本发明涉及农作物遗传转化领域，具体涉及一种利用绿色荧光蛋白的大豆遗传转化方法。
背景技术：
：：大豆富含丰富的油脂、蛋白质及对人体有益的异黄酮等营养成分，是重要的经济作物之一。近年来我国对大豆的需求日益增加，进口大豆剧增，严重威胁大豆产业安全。因此，发展我国的大豆育种至关重要，而优化大豆转基因体系对发掘、研究大豆优异基因的功能和转基因育种都有重要的意义。大豆转基因方法包括农杆菌介导法、基因枪法、电激法、peg法、超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道法等，目前国内外最常使用的大豆转化方法是农杆菌介导法(tao2009)。该方法用含有植物表达载体的农杆菌侵染大豆外植体，使目的基因整合到部分宿主细胞中，再通过组织培养技术诱导细胞分裂和分化，进而得到完整的转基因植株。常用的植物表达载体除了含有目标基因外，还带有一个筛选基因(selectablegene)和一个报告基因(reportergene)。筛选基因的作用是在组织培养阶段，在含有选择剂的培养基上帮助选择转化体，如大豆中常用的抗除草剂基因(bar，pat)。而报告基因能够检验重组dna转化成功与否，及区分转化和未转化的植株，因此报告基因是鉴定转基因植株的一个关键指标。传统大豆转化方法中，阳性转基因事件的筛选分为两个阶段：第一个阶段是在组织培养阶段，由于所转入的基因带有筛选基因,所以转化成功的受体能够在选择压力下存活,而没有转化成功的受体会逐渐死亡。因此通过在培养基中添加筛选剂，如草丁膦，即可对外植体诱导的丛生芽进行筛选；第二个阶段是对组织培养后，已经分化且经过筛选剂筛选，被移栽至土中的完整大豆植株，检测方法常用的有基因组水平检测，抗性鉴定和蛋白水平检测。基因组水平检测指用pcr方法扩增特异的外源基因片段；抗性鉴定指通过对转基因植株喷施或涂抹筛选剂如除草剂，鉴定该植株是否具有抗性；蛋白水平检测指鉴定植株是否含有筛选基因或者报告基因编码的蛋白，如转基因试纸条检测，gus染色等。此外还有southern分子杂交，northern杂交,免疫技术等等检测方法。第一株转基因大豆的出现距今已有30年(hinchee,etal.1988)。相较其他物种，大豆依然是公认的难转化作物之一，广泛使用的农杆菌介导法仍存在许多问题：(1)转化效率低，其主要原因是大豆组织培养再生困难、重复性差、基因型依赖性强、培养条件复杂，易受多种因素影响。(2)假阳性检测，在组织培养阶段，为保证外植体的正常分化，培养基中添加的筛选剂浓度不能过高，这就导致组织培养阶段筛选存活的植株，依然存在部分非转基因植株的‘逃逸’现象，因此需要对移栽至土中的转基因苗进行进一步的检测确认；pcr检测法由于成本低,耗时少，是目前大部分实验室首选的转基因检测方法。但pcr扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增，而且大豆长时间的组织培养是处在一个密封的环境，植物表面易被农杆菌污染，也会造成假阳性结果，因此该检测只能作为初步判定；不同品种对筛选剂的抗性不同，植物转化过程中易产生嵌合体，也会造成筛选剂涂抹或喷洒鉴定转基因植株的结果不准确。(3)转基因鉴定步骤繁琐且成本高。即便是通用的pcr方法，需要对每一检测植株进行dna提取，设计特异的引物扩增。同时由于缺点(2)的假阳性检测的普遍现象，需要多重检测水平的结果才能确定最终的转基因植株；而相对准确的试纸条法或gus染色法试剂耗材价格昂贵；在生物学试验中一般都需要纯合的转基因株系进行后续的试验，因此对大豆来说，这意味至少需要对三代的转基因植株都进行多水平的检测，造成转基因鉴定成本高的缺点。