本发明涉及医药领域，具体而言，涉及一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法。
背景技术：
目前，对于植物药的开发利用首先是对其中的具有相关疗效的有效化学成分进行提取和分离，并纯化得到有一定治疗效果的单一成分。其中，生物碱是一类具有显著生理活性的含氮有机化合物，许多药用植物中均富含生物碱，是中药的重要组部分。生物碱有效成分的分离与纯化是中药开发的难点与关键。
多根乌头(aconitumkarakolicumrap.)为毛茛科乌头属(aconituml.)植物，分布于我国新疆伊犁地区海拔2000～3000m的山坡草地，分布集中，主要用于治疗神经痛、心绞痛、肾炎等疾病。其中，多根乌头中含有丰富的生物碱，且欧乌碱(napelline)和12-表-欧乌碱(12-epi-napelline)含量较高。
然而，欧乌碱和12-表-欧乌碱互为同分异构体，分子式均为c22h33no3，均属于c-20型二萜生物碱。两者的不同之处仅在于欧乌碱12位羟基的构型为α-型，而12-表-欧乌碱12位羟基的构型为β-型，两者的化学结构如下式所示。
由于欧乌碱和12-表-欧乌碱之间的结构差异非常小，使得这两者的化学性质极为相似，难以采用常规的柱分离和纯化方法将其二者分离。鉴于此，特提出本申请。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，该方法无需使用高精度的分离设备(例如hplc)，仅通过柱分离就能够实现欧乌碱与12-表-欧乌碱这两个性质极为相似的同分异构体的有效分离，方法简单有效，可重现性强。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，其包括：
将含有欧乌碱和12-表-欧乌碱的混合物c上样至氨基色谱柱，以正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂为洗脱剂，氨基色谱填料与混合物c的质量比为16-24：1，分离得到欧乌碱和12-表-欧乌碱。
进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述在采用氨基色谱柱分离混合物c的过程中，正己烷、二氯甲烷和甲醇三者的体积比依次为：90:5:5、80:10:10、70:15:15、60:25:15、50:25:25、40:30:30，每个体积比的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂分别洗脱1.5-2.5个柱体积。
进一步地，在本发明较佳的实施方式中，收集体积比为80:10:10的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗脱的组分，得到欧乌碱；收集体积比为50:25:25的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗脱的组分，得到12-表-欧乌碱。
进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述混合物c的分离方法包括：
采用酸提碱沉法提取乌头粉末，得到乌头总碱a；
将乌头总碱a溶于ph值为3-5的醇溶液中，将所得溶液通过阳离子交换树脂色谱柱，依次用水和氨水溶液进行洗脱后，将阳离子交换树脂色谱柱中的树脂取出，并采用加热回流提取法进行提取，得到乌头总生物碱b；
采用反相色谱c18柱分离乌头总生物碱b，得到混合物c。
进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述氨水溶液的浓度为5-20％。
进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述阳离子交换树脂为强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂。
进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述加热回流提取法的提取溶剂为70-90％的乙醇；提取温度为70-90℃；提取时间为2-4h。
进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述在采用反相色谱c18柱分离乌头总生物碱b的过程中，洗脱剂为甲醇－水混合溶剂，收集体积浓度为65-75％的甲醇洗脱部分，得到混合物c。
进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述洗脱剂甲醇－水混合溶剂的体积浓度依次为：5-15％、25-35％、45-55％、65-75％和85-95％。
进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述用酸提碱沉法提取乌头粉末包括：
将ph值为2-3的醇溶液与乌头粉末混合，加热回流提取，将所得提取物的ph值调节至9-10后，再用乙酸乙酯萃取，得到乌头总碱a。
