一种延迟家蚕化蛹的方法与流程

本发明涉及dna重组技术、蛋白质的表达技术，尤其涉及利用杆状病毒表达的重组egt蛋白延迟家蚕化蛹的方法。

背景技术：

昆虫杆状病毒基因组中存在一个编码蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(ecdysteroidudp-glucosyhransferase，egt)的基因egt。杆状病毒感染昆虫后产生的egt酶能催化昆虫体内尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucosyl)中的葡萄糖基转移到蜕皮激素上，使蜕皮激素失活，从而阻碍宿主昆虫的蜕皮和化蛹，延长幼虫的取食时间，以利于病毒自身的大量繁殖；而蜕皮激素是调控昆虫发育变态的最主要物质，因此，egt基因对于研究宿主昆虫的激素代谢以及激素对昆虫的发育调节作用等具有重要意义。

家蚕杆状病毒bmnpv编码的egt基因大小1518bp，该基因所编码的蛋白质由506个氨基酸组成，分子量约为57kda，该基因产物使家蚕体内蜕皮激素失活，打破了蚕体内保幼激素和蜕皮激素的平衡，阻碍了家蚕的正常蜕皮和蛹化，延长了感染家蚕的取食时间，有利于病毒自身的繁殖，是病毒在机体水平控制感染宿主的独特范例。在蚕业生产上，若能通过egt酶控制蜕皮激素延长化蛹对于采用鲜茧缫丝、提高蚕丝质量和生产效率具有重要意义。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的问题，填补现有技术的空白，本发明提供了一种延迟家蚕化蛹的方法。

家蚕的生长发育受保幼激素和蜕皮激素调节，本发明利用在桑叶中添加家蚕核型多角体病毒bmnpv编码表达的蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroidudp-glucosyltransferase，egt)，使家蚕体内蜕皮激素失去活性，从而延迟家蚕化蛹。其原理是egt酶可催化将udp-葡萄糖中的糖基转移至蜕皮激素的反应而使后者失活，从而阻断家蚕的蜕皮和化蛹。

本发明所采用的具体技术方案是：

(1)家蚕bmnpv编码的蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因的克隆：以家蚕核型多角体病毒bmnpv的基因组为模板，利用pcr方式克隆获得蓖麻egt基因；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行pcr产物分析，并用pcr纯化试剂盒纯化，随后将目的pcr产物克隆进invitrogen公司的ta克隆3.9kb的载体pcr2.1，获得pcr2.1-egt，利用dna测序确认克隆的egt基因序列正确性；

(2)含有egt基因的重组杆状病毒的构建：

用限制性内切酶bamhi和hindiii消化pcr2.1-egt得到蓖麻egt基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pbluebachisa获得重组体pbluebachisa-egt；通过共转染在家蚕培养细胞bmn内与bmnpvdna同源重组产生重组病毒；在离心管中加入1μg的pbluebachisa-egtdna和15μg的bmnpvdna，混匀，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，获得混合物；将该混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的bmn培养细胞，再用无血清的tc-100培养基培养24小时后，换成含有质量浓度为10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清液作为病毒储存原液，用来筛选重组病毒；重组病毒用病毒储存原液通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的重组病毒溶液，浓度为10⁸pfu/ml；本申请将此重组病毒命名为bmnpv-egt。

(3)家蚕培养细胞内表达重组egt蛋白：使用家蚕培养细胞bmn，在培养基中加入上述浓度为10⁶pfu/ml的重组病毒溶液，使病毒感染细胞，然后在27℃下培养，培养96小时后收集细胞和上清液；将收集的细胞和上清液作为重组egt蛋白纯化的起始材料，使用冻融法和超声波溶解细胞，经高速离心后再收集上清液；重组蛋白的n-末端带有6×his用ni-nta亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，获得重组egt蛋白；

(4)家蚕经口添食egt蛋白：在家蚕五龄第一天，将10mg/ml的上述重组egt蛋白喷于桑叶表面，通过添食的方法，让家蚕食下重组egt蛋白，由此实现延迟家蚕化蛹。

所述步骤(1)中，pcr反应的循环数、温度和时间的设计如下：94℃模板变性3分钟；30个循环，94℃变性30秒，57℃退火50秒，68℃延伸1分钟；最后1个循环，68℃延伸7分钟；

所述步骤(1)中，引物设计如下：正向引物：5'-agggatccctaaaagtgtgctatatg-3'，如seqidno.1，含有bamhi酶切位点，反向引物：5'-gaagcttgcaataacttgctgtcct-3'，如seqidno.2，含有hindiii酶切位点。