(4)大豆转化周期长及转基因检测的滞后性，大豆组织培养包括共培养，丛生芽诱导，丛生芽伸长，生根四个阶段，该阶段需要至少三个月的时间。组织培养结束后并不能确定得到的是否为真正的转基因植株，所得到的苗被移栽到土里继续培养4-6周后才能对其进行进一步的分子蛋白水平鉴定。由于缺乏可视化的标记，研究人员只能在外植体被侵染的四个月后确定转化结果，使转基因的检测带有滞后性。(5)空间和材料的浪费，由于目前大豆的转化效率不到10％，平均转化效率更低，这就意味着90％以上的组织培养是无法获得转基因植株的，转化鉴定的滞后性又使阳性转基因事件无法被即时的确认，造成实验材料、空间和人力的浪费；获得纯系的转基因植株需要至少播种到t2代，由于整合的基因会产生分离，因此每个株系需要播种多粒种子观察其分离情况才能确定最终的纯合株系，这一过程同样需要大量的人力和物力。以往关于大豆转基因体系的优化主要集中于提高大豆转化效率，而鲜有报道针对其它问题进行优化。hinchee,m.a.w.,etal.1988productionoftransgenicsoybeanplantsusingagrobacterium-mediateddnatransfer.bio-technology6(8):915-921.osamushimomura,frankh.johnson,andyosaiga1962extraction,purificationandpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,aequorea.journalofcelluarphysiology.ow,d.w.,etal.1986transientandstableexpressionofthefireflyluciferasegeneinplant-cellsandtransgenicplants.science234(4778):856-859.tao,l.i.2009researchprogressontransgenictechnologyofsoybean.journalofanhuiagriculturalsciences.xiong,a.s.,etal.2011athermostablebeta-glucuronidaseobtainedbydirectedevolutionasareportergeneintransgenicplants.plosone6(11).技术实现要素：针对上述大豆转化过程中需解决的问题，本发明提供一种利用绿色荧光蛋白的大豆遗传转化方法，提高转基因鉴定效率和准确性，减少实验成本和不必要的消耗，缩短获得转基因大豆纯合株系的时间。本发明采取的技术方案为：一种利用绿色荧光蛋白的大豆遗传转化方法，选用绿色荧光蛋白基因(gfp)作为筛选标记和报告基因，进行阳性组培苗和转基因后代的可视化、即时、快速筛选与鉴定，缩短实验时间并提高鉴定转基因植株的可靠性。进一步的，本发明所述的利用绿色荧光蛋白的大豆遗传转化方法，转基因所用的植物表达载体带有35s启动子基因和35s启动子启动的绿色荧光蛋白基因，不含抗除草剂基因。