一种荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜及其制备方法与流程

本发明属于抗菌包装材料制备技术领域，具体涉及一种荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜及其制备方法。

背景技术：

在社会经济日益进步和人们生活水平不断提高的现代社会，人们最关注的话题之一仍然是食品质量安全问题，但是随处可见的人体致病菌的传播和蔓延严重威胁着食品的质量安全，进而影响人体健康。所以，抑制致病菌的生长与增殖，减轻或消除致病菌酿成的危害，研制抗菌包装材料已作为科学研究和生产领域的焦点。

食品运输贮藏过程中将成膜材料与抗菌剂结合，能达到了延长食品保质期，防止食品腐败等的目的。壳聚糖是可生物降解和可生物相容的聚合物，且具有优异的抗微生物活性，是常用的食品包装材料之一。壳聚糖分子中含有丰富的-nh2和-oh，可以形成类似网络结构的笼形分子，可通过氢键或离子键与小麦醇溶蛋白螯合，从而将纳米银复合颗粒均匀分散于壳聚糖基体中，形成纳米银/壳聚糖复合膜，使纳米银复合颗粒和壳聚糖协同作用，进而提高了其抗菌性能。国内外大量报道的纳米银/壳聚糖膜大多是单纯的纳米银颗粒。先形成稳定的纳米银符合颗粒，再将复合颗粒均匀分散到基质得到成膜液，再形成膜的制备方法，目前鲜有报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜及其制备方法。

本发明提供的一种荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜及其制备方法，能够解决现方法生产纳米银颗粒在壳聚糖复合抗菌膜分布不均匀，易团聚的缺点。利用本发明提供的方法制得的壳聚糖复合抗菌膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很好的杀菌作用。

本发明提供的制备方法，以壳聚糖为基质，添加gliadin/agnps复合颗粒为抗菌剂，达到抑制微生物生长的目的，为构建抑菌膜提供了新了思路。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的一种荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：

（1）将小麦醇溶蛋白加入乙醇溶液中，混合均匀得到小麦醇溶蛋白溶液；将硝酸银加入水中，混合均匀，得到硝酸银溶液；

（2）将鼠尾草酸加入乙醇溶液中，混合均匀得到鼠尾草酸溶液；将步骤（1）所述硝酸银溶液加入所述小麦醇溶蛋白溶液中，搅拌均匀，得到硝酸银-小麦醇溶蛋白溶液；然后将鼠尾草酸溶液加入硝酸银-小麦醇溶蛋白溶液中，搅拌均匀，得到混合液；在搅拌状态下，将混合液进行水浴加热处理，冷却至室温，纯化，透析处理，得到小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液（gliadin/agnps胶体颗粒）；

（3）将壳聚糖加入冰乙酸的水溶液中，搅拌均匀，离心处理，取上清液，得到壳聚糖溶液；

（4）将步骤（2）所述小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液加入步骤（3）所述壳聚糖溶液中，搅拌均匀，得到混合物；

（5）将甘油加入步骤（4）所述混合物中，搅拌均匀，得到成膜液，将成膜液浇铸成膜（可倒入聚苯乙烯板上浇铸），干燥处理（在恒温恒湿箱中进行），然后在干燥器中平衡处理（硝酸镁饱和溶液，58%rh），制得所述荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜。

进一步地，步骤（1）所述乙醇溶液的质量百分比浓度为70%，步骤（2）所述乙醇溶液的质量百分比浓度为95%。

进一步地，在步骤（1）所述小麦醇溶蛋白溶液中，小麦醇溶蛋白的质量百分比浓度为0.1wt%-1.5wt%，优选为0.5wt%；步骤（1）所述硝酸银溶液的浓度为0.005mol/l-0.5mol/l优选为0.05mol/l。

进一步地，在步骤（2）所述鼠尾草酸溶液中，所述鼠尾草酸的质量百分比浓度为0.05wt%-1.5wt%，优选为0.5wt%；所述硝酸银溶液与小麦醇溶蛋白溶液的体积比为1-9：1-9，优选为1:1；所述在搅拌状态下的搅拌速率为300-600r/min，优选为500r/min。

