本发明属于医药领域，具体涉及含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐，它们的制备方法以及含有所述化合物的药物组合物。本发明还涉及该类化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗由于c-met激酶异常高表达所引起疾病的药物中的用途，特别是在制备治疗和/或预防胃癌、结肠癌、肺腺、慢性髓系白血病和胃肠道间质瘤、伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤等癌症药物中的用途。
背景技术：
国家癌症中心2019年最新癌症报告显示：癌症已经变成了威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，根据最新的国际数据显示，因癌症死亡的人数占总死亡人数的23.91％，且自2000年以来恶性肿瘤造成的发病率和死亡率一直呈上升态势。
研究发现，受体酪氨酸激酶(rtks)在许多细胞内信号转导中扮演重要的角色。rtks超表达，功能的失调或不适当的激活均可以影响细胞的生存、增殖和功能，导致癌症发生甚至是抵抗癌症治疗。因此，抑制rtks已成为有吸引力的治疗干预目标。其中，在许多癌症中，癌细胞的生长和转移是由hgf/c-met信号通路的异常引起的，所以寻求高效的c-met激酶抑制剂已成为治疗癌症的有效手段。c-met最初被确定为一个致癌融合蛋白(tpr/met)，它是在细胞受到致癌物质n-甲基-n'-硝基-n-亚硝基胍作用时被发现的。后来证明c-met在胚胎发展中发挥重要作用，参与细胞的增殖和分化过程。c-met和hgf在成人组织中广泛表达但它们的生物活性是有限的，一定条件下的压力或组织损伤下，c-met和hgf的表达可以调节并参与伤口愈合和组织损伤修复。在许多肿瘤细胞中，c-met基因存在过度扩增、超常表达、突变和剪接等异常，c-met激酶过度表达，并通过配体hgf介导的自分泌和旁分泌途径使得c-met激酶异常活化，如甲状腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌和胃癌等。hgf/c-met信号通路的异常能够降低肿瘤细胞间的黏附作用；促进细胞外基质降解和肿瘤细胞增殖；诱导肿瘤血管生成，从而增强肿瘤的发生、生长、侵袭和转移过程。此外，c-met激酶和hgf的高表达还与肿瘤的不良预后等过程有关。以c-met激酶为靶点，阻断肿瘤细胞中异常活化的hgf/c-met信号通路，肿瘤细胞就会出现形态改变、增殖减缓、成瘤性下降、侵袭能力减弱等一系列变化。因而，c-met激酶已成为一个抗肿瘤靶向治疗的重要靶点。
卡博替尼(cabozantinib)是第一个被批准上市的具有4-苯氧基喹啉母核的小分子c-met激酶抑制剂，用于不能手术的晚期或转移的甲状腺髓样癌，该药对vegfr-2、c-kit和flt-3等激酶也具有很强的抑制作用。另一个4-苯氧基喹啉类c-met激酶抑制剂foretinib，是卡博替尼的类似物，临床研究表明其对多种人肿瘤细胞株表现出显著的抑制增殖作用，目前已进入ⅲ期临床研究阶段。另一方面，吡啶类衍生物是一类重要的杂环化合物，含有吡啶结构的化合物常常具有抗癌、抗菌等广泛的生物活性。该类化合物已成为药学领域科研工作者研究的热点，尤其是在抗肿瘤药物方面的应用，例如：已上市药物索拉菲尼、瑞格菲尼，伊马替尼等均含有吡啶结构片段。科学研究发现，用取代的吡啶环替代卡博替尼的6,7-二甲氧基喹啉母核，得到的altiratinib和golvatinib保持了良好的c-met激酶活性，具有很好的抗肿瘤研发前景，目前分别处在i和ⅱ期临床研究阶段。
技术实现要素：
本发明的目的在于设计并合成一系列新的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物。经过体外活性筛选，表明该类化合物具有抗肿瘤活性，可用于抗肿瘤药物的开发。
本发明提供一种具有通式ⅰ所示的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐，
其中：
r1选自氢、c1-c10烷基、c3-c7环烷基、或被卤代的c1-c10烷基；
x选自1-4个相同或不同的以下取代基：氢、卤素、c1-c10烷基、或c1-c4烷氧基；
ar选自c6-c10芳基或5-10元杂芳基；其中，所述杂芳基含有1-3个选自n、o或s的杂原子，并且ar被1-3个相同或不同的r2取代；
r2选自氢、羟基、卤素、硝基、酯基、氨基、氰基、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷基硫基、被羟基取代或被氨基取代或被卤代的c1-c6烷基、被羟基取代或被氨基取代或被卤代的c1-c6烷氧基、被单或双c1-c6烷基取代的氨基、游离的或成盐的或酯化的或酰胺化的羧基、c1-c6烷基亚磺酰基、c1-c6烷基磺酰基、氨基甲酰基、c1-c6烷基酰胺氨基、c1-c6烷基酰基和被单或双c1-c6烷基取代的氨基甲酰基。