所述步骤(3)中，用ni-nta亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化获得重组egt蛋白，具体为：将该上清液结合于ni-nta柱，随后用硫酸缓冲液进行漂洗，最后用含有250mmol/l咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，获得重组egt蛋白。

所述步骤(3)最后，获得重组egt蛋白后通过sds-page考马斯亮蓝染色后鉴定重组egt蛋白。

本发明与背景技术相比，具有的有益效果是：

本发明巧妙底利用杆状病毒编码的egt蛋白具有催化蚕体内尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucosyl)中的葡萄糖基转移到蜕皮激素上，使蜕皮激素失活的特性，延迟了家蚕化蛹时间，解决了鲜茧必须立即烘干杀死蚕茧内蚕蛹的问题，节省了生产成本，并且能够提供蚕丝的品质，这为实现鲜茧缫丝和提高生产效率创造了条件，在蚕丝业生产中具有重要的应用价值。

附图说明

附图1为pbluebachisa质粒图谱；

附图2为实施例中获得的家蚕培养细胞表达与纯化egt电泳图；

附图3为实施例中经口添食egt延迟化蛹的效果图。

具体实施方式

本发明的实施例具体如下：

1、材料：杆状病毒基因组dna抽提试剂盒购于qiagene。dna处理和pcr扩增试剂盒购于takarabiomedicals(kyoto，japan)。ta克隆试剂盒、杆状病毒转移载体pbluebachisa、lipofectin和ni-nta树脂均为invitrogen公司产品。dna测序试剂盒购于peappliedbiosystems。家蚕核型多角体病毒bmnpv和家蚕培养细胞bmn由我们实验室保存。胎牛血清fcs、其培养基tc-100均为gibcobrl的产品。家蚕bmn细胞用添加10％(v/v)fcs的tc-100培养基在27℃培养。

2、工作流程：

1、利用egt延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：

(1)家蚕bmnpv编码的蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因的克隆：以bmnpv的基因组为模板，利用pcr技术克隆获得蓖麻egt基因；引物设计如下：正向引物：5'-agggatccctaaaagtgtgctatatg-3'，含有bamhi酶切位点，反向引物：5'-gaagcttgcaataacttgctgtcct-3'，含有hindiii酶切位点；pcr反应的循环数、温度和时间的设计如下：94℃模板变性3分钟；30个循环，94℃变性30秒，57℃退火50秒，68℃延伸1分钟；最后1个循环，68℃延伸7分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行pcr产物分析，结果如图2所示，并用pcr纯化试剂盒纯化，随后将目的pcr产物克隆进invitrogen公司的ta克隆3.9kb的载体pcr2.1，利用dna测序确认克隆的egt基因序列正确性；

(2)含有egt基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶bamhi和hindiii消化pcr2.1-egt得到egt基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pbluebachisa质粒(如图1所示)获得重组体pbluebachisa-egt；通过共转染在家蚕培养细胞bmn内与bmnpvdna同源重组产生重组病毒。在离心管中加入1μgpbluebachisa-egtdna和15μgbmnpvdna，混匀，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的bmn培养细胞；用无血清的tc-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，用来筛选重组病毒。重组病毒通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为10⁸pfu/ml。申请将此重组病毒命名为bmnpv-egt；

(3)家蚕培养细胞内表达重组egt蛋白：使用家蚕培养细胞bmn，在培养基中加入上述浓度为10⁶pfu/ml的重组病毒溶液，使病毒感染细胞，然后在27℃下培养；培养96小时后收集细胞和上清。

将收集的细胞和上清作为重组egt蛋白纯化的起始材料，使用冻融法和超声波溶解细胞，经高速离心后收集上清液。

由于重组蛋白n-末端带有6×his尾巴，可以用ni-nta亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；将上述上清液样品结合于ni-nta柱，随后用硫酸缓冲液进行漂洗，最后用含有250mmol/l咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过sds-page考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白。

(4)家蚕经口添食egt蛋白。在家蚕五龄第一天，将10mg/ml的上述重组egt蛋白喷于桑叶表面，通过添食的方法，让家蚕食下egt，这样经口添食egt能延迟化蛹，如图3所示，延迟化蛹时间与对照相比，平均延迟了96小时，因此，本申请专利的方法具有明显延迟家蚕幼虫化蛹的效果。

本发明涉及的序列如下：

seqidno.1：正向引物1

来源：人工合成

5'-agggatccctaaaagtgtgctatatg-3'

seqidno.1：反向引物1

来源：人工合成

5'-gaagcttgcaataacttgctgtcct-3'。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种延迟家蚕化蛹的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agggatccctaaaagtgtgctatatg26

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaagcttgcaataacttgctgtcct25