本发明涉及一种融合蛋白及其合成方法，特别是涉及一种tthdna聚合酶融合蛋白及其合成方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
tthdna聚合酶具有逆转录和pcr扩增双重功能的dna多聚酶，可以用于pcr和一步法rt-pcr，特别是后者，是直接从rna为模板直接扩增片段常用的一种工具酶，古细菌的sso7d的dna结合功能域在分子生物学的工具酶上，也得到较为广泛的应用，如与taq和pfudna多聚酶进行融合表达，可使得酶的扩增速度增加几倍，显著性得提高酶效率，tthdna聚合酶是一步法rt-pcr扩增中关键酶，活性高低是试验是否成功的关键因素，为增强tthdna聚合酶的效率，我们将古细菌的sso7d的dna结合功能域和tthdna聚合酶融合表达，得到活性更高的聚合酶，有利于高效率进行rt-pcr扩增。
技术实现要素：
本发明的主要目的是为了提供一种tthdna聚合酶融合蛋白及其合成方法，聚合酶活性更高，更适合于高效率一步法rt-pcr的扩增。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
一种tthdna聚合酶融合蛋白，tthdna聚合酶的氨基末端引入古细菌的sso7d的dna，在构建融合蛋白的同时在tthdna聚合酶羧基末端引入6个组氨酸的亲和标签，采用镍亲和柱进行纯化。
优选的，将tthdna聚合酶与古细菌的sso7ddna结合功能域进行融合表达，得到pcr扩增效率和活性更高的融合蛋白。
优选的，sso7d片段融合在tthdna聚合酶融合在氨基末端。
优选的，sso7d蛋白序列为：
优选的，tthdna聚合酶蛋白序列为：
优选的，tthdna聚合酶蛋白序列为：
一种tthdna聚合酶融合蛋白合成方法，包括如下步骤：
步骤1：tthdna聚合酶的氨基末端引入古细菌的sso7d的dna，在构建融合蛋白的同时在tthdna聚合酶羧基末端引入6个组氨酸的亲和标签，用镍亲和柱进行纯化；
步骤2：将tthdna聚合酶和古细菌的sso7ddna结合功能域进行融合表达，得到了pcr扩增效率和活性更高的融合蛋白；
步骤3：将sso7d片段融合在tthdna聚合酶融合在氨基末端；
步骤4：得到tthdna聚合酶蛋白。
进一步的，sso7d蛋白序列为：
进一步的，tthdna聚合酶蛋白序列为：
进一步的，tthdna聚合酶蛋白序列为：
本发明的有益技术效果：本发明提供的tthdna聚合酶融合蛋白，是一种tthdna聚合酶融合蛋白，是将古细菌的sso7d的dna结合功能域和tthdna聚合酶进行融合表达，融合基团设计在氨基末端，在tthdna聚合酶羧基末端引入6个组氨酸标签，预期得到的重组蛋白具有更高的扩增效率，同时因在重组的融合蛋白氨基末端引入6个组氨酸标签，简化了酶的纯化方法，纯化工艺通过镍亲和柱即可实现，新的酶在一步法rt-pcr扩增中，具有更高的效率。
附图说明
图1为按照本发明的tthdna聚合酶融合蛋白的新酶扩增效率示意图。
图中：1为dna分子量标准，2为2单位tthdnapolymerase扩增的条带，3为2单位ssod7-tthdnapolumerase扩增的条带。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本实施例1提供的tthdna聚合酶融合蛋白，其tthdna聚合酶氨基末端引入古细菌的sso7d的dna，在构建融合蛋白的同时在tthdna聚合酶羧基末端引入6个组氨酸的亲和标签，用镍亲和柱进行纯化。
将所述tthdna聚合酶和古细菌的所述sso7ddna结合功能域进行融合表达，得到了效率和活性更高的融合蛋白，更加适合于一步rt-pcr扩增。
将所述sso7d片段融合在所述tthdna聚合酶氨基末端，6个组氨酸标签融合在羧基末端。
该实施例1是一种tthdna聚合酶融合蛋白，首先将sso7d-tthdna聚合酶融合蛋白序列优化的核苷酸序列引入ncoi和xhoi位点序列，该人工合成序列，通过基因合成获得。
克隆的载体选用pet28a,构建的表达载体转入bl21(de3)进行表达；表达的融合蛋白，破菌后，上清蛋白在75℃处理30分钟，冰上30分钟，离心收集上清，用nta-琼脂糖凝胶吸附，咪唑解离，得到酶纯度为95％的酶液，酶液在10mmtrishclph7.5,300mmkcl,1mmdtt,0.1mmedta,0.1％tritonx-100,50％甘油透析3次，-20℃保存。
其中作为本实施例中的sso7d蛋白序列为：
tthdna聚合酶蛋白序列为：
tthdna聚合酶融合蛋白序列为：
本实施例是一种tthdna聚合酶融合蛋白，是将古细菌的sso7d的dna结合功能域和tthdna聚合酶进行融合表达，融合基团设计在氨基末端，在tthdna聚合酶的羧基末端引入6个组氨酸标签。预期得到的重组蛋白具有更高的扩增效率，同时因在重组的融合蛋白羧基末端引入6个组氨酸标签，简化了酶的纯化方法，纯化工艺通过镍亲合柱结合即可实现，新的酶分子用于一步法rt-pcr扩增，显示出更高的效率。
为验证新酶的扩增效率，我们采用培养的hela细胞，用trizol提取总rna,取1微克总rna用oligo-dt作为逆转录引物，然后用引物正向引物5’-atgggcgacaaagggacgcgagtgt-3’和反向引物cgccgccccgagactccaccagct进行pcr扩增人beta-arrestin的cdna。
在20微升50mmbiscine/koh,ph8.2,115mmkac,2.5mmmnac2,8％甘油体系中缓冲液里进行逆转录，里面含有1微克的上述的总rna,200单位rnaseainhibitor，0.3mmdntp，oligo-dt0.5微克和2单位酶。先在65℃反应30分钟，再进行pcr反应，pcr的反应条件为，94℃先变性1分钟，再在94℃，60℃，72℃，三个温度下循环反应30个循环，最后在72℃延伸10分钟，电泳结束后，用琼脂糖电泳分析目的条带。
结果表明，如图1所示，用新酶和没有添加sso7d功能域的tthdnapolymerase进行比较，新酶扩增效率显著高于没有添加sso7d功能域tthdnapolymerase。
综上所述，在本实施例中，本实施例提供的tthdna聚合酶融合蛋白，是一种tthdna聚合酶融合蛋白，是将古细菌的sso7d的dna结合功能域和tthdna聚合酶进行融合表达，融合基团设计在氨基末端，在tthdna聚合酶羧基末端引入6个组氨酸标签，预期得到的重组蛋白具有更高的扩增效率，同时因在重组的融合蛋白氨基末端引入6个组氨酸标签，简化了酶的纯化方法，纯化工艺通过镍亲和柱即可实现，新的酶在一步法rt-pcr扩增中，具有更高的效率。
以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。
序列表
<110>南京瓦尔生物医药有限公司
<120>一种tthdna聚合酶融合蛋白质及其合成方法
<130>202091
<140>2019105427966
<141>2019-06-21
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>62
<212>prt
<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
sso7d蛋白序列为：
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