进一步的，上述的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐，其中，
r1选自c1-c10烷基、或c3-c7环烷基；
x选自1-4个相同或不同的以下取代基：氢或卤素；
ar选自苯基、萘基、或5-10元杂芳基；其中，所述杂芳基含有1-3个选自n、o或s的杂原子，并且ar被1-3个相同或不同的r2取代；
r2选自氢、羟基、卤素、硝基、酯基、氨基、氰基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、被卤代的c1-c6烷基、被卤代的c1-c6烷氧基、被单或双c1-c6烷基取代的氨基、c1-c6烷基酰氨基、c1-c6烷基磺酰基、c1-c6烷基酰基、或氨基甲酰基。
进一步的，上述的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐，其中，
r1选自甲基、乙基、丁基、环丙基、环丁基、环戊基、或环己基；
x选自1-2个相同或不同的以下取代基：氢、氟或氯；
ar选自苯基或5-6元杂芳基；其中，所述杂芳基含有1-3个选自n、o或s的杂原子，并且ar被1-3个相同或不同的r2取代；
r2选自氢、羟基、卤素、硝基、氨基、氰基、甲基、c1-c6烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、甲磺酰基、被单或双c1-c6烷基取代的氨基或c1-c6烷基酰氨基。
进一步的，上述的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐，其中，
r1选自甲基、乙基、或环丙基；
x选自1-2个相同或不同的以下取代基：氢或氟；
ar为苯基，并且ar被1-3个相同或不同的r2取代；
r2选自氢、卤素、甲基、甲氧基或三氟甲氧基。
进一步的，上述的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐，具有如下结构式，但这些化合物并不意味着对本发明的任何限制：
一种包括含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐的药物组合物，包含上述的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐作为活性成分以及药学上可接受的赋形剂。
进一步的，上述的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐或上述的所述的药物组合物在制备治疗和/或预防增生性疾病药物中的应用。
进一步的，上述的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐或权上述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
进一步的，上述的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物及其药学上接受的盐或上述的药物组合物在制备治疗和/或预防胃癌、结肠癌、肺腺、慢性髓系白血病和胃肠道间质瘤、伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤的药物中的应用。
而且，按照本发明所属领域的一些通常方法，本发明中通式ⅰ所示的含吡啶结构的2,4-二芳氨基嘧啶类衍生物可以与酸生成药学上可接受的盐。可药用加成盐包括无机酸和有机酸加成盐，与下列酸加成的盐是特别优选的：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。
本发明中“卤素是指氟、氯、溴或碘代；“烷基”是指直链或支链的烷基；“亚烷基”是指直链或支链的亚烷基；“环烷基”是指取代或未取代的环烷基；“芳基”是指无取代基或连有取代基的苯基；“杂芳基”是指含有一个或多个选自n、o、s杂原子的单环或多环的环状体系，环状体系是芳香性的，如咪唑基、吡啶基、吡唑基、(1,2,3)-和(1,2,4)-三唑基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异噁唑基、萘基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基和苯并噁唑基等；“饱和或部分饱和的杂环基”是指含有一个或多个选自n、o、s的杂原子的单环或多环的环状体系，如吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、吡唑烷基、咪唑烷基和噻唑啉基等。
本发明的有益效果是：
本发明，通过对c-met酶活性测试发现，本发明化合物具有显著的抑制c-met激酶活性。可用于治疗和/或预防由于c-met激酶异常高表达所引起疾病的药物中的用途，特别是在制备治疗和/或预防癌症的药物。