本发明还提供一种具体的利用绿色荧光蛋白的大豆遗传转化方法，包括如下步骤：1)构建植物表达载体：将35s启动子基因、35s启动子启动的绿色荧光蛋白基因连接至质粒载体，在绿色荧光蛋白基因的上游或下游构建的克隆位点，插入目的基因；2)将步骤1)构建的植物表达载体转入农杆菌，选择成功转入的农杆菌培养后侵染外植体；3)步骤2)侵染后的外植体在23-26℃，15-17h光/7-9h暗条件下共培养4-6天后，荧光显微镜下观察外植体生长点处的荧光信号，选取绿色荧光集于在大豆子叶生长点区域的外植体或子叶上能够检测的绿色荧光信号但不集于子叶生长点区域，且在生长点区域有≥10个荧光信号的外植体清洗晾20-30min后进行丛生芽诱导培养12-16天；4)丛生芽诱导培养后，切掉外植体上生出的大芽，然后再次进行荧光信号检测，观察丛生芽的荧光信号，选择丛生芽中能检测到荧光信号的外植体并切除部分可辨别的非转基因即无荧光信号的丛生芽和下胚轴老化组织，进行芽伸长培养4-6周，每两周更换一次芽伸长培养基；5)对茎伸长≥3cm的丛生芽再次进行荧光信号检测，若伸长的丛生芽有荧光信号，就将该伸长的丛生芽从基部切下插到生根培养基中培养2-3周诱导生根；若没有荧光信号，将其切掉，放于新的芽伸长培养基中继续培养，直至能够检测到丛生芽的荧光信号；6)将诱导产生3-4条根的转基因苗移栽与驯化，完成大豆的遗传转化。本发明步骤1)所述的植物表达载体可用现有技术常用的构建方法进行构建，将35s启动子基因、35s启动子启动的绿色荧光蛋白基因连接至植物遗传转化常用的质粒载体上形成植物表达载体，在绿色荧光蛋白基因上游或下游构建多克隆位点用于目的基因的插入，本发明所述的35s启动子基因优选camv35s组成性启动子。本发明中所用植物表达载体具有一般性，植物表达载体本身具有或通过后期载体构建，在lb和rb之间包含由35s启动子启动的gfp报告基因均可实现本方法。本发明步骤2)农杆菌培养可以为转基因中常用的农杆菌培养方法，本发明提供一种具体的培养方法：在含有抗生素的lb液体培养基中，26-30℃，180-220rpm摇床上培养15-17小时。本发明所述的lb液体培养基配比可以为：胰蛋白胨10克/l，酵母粉5克/l，氯化钠10克/l。本发明步骤2)的外植体在侵染之前进行消毒和浸泡，消毒和浸泡可以为本领域常用的方法，本专利提供了一种具体的消毒和浸泡方法：用75％的酒精擦拭大豆种皮表面，再将其平铺于培养皿上置于干燥灭菌器中，密封条件下用氯气(100ml次氯酸钠和3.5ml浓盐酸反应)灭菌12-16小时。本发明步骤2)中农杆菌在侵染之前进行重悬，重悬方法可用本领域常用的重悬方法，本发明提供一种具体的侵染菌液重悬方法：将摇床上培养后的农杆菌21-23℃，4800-5200rpm离心收集，再用ccm液体培养基进行重悬，重悬的菌液保证其od650值在0.6-0.7之间，再将重悬好的菌液放于21-23℃，68-72rpm摇床中培养25-35分钟备用。本发明中ccm液体培养基可以选用市面上购买的ccm液体培养基，本发明提供一种配比：b5大量5mg/l、b5微量0.5mg/l、fe盐0.5mg/l、b5有机1mg/l、蔗糖30g/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物(mes)3.9g/l、细胞分裂素(6-ba)1.67mg/l、赤霉素(ga3)0.25mg/l、乙酰丁香酮(as)40mg/l；其中，b5大量的配比为：kno350g/l，mgso4·7h2o5g/l，nah2po4·2h2o3g/l，(nh4)2so42.68g/l，cacl2·2h2o3g/l；b5微量的配比为：h3bo30.6g/l，mnso4·h2o2g/l，znso4·7h2o0.4g/l，na2moo4·2h2o0.05g/l，cuso4·5h2o0.05g/l，cocl2·6h2o0.05g/l，ki0.15g/l；fe盐的配比为：feso4·7h2o5.56g/l，na2edta·2h2o7.46g/l；b5有机的配比为：烟酸0.1g/l，肌醇10g/l，维生素b11g/l，维生素b60.1g/l。