与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：
本发明提供的这种分离方法，以氨基色谱柱分离含有欧乌碱和12-表-欧乌碱的混合物c，优化洗脱剂的溶剂组成，实现了欧乌碱与12-表-欧乌碱这两个性质极为相似的同分异构体的有效分离，得到欧乌碱与12-表-欧乌碱纯品。该方法无需使用高精度的分离设备(例如hplc)，方法简单有效，可重现性强。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
目前，在现有技术中，从多根乌头中分离得到化学成分主要有柱色谱分离和薄层色谱分离两种方法。对于欧乌碱的分离和纯化，绝大多数的文献均采用的是酸碱提取和反复使用硅胶柱和反相c18柱进行层析分离，最后分离得到12-表-欧乌碱。而有一些文献报道，利用薄层色谱，对多根乌头的化学成分进行了分析，但在薄层板上也没有检测到欧乌碱或12-表-欧乌碱的存在。
从已报道的文献看，从多根乌头中提取分离得到欧乌碱的方法，不具备针对性。事实上，在植物成分的分离纯化上，所有类别(黄酮、皂苷、萜、蒽醌、苯丙素、香豆素、生物碱等)都可以采用硅胶柱和反相c18柱进行分离纯化，不具备特异性。所以，如果仅仅采用硅胶柱和反相c18柱分离，往往得到多种类别的化学成分，这样在分离中就显得物质并不集中，产率较低，并且具有偶然性。
本实施方式提供一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，该方法旨在采用可靠有效的方法同时分离得到欧乌碱和12-表-欧乌碱。
该分离方法包括：
将含有欧乌碱和12-表-欧乌碱的混合物c上样至氨基色谱柱，以正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂为洗脱剂，氨基色谱填料与混合物c的质量比为16-24：1，分离得到欧乌碱和12-表-欧乌碱。
在该方法中，含有欧乌碱和12-表-欧乌碱的混合物c可通过柱色谱分离方法得到，可采用本实施方式中公开的后续方法得到，也可采用其它本领域技术人员常用的方法制备得到。
为了使氨基色谱柱对混合物c有较佳的分离效果，氨基色谱填料与混合物c的质量比为16-24：1，优选地为18-22：1，更为优选地为19-21：1。
其中，上述在采用氨基色谱柱分离混合物c的过程中，正己烷、二氯甲烷和甲醇三者的体积比依次为：90:5:5、80:10:10、70:15:15、60:25:15、50:25:25、40:30:30，每个体积比的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂分别洗脱1.5-2.5个柱体积。
即，在氨基色谱柱的洗脱过程中，先用体积比为90:5:5的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗脱1.5-2.5个柱体积后，再用体积比为80:10:10的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗脱1.5-2.5个柱体积，以此类推。
进一步地，收集体积比为80:10:10的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗脱的组分，得到欧乌碱；收集体积比为50:25:25的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗脱的组分，得到12-表-欧乌碱。
其中，上述混合物c的分离方法包括：
步骤s1:采用酸提碱沉法提取乌头粉末，得到乌头总碱a；
其中，乌头粉末为将乌头干燥根粉碎后过20-40目筛所得。
进一步地，上述用酸提碱沉法提取乌头粉末包括：将ph值为2-3的醇溶液与乌头粉末混合，加热回流提取，将所得提取物的ph值调节至9-10后，再用乙酸乙酯萃取，得到乌头总碱a。
优选地，乌头粉末与醇溶液混合时的料液比为4-7：1，或者为5-6：1。该醇溶液优选为70-95％的乙醇溶液，更为优选地为80-90％的乙醇溶液。
优选地，加热回流提取的温度为60-80℃，或者为65-75℃；时间为5-10h，或者为6-9h，或者为7-9h。在加热回流提取期间，每20-60min搅拌均匀一次。
优选地，将所得提取物用氨水调节ph值至9-10后，用0.7-1.3倍体积的乙酸乙酯萃取；进一步优选地，用乙酸乙酯萃取2-4次。
步骤s2：将乌头总碱a溶于ph值为3-5的醇溶液中，将所得溶液通过阳离子交换树脂色谱柱，依次用水和氨水溶液进行洗脱后，将阳离子交换树脂色谱柱中的树脂取出，并采用加热回流提取法进行提取，得到乌头总生物碱b。
在该步骤中，在采用酸溶碱沉的方法得到总碱性成分a之后，又利用针对生物碱的阳离子交换树脂，进一步纯化获得了总生物碱成分b(属于总碱性成分中的一部分)，去掉了其它碱性成分的杂质，进一步得到纯化，更便于后期纯化。
优选地，将“乌头总碱a溶于ph值为3-5的醇溶液中”的过程为：将乌头总碱a中，逐渐加入浓度为80-95％乙醇(ph值为2-3)，直至整个溶液的ph值至4为止。
