本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种脱氢表雄酮多克隆抗体及其制备方法、铂纳米花探针和脱氢表雄酮酶联免疫试剂盒。
背景技术：
肾上腺皮质癌是一种罕见的具有侵袭性的来源于肾上腺皮质的肿瘤，发病率估计在每100万人中0.7～2例，占所有癌症病例的0.02％。即使手术切除，约有75％-85％患者会出现术后复发，并且预后不佳。在大多数患者中，其5年生存率低于35％。也就是说肾上腺皮质癌具有可预见性差、难根除、生存率低的特点。因此，在临床中正确、较早的识别肾上腺皮质癌显得比较重要。在临床上，ct和针吸活组织检查并不能完全确诊为肾上腺皮质癌。据相关文献报导，患有肾上腺皮质癌的患者的血清或者尿液与健康人比较，类固醇类激素分泌较多。据报导，脱氢表雄酮是肾上腺皮质癌灵敏和可信赖的生物标记物，因为当肿瘤用成像的方法还不能确定时，而脱氢表雄酮的含量会有显著的提高。因此，在临床上检测脱氢表雄酮对肾上腺皮质癌的诊断有一定的实际运用。针对脱氢表雄酮的检测，建立灵敏度高、安全、成本低的免疫分析方法用于辅助肾上腺皮质癌的诊断是十分有意义的。
多克隆抗体可以识别同一抗原的多个表位,因此在免疫检测中,可以识别更多的抗原，也比较少受到抗原构象变化的影响。因此，相比于单克隆抗体，在相同条件下，利用多克隆抗体可以提高检测的灵敏度，对一些丰度偏低的蛋白更容易检出。目前多克隆抗体的制备是利用抗原免疫实验动物，提取免疫实验动物血液中的抗体即为多克隆抗体。但这种制备方法制得的多克隆抗体效价低。
技术实现要素：
本发明提供了一种脱氢表雄酮多克隆抗体及其制备方法、铂纳米花探针和脱氢表雄酮酶联免疫试剂盒，解决了现有的多克隆抗体的制备方法制得的多克隆抗体效价低的问题。
其具体技术方案如下：
本发明提供了一种脱氢表雄酮多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：采用碳二亚胺法将脱氢表雄酮与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫原；
步骤2：使用免疫原免疫兔子，取血离心，取上清即为脱氢表雄酮多克隆抗体。
本发明提供的多克隆抗体的制备方法为常规的针对小分子抗原的制备方法。采用碳二亚胺法将脱氢表雄酮半抗原和牛血清蛋白偶联得到免疫原，通过对兔子免疫，得到效价高(可达到256000)，特异性好的脱氢表雄酮多克隆抗体。
本发明步骤1具体为：将脱氢表雄酮半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺溶于dmf中反应，得到反应液，将反应液加入含牛血清蛋白的缓冲液中反应，纯化，离心，收集上清得到免疫原。
本发明中，脱氢表雄酮半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺的摩尔比优选为0.1：0.15：0.15；
脱氢表雄酮半抗原与牛血清蛋白的用量比为(0.1-0.2)mmol：(100-200)mg，优选为0.1mmol：113mg；
所述含牛血清蛋白(bsa)的缓冲液的制备具体为：将bsa充分溶解在pbs中，得到含牛血清蛋白的pbs缓冲液，其中，pbs缓冲液的浓度为0.01m，ph值为7.4，bsa的浓度为28.25mg/ml；
所述纯化优选将反应得到的反应液于pbs缓冲液中透析三天，其中，pbs缓冲液的浓度为0.01m，ph值为7.4。
本发明步骤2中，免疫原免疫兔子前还包括：使用弗氏完全佐剂对免疫原进行乳化；免疫原与弗氏完全佐剂的用量比优选为1mg：1ml；
所述免疫的周期为两周，共免疫五次；
所述取血的位置优选为在免疫兔耳缘静脉取血。
本发明还提供了一种脱氢表雄多克隆抗体，由上述制备方法制备。
本发明还提供了一种铂纳米花探针，包括：铂纳米花和与所述铂纳米花静电结合的脱氢表雄酮抗体。
本发明首次将铂纳米花与脱氢表雄酮抗体结合，作为脱氢表雄酮特异性检测探针。