进一步地，步骤（2）所述硝酸银溶液与鼠尾草酸溶液的体积比为1:1；所述水浴加热处理的温度为37摄氏度，水浴加热处理的时间为120min；步骤（2）所述纯化的方式为反溶剂法及旋蒸法中的一种以上；所述透析处理为采用截留分子量为10da的透析袋进行的；透析处理的时间为24小时。

进一步地，步骤（3）所述冰乙酸的水溶液的体积百分比浓度为0.5%-2%；所述壳聚糖与冰乙酸的水溶液的质量体积比为1-5：100g/ml；所述离心处理的离心速率为8000-10000rpm，离心处理的时间为10-30min。

优选地，步骤（3）所述搅拌均匀的搅拌时间为12小时，搅拌的温度为室温。

进一步地，步骤（4）所述小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液与壳聚糖溶液的体积比为5-15:100。

优选地，所述小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液的体积为壳聚糖水溶液的体积的10%（v/v）。

优选地，步骤（4）所述搅拌的时间为30min，搅拌的温度为室温。

进一步地，步骤（5）所述甘油的质量为步骤（3）所述壳聚糖质量的15%-25%；所述干燥处理的温度为37-60摄氏度，干燥处理的时间为24h-48h。

进一步地，步骤（5）所述在干燥器中平衡处理的时间为两天以上，所述在干燥器中平衡处理的相对湿度为58%rh。

优选地，所述小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液（gliadin/agnps胶体颗粒）中，ag当量为32ug/ml（小麦醇溶蛋白/纳米银颗粒溶液中银的含量）。所述小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液可采用液相还原法制得。

优选地，制备所述小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮（gliadin/agnps胶体颗粒）包括如下步骤：将小麦醇溶蛋白加入到70%（w/v）的乙醇溶液中得到0.5%（w/v）的小麦醇溶蛋白醇溶液；将硝酸银溶解在水溶液中得到0.05mol/l的硝酸银溶液；将鼠尾草酸溶解在95%（w/v）乙醇水溶液中得到0.5%的鼠尾草酸溶液。将硝酸银溶液加入小麦醇溶蛋白溶液中搅拌10min。然后将鼠尾草酸溶液按照慢慢的倒入硝酸银-小麦醇溶蛋白溶液中，在倒入过程中用电子搅拌器不停的搅拌直至混合均匀，然后在37℃条件下，水浴搅拌反应一段时间，溶液的颜色由无色变为红棕色，直至溶液颜色无变化，自然冷却至室温，然后对小麦醇溶蛋白/纳米银溶胶进行反溶剂、旋蒸等一系列操作，最后装在10kd的透析袋中透析24h；从而制备出小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒。

本发明提供一种由上述的制备方法制得的荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜。

所述荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜在干燥器（硝酸镁饱和溶液，58%rh）平衡两天以上再使用，效果更佳。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

（1）本发明提供的制备方法，操作简单，条件温和，不会对环境和人体产生危害；

（2）本发明提供的制备方法，具有生产效率高、产品质量高等优点，小麦醇溶蛋白/纳米银复合颗粒在壳聚糖复合膜中具有良好的分散性和稳定性，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很好的杀菌作用，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1，2，3提供的荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜和对比例1，2，3提供的壳聚糖复合膜的clsm图。

图2为实施例1，2，3提供的荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜和对比例1，2，3提供的壳聚糖复合膜的sem图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1

一种荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：

（1）将1g小麦醇溶蛋白加入10ml质量百分比浓度为70%的乙醇溶液中，混合均匀得到小麦醇溶蛋白溶液（小麦醇溶蛋白质量百分比浓度为0.5%）；将1g硝酸银加入水中，混合均匀，得到硝酸银溶液（浓度为0.05mol/l）；

（2）将鼠尾草酸加入质量百分比浓度为95%的乙醇溶液，混合均匀得到鼠尾草酸溶液（鼠尾草酸的质量百分比浓度为0.5%）；将步骤（1）所述硝酸银溶液加入4ml的小麦醇溶蛋白溶液中，搅拌均匀，得到硝酸银-小麦醇溶蛋白溶液；然后将鼠尾草酸溶液加入硝酸银-小麦醇溶蛋白溶液，硝酸银溶液与鼠尾草酸溶液的体积比为1：1，搅拌均匀，得到混合液；在速率为500r/min的搅拌状态下，将混合液进行水浴加热处理，水浴加热处理的温度为37℃，水浴加热处理的时间为120min，冷却至室温，纯化，透析处理，透析处理采用了截留分子量为10da的透析袋进行，透析处理的时间为24小时，得到小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液；

（3）将1g壳聚糖加入70ml体积百分比浓度为1%的冰乙酸的水溶液中，搅拌均匀，离心处理，离心处理的速率为10000rpm，离心处理的时间为20min，取上清液，得到壳聚糖溶液；

（4）将步骤（2）所述小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液加入步骤（3）所述壳聚糖溶液中，小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液与壳聚糖溶液的体积比为1:10，搅拌均匀，得到混合物；

（5）将0.2g甘油加入步骤（4）所述混合物中，室温下搅拌均匀，搅拌的时间为30min，得到成膜液，将成膜液倒入18×21cm的聚苯乙烯板上浇铸成膜，在恒温恒湿箱（50％rh）中干燥处理，干燥的温度为37摄氏度，干燥的时间为48h，然后在干燥器（硝酸镁饱和溶液，58%rh）中平衡两天，制得所述荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜。

实施例2

一种荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：

（1）将1g小麦醇溶蛋白加入10ml质量百分比浓度为70%的乙醇溶液中，混合均匀得到小麦醇溶蛋白溶液（小麦醇溶蛋白质量百分比浓度为0.5%）；将1g硝酸银加入水中，混合均匀，得到硝酸银溶液（硝酸银溶液浓度0.05mol/l）；

（2）将鼠尾草酸加入质量百分比浓度为95%的乙醇溶液中，混合均匀得到鼠尾草酸溶液（鼠尾草酸的质量百分比浓度为0.5%）；将步骤（1）所述硝酸银溶液加入4ml小麦醇溶蛋白溶液中，搅拌均匀，得到硝酸银-小麦醇溶蛋白溶液；然后将鼠尾草酸溶液加入硝酸银-小麦醇溶蛋白溶液中，硝酸银溶液与鼠尾草酸溶液的体积比为1：1，搅拌均匀，得到混合液；在速率为500r/min的搅拌状态下，将混合液进行水浴加热处理，水浴加热处理的温度为37℃，水浴加热处理的时间为120min，冷却至室温，纯化，透析处理，透析处理采用了截留分子量为10da的透析袋进行，透析处理的时间为24小时，得到小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液；

（3）将1g壳聚糖加入70ml体积百分比浓度为1%的冰乙酸的水溶液中，搅拌均匀，离心处理，离心处理的速率为8000rpm，离心处理的时间为30min，取上清液，得到壳聚糖溶液；

（4）将步骤（2）所述小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液加入步骤（3）所述壳聚糖溶液中，小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液与壳聚糖溶液的体积比为1:20，搅拌均匀，得到混合物；

（5）将0.2g甘油加入步骤（4）所述混合物中，室温下搅拌均匀，搅拌的时间为30min，得到成膜液，将成膜液倒入18×21cm的聚苯乙烯板上浇铸成膜，在恒温恒湿箱（50％rh）中干燥处理，干燥的温度为37摄氏度，干燥的时间为48h，然后在干燥器（硝酸镁饱和溶液，58%rh）中平衡两天，制得所述荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜。

实施例3

一种荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：

（1）将1g小麦醇溶蛋白加入10ml质量百分比浓度为70%的乙醇溶液中，混合均匀得到小麦醇溶蛋白溶液（小麦醇溶蛋白质量百分比浓度为0.5%）；将1g硝酸银加入水中，混合均匀，得到硝酸银溶液（硝酸银溶液浓度为0.05mol/l）；

（2）将鼠尾草酸加入质量百分比浓度为95%的乙醇溶液中，混合均匀得到鼠尾草酸溶液（鼠尾草酸质量百分比浓度为0.5%）；将步骤（1）所述硝酸银溶液加入4ml小麦醇溶蛋白溶液中，搅拌均匀，得到硝酸银-小麦醇溶蛋白溶液；然后将鼠尾草酸溶液加入硝酸银-小麦醇溶蛋白溶液中，硝酸银溶液与鼠尾草酸溶液的体积比为1：1，搅拌均匀，得到混合液；在速率为500r/min的搅拌状态下，将混合液进行水浴加热处理，水浴加热处理的温度为37℃，水浴加热处理的时间为120min，冷却至室温，纯化，透析处理，透析处理采用了截留分子量为10da的透析袋进行，透析处理的时间为24小时，得到小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液；

（3）将1g壳聚糖加入70ml体积百分比浓度为1%的冰乙酸的水溶液中，搅拌均匀，离心处理，离心处理的速率为9000rpm，离心处理的时间为10min，取上清液，得到壳聚糖溶液；

（4）将步骤（2）所述小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液加入步骤（3）所述壳聚糖溶液中，小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液与壳聚糖溶液的体积比为3:20，搅拌均匀，得到混合物；

（5）将0.2g甘油加入步骤（4）所述混合物中，室温下搅拌均匀，搅拌的时间为30min，得到成膜液，将成膜液倒入18×21cm的聚苯乙烯板上浇铸成膜，在恒温恒湿箱（50％rh）中干燥处理，干燥的温度为37摄氏度，干燥的时间为48h，然后在干燥器（硝酸镁饱和溶液，58%rh）中平衡两天，制得所述荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜。

对比例1

一种荷载鼠尾草酸的壳聚糖复合抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：

（1）将1g壳聚糖加入70ml体积百分比浓度为1%的冰乙酸的水溶液中，室温下搅拌均匀，搅拌的时间为12小时，离心处理，离心处理的速率为10000rpm，离心处理的时间为20min，取上清液，得到壳聚糖溶液；

（2）将鼠尾草酸加入质量百分比浓度为95%的乙醇溶液中，混合均匀得到鼠尾草酸溶液（鼠尾草酸质量百分比浓度为0.05%）；将所述鼠尾草酸溶液加入步骤（1）所述壳聚糖溶液中，鼠尾草酸溶液与壳聚糖溶液的体积比为1:10，室温下搅拌均匀，搅拌时间为30min，得到混合液；

（3）将0.2g甘油（甘油添加量为步骤（1）所述壳聚糖质量的20%）加入步骤（2）所述混合液中，室温下搅拌均匀，搅拌的时间为30min，得到成膜液，将成膜液倒入18×21cm的聚苯乙烯板上浇铸成膜，在恒温恒湿箱（50％rh）中干燥制得所述鼠尾草酸-壳聚糖复合膜，干燥的温度为37摄氏度，干燥的时间为48h；

（4）将步骤（3）所述鼠尾草酸-壳聚糖复合膜在干燥器（硝酸镁饱和溶液，58%rh）平衡两天，得到所述荷载鼠尾草酸的壳聚糖复合抗菌膜。

对比例2

一种荷载硝酸银的壳聚糖复合抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：

（1）将1g壳聚糖加入70ml体积百分比浓度为1%的冰乙酸的水溶液中，室温下搅拌均匀，搅拌的时间为12小时，离心处理，离心处理的速率为10000rpm，离心处理的时间为20min，取上清液，得到壳聚糖溶液；

（2）将硝酸银溶液（浓度为0.05mol/ml）加入步骤（1）所述壳聚糖溶液中，硝酸银溶液与壳聚糖溶液的体积比为1:10，室温下搅拌均匀，搅拌时间为30min，得到混合液；

（3）将0.2g甘油（甘油质量为壳聚糖质量的20%）加入步骤（2）所述混合液中，室温下搅拌均匀，搅拌的时间为30min，得到成膜液，将成膜液倒入18×21cm的聚苯乙烯板上浇铸成膜，在恒温恒湿箱（50％rh）中干燥制得所述鼠尾草酸-壳聚糖复合膜，干燥的温度为37摄氏度，干燥的时间为48h；

（4）将步骤（3）所述硝酸银-壳聚糖复合膜在干燥器（硝酸镁饱和溶液，58%rh）平衡两天，得到所述荷载硝酸银的壳聚糖复合抗菌膜。

对比例3

一种壳聚糖膜的制备方法，包括如下步骤：

（1）将1g壳聚糖加入70ml体积百分比浓度为1%的冰乙酸的水溶液中，室温下搅拌均匀，搅拌的时间为12小时，离心处理，离心处理的速率为10000rpm，离心处理的时间为20min，取上清液，得到壳聚糖溶液；

（2）将0.2g甘油（甘油质量为壳聚糖质量的20%）加入步骤（1）所述混合液中，室温下搅拌均匀，搅拌的时间为30min，得到成膜液，将成膜液倒入18×21cm的聚苯乙烯板上浇铸成膜，在恒温恒湿箱（50％rh）中干燥制得所述鼠尾草酸-壳聚糖复合膜，干燥的温度为37摄氏度，干燥的时间为48h；

（3）将步骤（2）所述硝酸银-壳聚糖复合膜在干燥器（硝酸镁饱和溶液，58%rh）平衡两天，得到所述壳聚糖膜。

具体实施效果测试

利用激光共聚焦显微镜观察壳聚糖复合膜的抑菌性，结果如图1所示。荧光强度与细胞内ros生成量成正比，ros通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至死亡；而且细菌细胞死后会有一定程度的聚集。

该测试包括如下步骤：

取大肠杆菌atcc8739和金黄色葡萄球菌atcc6538的一个菌落分别分散并在营养肉汤中于37℃温育16小时，用无菌水稀释至10⁵-10⁶cfu/ml的细菌密度，得到菌悬液。用打孔器将复合膜（实施例与对比例提供的待测试的样品）裁剪成直径为6mm的膜片并将其放置在24孔板中。向24孔板中加入1ml菌悬液（od600=0.01），然后用恒温箱在37℃条件下培养细菌24h。24h后，取出24孔板，用1mlph=6.5浓度为0.9wt%的氯化钠溶液洗涤复合膜三次，再用10umdcfda（2，7-二氯荧光素）染色30min。将准备好的样品放在激光共聚焦显微镜下观测，样品的测定在室温下进行，激发光波长为488nm，发射光波长为550nm，狭缝4nm。采用40×和10×的目镜，1024×1024的分辨率进行图像采集。

图1为抑菌复合膜的光学显微镜图；其中a、b分别表示大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；a1、b1为使用实施例1提供的小麦醇溶蛋白/纳米银-壳聚糖复合膜进行抑菌实验的显微镜图(实施例1提供的小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒溶液与壳聚糖悬浮液的体积比为1:10)；a2、b2为使用实施例2提供的小麦醇溶蛋白/纳米银-壳聚糖复合膜进行抑菌实验的显微镜图(实施例2提供的小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒悬浮液与壳聚糖溶液的体积比为1:20)；a3、b3为仅使用实施例3提供的小麦醇溶蛋白/纳米银-壳聚糖复合膜进行抑菌实验的显微镜图(实施例3提供的小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒溶液与壳聚糖悬浮液的体积比为3:20)；a4、b4为使用对比例1提供的荷载鼠尾草酸的壳聚糖复合抗菌膜进行抑菌实验的显微镜图；a5、b5为使用对比例2提供的荷载硝酸银的壳聚糖复合抗菌膜进行抑菌实验的显微镜图；a6、b6为使用对比例3提供的壳聚糖膜进行抑菌实验的显微镜图；图1的标尺：10µm。

如图1所示，与对比例相比较，实施例提供的麦醇溶蛋白/纳米银-壳聚糖复合膜的抗菌效果更好，其中实施例1提供的荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜（小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒溶液与壳聚糖溶液的体积比为1:10）抗菌效果最好。

利用扫描电镜观察实施例1与对比例提供的膜中荷载物质的分散性，结果如图2所示。场发射扫描电子显微镜（te-sem）将样本通过双面胶固定在特制不锈钢样品台表面，用喷金仪在样品表面喷上厚度小于20nm的涂层，镀膜时间为150s。将样品取出，通过leo1530vp场发射扫描电镜观察膜表面形貌，在15kv加速电压下进行观察拍照。

图2为抑菌复合膜的扫描电镜图（a、b、c分别为实施例1、实施例2及实施例3提供的小麦醇溶蛋白/纳米银-壳聚糖复合膜的扫描电镜图，其中小麦醇溶蛋白/纳米银胶体颗粒溶液与壳聚糖溶液的体积比分别为1:10、1:20和3:20；d、e、f分别为对比例1提供的荷载鼠尾草酸的壳聚糖复合抗菌膜、对比例2提供的荷载硝酸银的壳聚糖复合抗菌膜和对比例3提供的壳聚糖膜的扫描电镜图；标尺：1µm。

如图2所示，d、e、f中的膜比较光滑，a、b、c膜中荷载有小麦醇溶蛋白/纳米银颗粒，相对而言不光滑，其中a膜中的胶体颗粒分布较均匀。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。