优选地，依次用水和氨水溶液进行洗脱阳离子交换树脂色谱柱的过程包括：先用去离子水冲洗该色谱柱至中性，再用浓度为5-20％的氨水溶液洗脱碱化该色谱柱。进一步优选地，所用氨水溶液的体积量为树脂体积的0.5-2倍。
进一步地，上述氨水溶液的浓度为5-20％，或者为8-15％，或者为10-13％。
进一步地，上述阳离子交换树脂为强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂。优选地，上述阳离子交换树脂与乌头总碱a的质量比为8-12：1，或者为9-11：1。
进一步地，上述加热回流提取法的提取溶剂为70-90％的乙醇；提取温度为70-90℃；提取时间为2-4h。
步骤s3：采用反相色谱c18柱分离乌头总生物碱b，得到混合物c。
在该步骤中，利用反相色谱c18柱进行柱层析分离，得到仅含12-表-欧乌碱和欧乌碱的混合物c，去掉了其它杂质，使分离更加精准，避免了随意性和偶然性。
进一步地，洗脱剂为甲醇-水混合溶剂，收集体积浓度为65-75％的甲醇洗脱部分，得到混合物c。
优选地，上述洗脱剂甲醇－水混合溶剂的体积浓度依次为：5-15％、25-35％、45-55％、65-75％和85-95％，每个浓度分别使用两个柱体积的浓度进行洗脱。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1
本实施例提供一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，其包括：
a.称取准噶尔乌头干燥根5.0kg，粉碎机粉碎后过20-40目筛，筛过后待用。
b.对准噶尔乌头药材粉末，加入5倍体积量、浓度为90％的乙醇(用稀盐酸调ph值至2-3)，在70℃温度下回流提取8h，期间每隔30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取物，再将该提取物用氨水调ph值至9-10，出现沉淀物质或悬浮物质。
再对以上提取物用等体积的乙酸乙酯溶剂反复萃取3次，合并3次的乙酸乙酯萃取液，回收溶剂干，得到黏稠状物质350g，即为总碱性组分a，待用。
c.在总碱性组分a中，逐渐加入浓度为95％的乙醇(用稀盐酸调ph值至2～3)，至整个溶液ph值至4为止。将该溶液通过强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为总碱性组分a质量的10倍。
首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为10％的氨水溶液洗脱碱化该色谱柱，所用氨水体积量为树脂体积的1倍；再将树脂从色谱柱中取出，置于连续回流提取器中，用浓度为80％的乙醇进行提取，所用乙醇体积量为树脂体积的3倍，在温度80℃下回流提取3h，收集此部分乙醇提取液，回首溶剂，得到固体状物质80g，即为总生物碱组分b。
d.采用反相色谱c18柱分离，c18色谱填料用量为总生物碱组分b质量的10倍，洗脱剂采用甲醇-水混合溶剂，甲醇的体积浓度依次为10％、30％、50％、70％和90％，每个浓度分别使用两个柱体积的洗脱剂进行洗脱，收集其中用70％甲醇洗脱部分，即得仅含欧乌碱与表-欧乌碱的混合物c(2.6g)。
e.采用氨基色谱柱分离，氨基色谱填料用量为混合物c质量的20倍，洗脱剂采用正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂，体积比依次为90:5:5、80:10:10、70:15:15、60:25:15、50:25:25、40:30:30，每个比例分别使用两个柱体积的洗脱剂进行洗脱，其中，在80:10:10比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到欧乌碱(质量：0.7g；纯度94％)；在50:25:25比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到12-表-欧乌碱(质量：1.4g；纯度95％)。
实施例2
本实施例提供一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，其包括：
a.称取准噶尔乌头干燥根5.0kg，粉碎机粉碎后过20-40目筛，筛过后待用。
b.对准噶尔乌头药材粉末，加入7倍体积量、浓度为70％的乙醇(用稀盐酸调ph值至2-3)，在60℃温度下回流提取10h，期间每隔30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取物，再将该提取物用氨水调ph值至9-10，出现沉淀物质或悬浮物质。
再对以上提取物用等体积的乙酸乙酯溶剂反复萃取3次，合并3次的乙酸乙酯萃取液，回收溶剂干，得到黏稠状物质330g，即为总碱性组分a，待用。
c.在总碱性组分a中，逐渐加入浓度为80％的乙醇(用稀盐酸调ph值至2-3)，至整个溶液ph值至4为止。将该溶液通过强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为总碱性组分a质量的8倍。
首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为20％的氨水溶液洗脱碱化该色谱柱，所用氨水体积量为树脂体积的0.5倍；再将树脂从色谱柱中取出，置于连续回流提取器中，用浓度为70％的乙醇进行提取，所用乙醇体积量为树脂体积的3倍，在温度90℃下回流提取2h，收集此部分乙醇提取液，回首溶剂，得到固体状物质73g，即为总生物碱组分b。
d.采用反相色谱c18柱分离，c18色谱填料用量为总生物碱组分b质量的8倍，洗脱剂采用甲醇-水混合溶剂，甲醇的体积浓度依次为15％、35％、55％、75％和95％，每个浓度分别使用两个柱体积的洗脱剂进行洗脱，收集其中用70％甲醇洗脱部分，即得仅含欧乌碱与表-欧乌碱的混合物c(2.2g)。
e.采用氨基色谱柱分离，氨基色谱填料用量为混合物c质量的16：1倍，洗脱剂采用正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂，体积比依次为90:5:5、80:10:10、70:15:15、60:25:15、50:25:25、40:30:30，每个比例分别使用两个柱体积的洗脱剂进行洗脱，其中，在80:10:10比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到欧乌碱(质量：0.5g；纯度93％)；在50:25:25比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到12-表-欧乌碱(质量：1.2g；纯度95％)。
实施例3
本实施例提供一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，其包括：
a.称取准噶尔乌头干燥根5.0kg，粉碎机粉碎后过20-40目筛，筛过后待用。
b.对准噶尔乌头药材粉末，加入4倍体积量、浓度为90％的乙醇(用稀盐酸调ph值至2-3)，在80℃温度下回流提取5h，期间每隔40min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取物，再将该提取物用氨水调ph值至9-10，出现沉淀物质或悬浮物质。
再对以上提取物用等体积的乙酸乙酯溶剂反复萃取3次，合并3次的乙酸乙酯萃取液，回收溶剂干，得到黏稠状物质310g，即为总碱性组分a，待用。
c.在总碱性组分a中，逐渐加入浓度为90％的乙醇(用稀盐酸调ph值至2-3)，至整个溶液ph值至4为止。将该溶液通过强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为总碱性组分a质量的12倍。
首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为5％的氨水溶液洗脱碱化该色谱柱，所用氨水体积量为树脂体积的2倍；再将树脂从色谱柱中取出，置于连续回流提取器中，用浓度为90％的乙醇进行提取，所用乙醇体积量为树脂体积的4倍，在温度70℃下回流提取4h，收集此部分乙醇提取液，回首溶剂，得到固体状物质68g，即为总生物碱组分b。
d.采用反相色谱c18柱分离，c18色谱填料用量为总生物碱组分b质量的12倍，洗脱剂采用甲醇-水混合溶剂，甲醇的体积浓度依次为5％、25％、45％、65％和85％，每个浓度分别使用两个柱体积的洗脱剂进行洗脱，收集其中用65％甲醇洗脱部分，即得仅含欧乌碱与表-欧乌碱的混合物c(1.9g)。
e.采用氨基色谱柱分离，氨基色谱填料用量为混合物c质量的24：1倍，洗脱剂采用正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂，体积比依次为90:5:5、80:10:10、70:15:15、60:25:15、50:25:25、40:30:30，每个比例分别使用两个柱体积的洗脱剂进行洗脱，其中，在80:10:10比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到欧乌碱(质量：0.4g；纯度93％)；在50:25:25比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到12-表-欧乌碱(质量：0.9g；纯度94％)。
综上可知，本实施方式采取上述分离方法，根据乌头药材的特性，生物碱的结构特征以及酸碱性，特殊分离材料，依次采用酸溶碱沉、阳离子交换树脂、反相色谱柱(rp-18柱)、氨基(nh2)柱等方法，按照总碱性成分、总生物碱、12-表-欧乌碱和欧乌碱的混合物、12-表-欧乌碱和欧乌碱的单体化合物的思路，一步一步除掉杂质，使需要分离的产物逐渐得到纯化，并最终得到分离，精确和可靠，具有可重复操作性，避免了现有技术方法的偶然性。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。