本发明步骤2)中侵染外植体的所有侵染操作均在无菌操作台中进行，实验中用到的耗材均要保证无菌。本发明提供一种具体的侵染外植体的方法：用无菌水在黑暗条件下浸泡大豆15-17小时后，沿浸泡过的大豆种子下胚轴的方向平行切开并去掉种皮，切去部分下胚轴，后立即放入农杆菌的重悬菌液中，侵染25-35分钟。本发明步骤3)观察荧光信号可以将外植体按荧光信号强弱分为四个等级：强荧光信号外植体：绿色荧光集于在大豆子叶生长点区域被定义为有强荧光信号的外植体；中荧光信号外植体：在子叶上能够检测的绿色荧光信号不集于子叶生长点区域，且在生长点区域有≥10个荧光信号，被定义为中等信号；弱荧光信号外植体：在子叶生长点区域有≤10个荧光信号的外植体；无荧光信号外植体：没有荧光的信号的外植体被定义为无荧光信号外植体。本发明大豆子叶生长点为：大豆生长激活点，位于大豆子叶节上分生组织区域。本发明步骤3)共培养可以选用本领域常用的共培养培养基和共培养方法，本发明提供一种具体的共培养方法：侵染后的外植体晾15-25min后，将其近轴面朝下摆放在铺有无菌滤纸的ccm固体培养基中，封口，在24-26℃，15-17h光/7-9h暗条件下培养4-6天。本发明中ccm固体培养基可以选用市面上购买的ccm固体培养基，本发明提供一种配比：b5大量5mg/l、b5微量0.5mg/l、fe盐0.5mg/l、b5有机1mg/l、蔗糖30g/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物(mes)3.9g/l、琼脂糖5g/l、细胞分裂素(6-ba)1.67mg/l、赤霉素(ga3)0.25mg/l、乙酰丁香酮(as)40mg/l、二硫苏糖醇154.2mg/l、半胱氨酸400mg/l、硫代硫酸钠158mg/l；其中：b5大量的配比为：kno350g/l，mgso4·7h2o5g/l，nah2po4·2h2o3g/l，(nh4)2so42.68g/l，cacl2·2h2o3g/l；b5微量的配比为：h3bo30.6g/l，mnso4·h2o2g/l，znso4·7h2o0.4g/l，na2moo4·2h2o0.05g/l，cuso4·5h2o0.05g/l，cocl2·6h2o0.05g/l，ki0.15g/l；fe盐的配比为：feso4·7h2o5.56g/l，na2edta·2h2o7.46g/l；b5有机的配比为：烟酸0.1g/l，肌醇10g/l，维生素b11g/l，维生素b60.1g/l。本发明步骤3)中外植体清洗可以选用本领域常用的清洗方法，本发明提供一种具体的清洗方法：用无菌的wash清洗液浸泡保留的外植体10-20min,更换wash清洗液再浸泡20-40min以洗掉外植体表面附着的农杆菌。本发明中wash清洗液的配比为：无菌的纯水中加入头孢霉素(cef)50mg/l和羧苄青霉素(carb)500mg/l。本发明步骤3)丛生芽诱导培养的具体方法优选为：将外植体近轴面朝上，下胚轴倾斜45度插入芽诱导培养基(sim)中，在25℃，16h光/8h暗条件下培养两周。本发明所述的芽诱导培养基(sim)可以选用市面上购买的sim固体培养基，本发明提供一种的配比：b5大量50ml/l、b5微量5ml/l、fe盐5ml/l、b5有机10ml/l、蔗糖30g/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物(mes)0.58g/l、凝胶3.5g/l、细胞分裂素(6-ba)1.67mg/l、头孢霉素(cef)50mg/l、羧苄青霉素(carb)500mg/l。其中：b5大量的配比为：kno350g/l，mgso4·7h2o5g/l，nah2po4·2h2o3g/l，(nh4)2so42.68g/l，cacl2·2h2o3g/l；b5微量的配比为：h3bo30.6g/l，mnso4·h2o2g/l，znso4·7h2o0.4g/l，na2moo4·2h2o0.05g/l，cuso4·5h2o0.05g/l，cocl2·6h2o0.05g/l，ki0.15g/l；fe盐的配比为：feso4·7h2o5.56g/l，na2edta·2h2o7.46g/l；b5有机的配比为：烟酸0.1g/l，肌醇10g/l，维生素b11g/l，维生素b60.1g/l。本发明步骤4)中其他未检测测到荧光信号的外植体同样可以切掉大芽，继续进行丛生芽诱导培养12-16天后，再次进行荧光信号检测，观察丛生芽的荧光信号，选择丛生芽中能检测到荧光信号的外植体并切除部分可辨别的非转基因即无荧光信号的丛生芽和下胚轴老化组织，进行芽伸长培养。本发明步骤4)所述的芽伸长培养选用的芽伸长培养基(sem)可以选用市面上购买的sem固体培养基，本发明提供一种配比为:ms大量50ml/l、ms微量5ml/l、fe盐5ml/l、b5有机10ml/l、蔗糖30g/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物(mes)0.58g/l、凝胶3.5g/l、赤霉素(ga3)0.5mg/l、生长素(iaa)0.1mg/l、玉米素(zr)1mg/l、l-天冬酰胺酶(asp)50mg/l、l-焦谷氨酰胺(l-pyro)100mg/l、头孢霉素(cef)75mg/l、羧苄青霉素(carb)500mg/l。其中：ms大量的配比为：kno338g/l，mgso4·7h2o7.4g/l，nh4no333g/l，kh2po43.4g/l，cacl2·2h2o8.8g/l；ms微量的配比为：h3bo31.24g/l，mnso4·h2o3.38g/l，znso4·7h2o1.72g/l，na2moo4·2h2o0.05g/l，cuso4·5h2o0.05g/l，cocl2·6h2o0.05g/l，ki0.0166g/l；fe盐的配比为：feso4·7h2o5.56g/l，na2edta·2h2o7.46g/l；b5有机的配比为：烟酸0.1g/l，肌醇10g/l，维生素b11g/l，维生素b60.1g/l。本发明步骤5)所述的生根培养基可以选用市面上购买的生根培养基，本发明提供一种配比为：b5大量25ml/l、b5微量2.5ml/l、fe盐2.5ml/l、b5有机2.5ml/l、蔗糖15g/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物(mes)0.59g/l、琼脂粉8g/l、吲哚丁酸(iba)1mg/l。本发明步骤6)转基因苗移栽与驯化可以为本领域常用方法，本发明提供一种具体的转基因苗移栽与驯化方法：将诱导产生3-4条根的转基因苗和根部粘连的培养基一同从培养罐中取出，用水冲净培养基，移栽到装有灭菌的蛭石的花盆中，并用有透气孔的透明罩罩住幼苗，在25℃，16h光/8h暗条件培养箱中培养1-2周，待其展开新的复叶，可将幼苗转至装有1：1蛭石：营养土的花盆中，培养条件设为16h光/8h暗，28℃白天/24℃夜间。本方法中所用的芽诱导培养基，芽伸长培养基,生根培养基中均不需添加抗除草剂或类似的筛选剂。本发明还提供所述利用绿色荧光蛋白的大豆遗传转化方法在大豆育种中的应用。本发明建立一种利用绿色荧光蛋白报告基因代替传统除草剂筛选基因，鉴定大豆转化过程中阳性转化事件的新体系。本发明旨在建立一种更准确、简便、高效、无损、低成本且快速的转基因大豆稳定转化鉴定体系。