本发明中，所述脱氢表雄酮抗体脱氢表雄酮单克隆抗体或脱氢表雄酮多克隆抗体。
本发明还提供了一种铂纳米花探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将聚乙烯比咯烷酮和甘氨酸加入水中，再加入h2ptcl6·6h2o混合，得到混合液，将所述混合液进行水热反应，得到所述铂纳米花；
步骤2：将所述铂纳米花水溶液、碱溶液、脱氢表雄酮抗体进行混合，加入封闭液进行封闭，得到铂纳米花探针。
本发明步骤1中，所述聚乙烯比咯烷酮、甘氨酸和h2ptcl6·6h2o的质量体积比为(400～405)mg：(75～80)mg：1.0ml，优选为400mg：75mg：1.0ml；
所述h2ptcl6·6h2o的浓度为40mm；
所述聚乙烯比咯烷酮的分子量为10000；
所述混合液优选采用磁力搅拌器进行搅拌，直至得到澄清的淡黄色溶液。
所述水热反应的温度为180～200℃，时间为6～7h，优选在200℃下反应6h；
所述水热反应结束后，还包括：冷却至室温后，离心收集暗棕色沉淀，采用超纯水和乙醇多次清洗后得到的沉淀即为铂纳米花；
得到铂纳米花后，优选将所述铂纳米花分散在超纯水中。
本发明铂纳米花制备简单，制得的铂纳米花，成本低廉，可用于脱氢表雄酮浓度的检测。
本发明步骤2中，所述碱溶液中的碱性试剂优选为k2co3，碱溶液起调节ph作用，使铂纳米花水溶液的ph达到抗体偶联的等电点，便于铂纳米花水溶液与抗体的静电结合；
所述封闭液优选为牛血清白蛋白；
所述混合采用搅拌的方式进行混合，所述搅拌的温度为室温，时间为1～2h；
所述加入封闭液后采用搅拌的方式进行混合，所述搅拌的温度为室温，时间为1～2h；
所述加入封闭液进行封闭后，还包括：离心除去未结合的脱氢表雄酮抗体，收集沉淀，即为铂纳米花探针。得到铂钠米花探针沉淀后，优选将沉淀用重悬液重悬；所述重悬液为含的5％蔗糖，2％海藻糖，1％peg20000，1％bsa和0.25％tween-20的pbs缓冲液；
所述铂纳米花水溶液：碱溶液：脱氢表雄酮抗体：封闭液：重悬液的体积比为1000：6：2：100：30；
所述铂纳米花水溶液的浓度为1mg/ml；所述碱溶液的浓度为1mg/ml，所述封闭液的浓度为100mg/ml。
本发明还提供了一种脱氢表雄酮酶联免疫试剂盒，包括上述铂纳米花探针。
本发明中，所述试剂盒还包括：脱氢表雄酮标准溶液、显色剂、洗涤液、封闭液、终止液和酶标板；
所述脱氢表雄酮标准溶液为：将脱氢表雄酮标准品(1mg/ml)采用稀释液稀释得到的105、104、103、102、10、1、0.1、0ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液溶液；所述稀释液为40％甲醇溶液；
所述显色剂优选为tmb；
所述洗涤液优选为pbst；
所述终止液优选为2m的h2so4；
所述封闭液优选为30mg/ml的脱脂奶粉；
所述酶标板优选为包被有碳酸盐缓冲液包被抗原的96孔酶标板。
本发明中，包被抗原由脱氢表雄酮和卵清蛋白通过混合酸酐法制得，具体为：
将脱氢表雄酮半抗原用甲酰胺溶解后冷却，加入氯甲酸异丁酯和三正丁胺进行反应，得到反应液，将反应液加入含卵清蛋白的缓冲液中反应，纯化，得到包被抗原。
本发明中，所述脱氢表雄酮半抗原、氯甲酸异丁酯和三正丁胺的用量比为0.11mol：26μl：13μl；
脱氢表雄酮半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺优选在4℃下搅拌反应30min；
所述脱氢表雄酮与所述卵清蛋白的用量比为(0.1-0.2)mmol:(100-150)mg，优选为0.11mmol:121mg；
所述含牛血清蛋白缓冲液制备具体为：将卵清蛋白溶解在含有dmf的碳酸盐缓冲液中，得到含牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液，其中，碳酸盐缓冲液的浓度为0.1m，ph值为9.6，牛血清蛋白的浓度为17.3mg/ml；
所述纯化优选将反应得到的反应液于pbs缓冲液中透析三天，其中，pbs缓冲液的浓度为0.01m，ph值为7.4。
本发明还提供了一种利用上述铂纳米探针检测脱氢表雄酮浓度的酶联免疫分析方法，包括以下步骤：
步骤1：将所述铂纳米探针与不同浓度的脱氢表雄酮标准样品进行酶联免疫反应，将检测信号与脱氢表雄酮抗原浓度建立标准曲线；
步骤2：将所述铂纳米探针与未知浓度的脱氢表雄酮的待测样品进行酶联免疫反应，根据步骤1所述的标准曲线，确定所述待测样品的浓度。
本发明首次将铂纳米花用于脱氢表雄酮的检测探针上，基于本发明铂纳米花探针能特异性识别脱氢表雄酮和具有过氧化物酶活性，将本发明提供的铂纳米花探针应用于脱氢表雄酮的检测上，与传统elisa相比，铂纳米花可以替代天然的辣根过氧化酶用于酶联免疫分析方法，可起到催化显色作用，不需要添加酶标二抗从而使得脱氢表雄酮检测过程简单方便，检测时间更短，灵敏度高，检测限低，可实现实际样品中脱氢表雄酮的快速检测。该检测方法检测成本低，具有极大的应用价值，市场前景广阔。
本发明步骤1具体为：在酶标板上优选采用脱氢表雄酮包被抗原包被，然后将铂纳米探针与不同浓度的脱氢表雄酮标准溶液的混合液加入包被后的酶标板中进行反应，再加入显色液进行显色反应，终止显色反应后，测量od450，计算抑制率，建立抑制率与脱氢表雄酮的标准曲线；
在酶标板上采用脱氢表雄酮包被抗原的碳酸盐缓冲溶液进行包被。所述酶标板为96孔板，所述包被采用的脱氢表雄酮包被抗原为脱氢表雄酮半抗原与载体蛋白偶联得到，包被浓度为0.3μg/ml，100μl/孔，在37℃包被2h。
所述包被后，优选采用30mg/ml的脱脂奶粉进行封闭。
将铂纳米探针与不同浓度的脱氢表雄酮标准溶液的混合液加入包被后的酶标板中进行反应后，得到多个反应体系。所述脱氢表雄酮标准溶液的浓度为105、104、103、102、10、1、0.1、0ng/ml；所述铂纳米探针与所述脱氢表雄酮标准溶液的体积比为1：1；所述反应的时间为1～1.5h，温度为37℃。
然后向多个反应体系中加入显色液进行显色，优选加入硫酸终止显色反应，测量od450，计算抑制率，建立抑制率与脱氢表雄酮的标准曲线，本发明实施例中，标准曲线为：方程为：y＝-90.15/[1+(x/15.76)^0.69]+86.49，r2＝0.999，其中x为脱氢表雄酮浓度，y为抑制率，抑制率计算公式为(od空白-od样品)/od空白*100％。所述显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺tmb、过氧化氢、磷酸柠檬酸缓冲液和水的混合溶液；所述显色的时间为10～15min，温度为37℃；所述硫酸的浓度为2m。
本发明步骤2具体为：在酶标板上采用脱氢表雄酮包被抗原包被，然后将铂纳米探针与未知浓度的脱氢表雄酮抗原的待测样品的混合液加入包被后的酶标板中进行反应，再加入显色液进行显色反应，终止显色反应后，测量od450，计算抑制率，代入脱氢表雄酮的标准曲线方程，计算得到待测样品的浓度；
在酶标板上优选采用脱氢表雄酮抗原的碳酸盐缓冲溶液进行包被。所述酶标板为96孔板，所述包被采用的脱氢表雄酮抗原的浓度为0.3μg/ml，100μl/孔，在37℃包被2h。
所述包被后，优选采用30mg/ml的脱脂奶粉进行封闭。
将铂纳米探针与未知浓度的脱氢表雄酮抗原的待测样品的混合液加入包被后的酶标板中进行反应；所述铂纳米探针与所述待测样品的体积比为1：1；所述反应的时间为1～1.5h，温度为37℃。
然后加入显色液进行显色，优选加入硫酸终止显色反应，测量od450，计算抑制率，代入脱氢表雄酮的标准曲线方程，计算得到待测样品的浓度。所述显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺tmb，过氧化氢，磷酸柠檬酸缓冲液和水的混合溶液；所述显色的时间为10～15min，温度为37℃；所述硫酸的浓度为2m。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种脱氢表雄酮多克隆抗体的制备方法，该制备方法采用碳二亚胺法将脱氢表雄酮和牛血清蛋白偶联得到免疫原，通过对兔子免疫，得到效价高，特异性好的脱氢表雄酮多克隆抗体。而且，该多克隆抗体的制备方法简单，易于操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1本发明实施例中铂纳米花探针检测脱氢表雄酮浓度的酶联免疫分析方法工作原理图；
图2为本发明实施例中脱氢表雄酮与浓度抑制率的标准曲线。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，脱氢表雄酮购自上海阿拉丁股份有限公司，雌性新西兰大白兔购自广东省医学实验动物中心。
实施例1
脱氢表雄酮半抗原与载体蛋白的偶联
采用混合酸酐法将脱氢表雄酮半抗原和卵清蛋白偶联得到包被抗原，采用碳化二亚胺法将脱氢表雄酮半抗原和牛血清白蛋白偶联得到免疫原。
(1)包被抗原的制备：
①将0.11mmol脱氢表雄酮半抗原用1.5ml甲酰胺(dmf)溶解，冷却至10℃，加入26μl氯甲酸异丁酯和13μl三正丁胺，4℃搅拌反应30min，即得a液；
②称取卵清蛋白(ova)121mg，使之充分溶解在7ml含有770μldmf的碳酸盐缓冲液(0.1m，ph9.6)中，即可得到b液；
③将a液逐滴缓慢滴加到该b液中，4℃过夜搅拌反应。取最终反应物于磷酸盐缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)中透析纯化三天，10000g离心10min，收集上清液，即得到包被抗原。
(2)免疫原的制备：
①将0.1mmol脱氢表雄酮半抗原、0.15mmoln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，以及0.15mmol碳化二亚胺(dcc)充分溶解于1.5mldmf中，于室温下搅拌14h，即可得到a液；
②称取牛血清白蛋白(bsa)113mg，使之充分溶解在4mlpbs(0.01m，ph7.4)中，即得到b液；
③将a液逐滴缓慢滴加到b液中，并于4℃搅拌过夜。取最终反应物于磷酸盐缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)中透析纯化三天，10000g离心10min，收集上清液，即得到免疫原。
实施例2
脱氢表雄酮多克隆抗体的制备
(1)将一只雌性新西兰大白兔在动物房适应饲养2周；
(2)取约1mg实施例1制得的免疫原，加入pbs至1ml，加入1ml弗氏完全佐剂，进行蛋白乳化；
(3)用无菌注射器吸取已与弗氏完全佐剂乳化的免疫原，对新西兰大白兔背部分多个位点进行皮下注射(注射位点需先用75％酒精棉消毒)；
(4)两周后，进行加强免疫，以初始免疫等量的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，对新西兰大白兔进行背部皮下多位点注射，共加强免疫4次，每次间隔时间均为2周；
(5)最后一次加强免疫7天后，对免疫新西兰大白兔进行耳缘静脉采血，室温静置2h，4℃过夜，4℃、4000r/min离心10min后小心吸取上层血清即为脱氢表雄酮多克隆抗体，分装后-20℃保存。
经测定，本实施例制得的脱氢表雄酮多克隆抗体的效价为256000。
将本实施例制得的脱氢表雄酮多克隆抗体进行特异性鉴定，结果如表1所示。表1的结果脱氢表雄酮多克隆抗体相比于与脱氢表雄酮结构类似的甾体化合物交叉反应小、特异性好。
表1
实施例3
本实施例利用铂纳米花检测脱氢表雄酮浓度的酶联免疫分析方法，具体步骤如下：
步骤一、制备铂纳米花水溶液，具体为：
将400mg聚乙烯比咯烷酮和75mg甘氨酸加入7.0ml水中，再加入1.0mlh2ptcl6·6h2o，该混合溶液用磁力搅拌器搅拌5分钟得到澄清的淡黄色溶液，然后全部转移至teflon-lined高温反应釜中，在高温反应器中200℃反应6h。反应结束后，冷却至室温，通过离心收集暗棕色沉淀并用超纯水和乙醇多次清洗，最后将沉淀分散到8ml超纯水中，室温储存，备用。
步骤二、制备铂纳米花探针，具体为：
在试管中依次加入1ml1mg/ml铂纳米花水溶液、6μl1mg/ml的k2co3溶液，然后将混合溶液用磁力搅拌器搅拌2分钟。然后，往其中加入2μl40mg/ml脱氢表雄酮的脱氢表雄酮多克隆抗体，在室温下搅拌1小时。然后，在其中加入100μlbsa(100mg/ml)溶液再搅拌1小时后，离心去除未结合抗体，收集沉淀，并将沉淀用含5％蔗糖，2％海藻糖，1％peg20000，1％bsa和0.25％tween-20的pbs缓冲液重悬，备用。
步骤三、利用铂纳米花探针检测脱氢表雄酮(检测机理如图1所示)，建立标准曲线，具体为：
a、将脱氢表雄酮标准品(1mg/ml)采用稀释液配制浓度为105、104、103、102、10、1、0.1、0ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，所述稀释液为40％甲醇溶液；
b、包被：在96孔酶标板用碳酸盐缓冲液包被抗原包被(dhea-ova，0.3μg/ml，100μl/孔)，在37℃反应2小时，用pbst洗涤三次，拍干；
c、封闭：取30mg/ml的脱脂奶粉置于酶标孔中，270μl/孔，在37℃反应1小时，用pbst洗涤三次，拍干；
d、竞争：分别加入铂纳米花探针与脱氢表雄酮标准溶液1:1的混合溶液，100μl/孔，在37℃反应1小时，用pbst洗涤三次，拍干；
e、显色：加入由tmb，过氧化氢，磷酸柠檬酸缓冲液和水的混合溶液，体积比为：50:1:450:500配制得到的显色液，100μl/孔，在37℃反应15分钟；
f、终止和读数：用2mh2so4终止反应，50μl/孔，在酶标仪读取od450nm。
g、计算抑制率，建立标准曲线：以标准溶液浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，并进行线性拟合，抑制率与脱氢表雄酮浓度的线性关系如图2所示，标准曲线方程为：y＝-90.15/[1+(x/15.76)^0.69]+86.49，r2＝0.999，其中x为脱氢表雄酮浓度，y为抑制率，抑制率计算公式为(od空白-od样品)/od空白*100％。
实施例4
本实施例利用铂纳米花探针检测人尿液中添加脱氢表雄酮标准浓度的样品，具体步骤如下：
a、包被：在96孔酶标板用碳酸盐缓冲液包被抗原(dhea-ova，0.3μg/ml，100μl/孔)，在37℃反应2小时，用pbst洗涤三次，拍干；
b、封闭：取30mg/ml的脱脂奶粉置于酶标孔中，270μl/孔，在37℃反应1小时，用pbst洗涤三次，拍干；
c、竞争：分别加入铂纳米花探针与添加脱氢表雄酮标准浓度的尿样的体积比1:1混合溶液，100μl/孔，在37℃反应1小时，用pbst洗涤三次，拍干；
d、显色：加入由tmb，过氧化氢，磷酸柠檬酸缓冲液和水的混合溶液，体积比为：50:1:450:500配制得到的显色液，100μl/孔，在37℃反应15分钟；
e、终止和读数：用2mh2so4终止反应，50μl/孔，在酶标仪读取od450nm。
f、计算抑制率，代入标准曲线方程：抑制率y的计算公式为od空白-od样品)/od空白*100％，将计算得到的y代入标准曲线方程：y＝-90.15/[1+(x/15.76)^0.69]+86.49，计算得到x，即为实际测得加标尿样中脱氢表雄酮的浓度。实际测得的加标尿样中脱氢表雄酮浓度见表2。
表2加标尿样中脱氢表雄酮浓度
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。