猪瘟病毒，另需对该区域进行蚯蚓卵、幼虫的捕杀，防止携带有非洲猪瘟病毒的蚯蚓卵孵化后对其他区域造成感染。对该区域需延长处理时间和处理周期，直至无蚯蚓幼虫孵化为宜。

为避免性成熟之后的蚯蚓繁殖带来的较繁琐的处理措施，在本实验过程中应优先选用尚未进入性成熟阶段的蚯蚓做为实验载体。