本发明相对于现有技术的优势：(1)阐述了利用荧光蛋白作为报告基因兼做筛选基因，筛选并获得稳定转基因大豆方法的可行性，鉴定方法简单、准确率更高且成本低：构建包含由组成型启动子启动gfp基因，且不包含筛选基因的载体转化大豆，绿色荧光蛋白在荧光显微镜或其它荧光检测装置激发下会产生绿光，无需任何外源底物或化学处理，也无需在培养基中添加抗生素，即可在转化成功的大豆组织或植株中检测到，用于区分转基因和非转基因样本。(2)开发一种更为方便、准确、无损、快速、低成本的转基因鉴定方法，简化大豆转基因鉴定步骤：绿色荧光蛋白的检测无需反应底物及样本处理，只需一台荧光显微镜即可完成，并即时反馈成像。与传统转基因大豆检测方法相比，该方法检测结果可靠，检测时间短，检测成本大幅度降低，适用于大批量的转基因株系的快速检测；同时，由于绿色荧光蛋白是是一种可视化基因，且荧光信号强，鉴定过程中极少存在假阳性鉴定，提高转基因事件鉴定的准确性。(3)实现转基因大豆的阳性转化事件的无损检测：gfp检测不具有组织破坏性，可对活体组织检测且不破坏样本，检测后的样品可继续进行培养。(4)实现早期、及时的选择：在组织培养阶段即可对外植体，丛生芽及伸长芽根据荧光信号筛选，仅保留有荧光信号的外植体或分化出的幼苗，与传统利用除草剂筛选外植体方法相比，培养基中无需添加除草剂；利用荧光信号在各个组织培养阶段均可筛选出阳性转化事件，而非转基因外植体丢掉无须再进行组织培养；带有荧光的转基因植株仅需对目的基因进行相关研究的检测和试验，省去标记基因的pcr，抗除草剂，试纸条等检测步骤，减少不必要的人力物力及试验时间，既节省了人力、时间，也避免实验耗材和空间的浪费。(5)缩短获得大豆纯合转基因株系周期：t2代转基因种子会后代分离，带有gfp的大豆籽粒比非转基因大豆籽粒的荧光信号强，而不带gfp基因的大豆籽粒与对照检测结果一致。通过一次性观察所有来自转基因植株成熟种子的荧光情况来鉴定，所有种子均一致强于对照的荧光信号，该株系为纯合株系；若种子彼此之间荧光信号不同则为杂合株系。附图说明图1在共培养5天后，在大豆外植体生长点附近可检测到绿色荧光。图2不同荧光信号强度的外植体，在芽诱导阶段出现有荧光丛生芽的阳性转化事件数目占总外植体数目的百分比。图3不同组织培养阶段外植体荧光信号检测。图4比较在组织培养阶段用除草剂和用荧光蛋白筛选转基因大豆的区别。图5比较利用除草剂和荧光蛋白筛选转基因大豆纯合株系的区别。图6在荧光显微镜下比较t2代转基因植株大豆种子(t)与非转基因植株大豆种子(c)。gfp拍摄时所用的曝光时分别为85ms和55ms。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的，实施例所用荧光显微镜为evosflautoimagingsystem(thermofisher公司)。实施例11)农杆菌活化：本发明所用的植物表达载体带有由35s启动子启动的绿色荧光蛋白基因，不含抗除草剂基因。实验操作第一天，取含有该表达载体的农杆菌甘油保菌菌液100ul，在含有抗生素的lb固体培养基上划线，置于28℃培养箱中培养两天。2)大豆种子消毒：实验操作第二天，用75％的酒精擦拭大豆种皮表面，再将其平铺于培养皿上置于干燥灭菌器中，密封条件下用氯气(100ml次氯酸钠和3.5ml浓盐酸反应)灭菌12-16小时。3)农杆菌培养及种子浸泡：实验操作第三天，挑取活化的农杆菌单菌落于含有抗生素的lb液体培养基中，28℃，200rpm摇床上培养16小时。同时将灭菌的大豆种子用无菌水，在黑暗条件下浸泡约16小时。4)菌液的重悬及侵染：实验操作第四天，①侵染菌液重悬：用离心机将摇好的农杆菌22℃，5000rpm离心收集，再用ccm液体培养基进行重悬，重悬的菌液保证其od650值在0.6-0.7之间，再将重悬好的菌液放于22℃，70rpm摇床中培养0.5小时备用。②外植体侵染：本实验所有侵染操作均在无菌操作台中进行，实验中用到的耗材均要保证无菌。用手术刀沿浸泡过的种子下胚轴的方向平行切开并去掉种皮，切去部分下胚轴，将每个制备好的子叶立即放入①中的重悬菌液中，侵染30分钟。5)共培养:侵染后的外植体放于无菌滤纸上在超净台中晾20min,再将其近轴面朝下摆放在铺有无菌滤纸的ccm固体培养基中，封口。在25℃，16h光/8h暗条件下培养5天。6)外植体荧光信号检测：共培养5天后，将外植体放进无菌培养皿中密封，在荧光显微镜下，观察外植体生长点附近的荧光信号，将外植体按荧光信号强弱分为：强荧光信号，中等荧光信号，弱荧光信号及无荧光信号四个等级：强荧光信号外植体：绿色荧光集于在大豆子叶生长点区域被定义为有强荧光信号的外植体(图1，a)；中荧光信号外植体：在子叶上能够检测的绿色荧光信号不集于子叶生长点区域，且在生长点区域有≥10个荧光信号，被定义为中等信号(图1，b)；弱荧光信号外植体：在子叶生长点区域有≤10个荧光信号的外植体(图1，c)；无荧光信号外植体：没有荧光的信号的外植体被定义为无荧光信号外植体(图1，d)。丢掉带有弱荧光信号和无荧光信号的外植体，仅保留带有强荧光信号，中等荧光信号的外植体。其中大豆子叶生长点为：大豆生长激活点，位于大豆子叶节上分生组织区域。7)外植体清洗：用无菌的wash溶液浸泡保留的外植体15min,更换wash清洗液再浸泡30min以洗掉外植体表面附着的农杆菌。清洗后将外植体平铺于无菌滤纸上，在超净台晾20-30min。8)丛生芽诱导培养：将保留的外植体近轴面朝上，下胚轴倾斜45度插入芽诱导培养基(sim)中，在25℃，16h光/8h暗条件下培养两周。两周后，切掉外植体上生出的大芽，并再转移到新的sim之前对外植体进行荧光信号检测。将外植体放置于密封的无菌培养皿中，在荧光显微镜下，观察丛生芽的荧光信号，对丛生芽中能检测到荧光信号的外植体，切掉部分可辨别的非转基因的丛生芽，并将其置于新的芽诱导培养基中继续培养两周，该外植体被标记为一个成功的转基因事件。其它未检测到荧光信号的外植体同样切掉大芽，置于新的芽诱导培养基中继续培养两周。经过四周芽诱导培养后，所有外植体除已确定的成功转化事件的外植体，对它们进行第三次的荧光信号检测。将丛生芽中未检测到任何荧光信号的外植体丢掉，将所有已确认是成功转基因事件的外植体保留，并切掉部分可辨别的非转基因丛生芽，用于下一阶段的芽伸长诱导。9)芽伸长培养：切掉步骤8)中保留的外植体的下胚轴老化组织，移至芽伸长培养基(sem)中培养4-6周，每两周更换一次芽伸长培养基。10)芽伸长阶段荧光信号检测及诱导生根：对茎伸长≥3cm的丛生芽进行荧光信号检测，如果伸长的丛生芽没有荧光信号，将其切掉，放于新的sem中继续培养；如果伸长的丛生芽有荧光信号，就将该伸长的丛生芽从基部切下插到生根培养基(rm)中诱导生根；11)转基因苗的移栽与驯化：在生根培养基中培养2-3周后，转基因苗会被诱导产生3-4条粗壮的根，将该转基因苗和根部粘连的培养基一同从培养罐中取出，用水冲净培养基，移栽到装有灭菌的蛭石的花盆中，并用有透气孔的透明罩罩住幼苗，在25℃，16h光/8h暗条件培养箱中培养1-2周，待其展开新的复叶，可将幼苗转至装有1：1蛭石：营养土的花盆中，培养条件设为16h光/8h暗，28℃白天/24℃夜间。12)转基因苗检测：本实验中gfp报告基因由camv35s启动子启动，在叶片，花等组织均可检测到绿色荧光。本方法得到的转基因苗无需对报告基因进行pcr检测，或蛋白水平检测。通过荧光信号检测即可判断该植株是否为转基因或嵌合体。13)转基因种子荧光信号检测：将成熟的转基因植株与非转基因植株的大豆籽粒一起放在荧光显微镜下观察，设置不同的曝光时间观察大豆籽粒荧光信号，由于杂合转基因植株后代会分离，带有gfp的大豆籽粒比非转基因大豆籽粒的荧光信号强，而不带gfp基因的大豆籽粒与对照检测结果一致。转基因后代株系的种子若全部带有强于对照的荧光则为纯合株系，若种子的荧光有强弱之分则是杂合株系。实验结果：在我们的研究中发现(1)被农杆菌侵染过后的外植体经过五天的共培养，通过荧光显微镜观察可在外植体生长点附近检测到绿色荧光信号，我们根据荧光信号强弱将外植体分为四个荧光等级：强荧光信号，中等荧光信号，弱荧光信号及无荧光信号(图1)。研究结果得出有强荧光信号和中等荧光信号的外植体，在后续的芽诱导阶段可分化出带有绿色荧光的转基因丛生芽，而来自弱荧光信号和无荧光信号的外植体在后续的培养阶段未出现转基因丛生芽(图2)。该结果说明具有强荧光信号和中等荧光信号是侵染效果好的外植体，而中等荧光信号和弱荧光信号的外植体由于侵染程度很低或没有被侵染成功，在后续的芽诱导阶段不会有阳性丛生芽产生。因此在大豆转化后的第五天，可根据大豆外植体生长点附近的荧光信号判断外植体侵染程度，只须保留带有强荧光信号和中等荧光信号的外植体进行下一步的芽诱导培养，即实现对转化外植体早期筛选；(2)以往的大豆转化试验，需要保留所有丛生芽和芽伸长的外植体。本研究在芽诱导阶段和芽伸长阶段对丛生芽进行荧光信号检测，阳性的丛生芽会有较强的绿色荧光信号而非转基因的丛生芽则没有(图3，c-i)。该结果说明实验结果(1)中保留的外植体中，部分生长点附近会分化出含有荧光信号的丛生芽，即为转化成功的丛生芽，可通过荧光显微镜将其与非转基因丛生芽区别开来。根据该结果，丛生芽诱导阶段结束后对所有外植体进行荧光检测，有荧光丛生芽的外植体保留并转移到芽伸长培养基，没有荧光信号的外植体则可以丢弃；芽伸长阶段作同样的处理，仅保留伸长的有荧光信号的幼苗，移栽到生根培养基。(3)在荧光显微镜下观察，来自转基因植株的大豆种子(t)若含有gfp报告基因，则会检测到明显区别于非转基因植株的大豆种子(c)的荧光信号。该结果说明通过荧光检测可以区分转基因大豆籽粒和非转基因籽粒。如果该株系的大豆种子荧光信号全部强于非转基因大豆种子，则其为纯合植株。如果种子荧光信号出现强弱分离，则表明则其对应的植株即为杂合植株(图6)。本实施例所述方法实现转基因大豆的阳性转化事件的无损、早期、即时选择。gfp可对活体组织检测且不破坏样本，在组织培养阶段即可对外植体，丛生芽及伸长芽根据荧光信号筛选，仅保留有荧光信号的外植体或分化出的幼苗，与传统利用除草剂筛选外植体方法相比，筛选并确定转化成功事件的时间大大提前，即时的鉴定真正转化成功的外植体，丢掉非转化的外植体，经过多轮的荧光筛选，外植体数目已经大大减少，既节省了人力、时间，也避免实验耗材和空间的浪费(图4，其中a列为利用除草剂筛选转基因大豆，b列为利用gfp筛选转基因大豆)。本实施例可缩短鉴定转基因大豆纯合体的时间。具体阐述为：在荧光显微镜下可区分带有gfp和不带gfp的成熟大豆籽粒，每一代杂合转基因植株后代都会存在gfp基因分离的现象，如果插入片段植株染色体有一个插入位点，那么t2后代转基因植株与非转基因植株的比例为3:1。通过对每一株系大豆种子进行荧光信号检测，即可提前分辨纯合株系和杂合株系(图5筛选大豆转基因纯合植株，其中a为传统方法，b为gfp方法)。本实施例所述方法为大豆基因功能的研究和大豆分子育种提供技术支持。当前第1页12当前第1页12