本发明，通过体外抑制人胃癌细胞mkn-45、人结肠癌细胞ht-29、人肺腺癌a549、人慢性髓系白血病细胞k562、人胃肠道间质瘤细胞gist882、伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤细胞gist-1210活性试验，证明本发明化合物对胃癌细胞、结肠癌细胞、肺腺癌、慢性髓系白血病细胞、胃肠道间质瘤细胞、伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤细胞均具有显著抑制作用，特别用于制备治疗和/或预防胃癌、结肠癌、肺腺、慢性髓系白血病和胃肠道间质瘤、伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤均的药物。
具体实施方式
下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。下列实施例旨在阐述而不是限制本发明的范围。化合物的核磁共振氢谱用brukerarx-600测定，质谱用agilent6460qqq测定；所用试剂均为分析纯或化学纯。
下面的合成路线描述了本发明的通式ⅰ衍生物的制备，所有的原料都是通过下述的合成路线、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终衍生物都是通过下述的合成路线或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。下述的合成路线中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。
合成路线如下所示：
制备通法
步骤an-(4-氯代吡啶-2-基)环丙基甲酰胺(a)
2-氨基4-氯吡啶8.80g和三乙胺20.80g溶解于80ml的二氯甲烷中，冰浴条件下向该溶液中滴加30ml含有9.30g环丙基甲酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完毕后升至室温。搅拌12h，反应完毕后混合物用20％k2co3溶液、饱和食盐水分别洗涤3次，分出有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂得粗产物，柱色谱分离，得白色固体，为中间体(a)。
步骤bn-(4-(2-氟-4-硝基苯氧基)吡啶-2-基)环丙基甲酰胺(b)
将中间体(a)8.00g和2-氟-4-硝基苯酚15.98g加入到100ml氯苯中，140℃反应40h。冷却至室温，减压浓缩，残余物用适量二氯甲烷溶解，以k2co3溶液、饱和食盐水分别洗涤3次，分出有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂得棕色固体，柱层析得淡黄色固体产物，为中间体(b)。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.00(s,1h),8.43(m,1h),8.30(d,j＝5.7hz,1h),8.19(m,1h),7.76(d,j＝2.2hz,1h),7.61(t,j＝8.5hz,1h),6.86(m,1h),2.04–1.95(m,1h),0.78(t,j＝6.3hz,4h)。
步骤cn-(4-(4-氨基-氟-2-氟苯氧基)吡啶-2-基)环丙基甲酰胺(c)
将中间体(b)6.00g，铁粉5.28g，醋酸11.36g，加入到100ml乙酸乙酯中，再加入20ml水，在80℃下回流2h，反应完毕，趁热过滤，分出有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得白色固体，为中间体(c)。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.79(s,1h),8.15(d,j＝5.7hz,1h),7.59(s,1h),6.95(t,j＝9.0hz,1h),6.67–6.61(m,1h),6.49(dd,j＝13.1,2.2hz,1h),6.40(d,j＝8.7hz,1h),5.44(s,2h),2.03–1.88(m,1h),0.76(br,4h)。
步骤dn-(4-(4-((2-氯带嘧啶-4-基)氨基)-2-氟苯氧基)吡啶-2-基)环丙烷基甲酰胺(d)
将中间体(c)3.00g，2,4-二氯嘧啶1.87g和二异丙基乙胺1.35g加入到50ml异丙醇中，在83℃下回流25h，减压蒸出溶剂，残余物溶于80ml二氯甲烷中，适量水洗4次，分出有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得粗产物，粗产物经硅胶柱层析得淡黄色固体产物，为化合物(d)。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.90(s,1h),10.34(s,1h),8.25-8.22(m,2h),7.88-7.60(m,2h),7.50–7.30(m,2h),6.85-6.71(m,2h),2.03–1.92(m,1h),0.84–0.72(m,4h)；ms(esi)m/z(％):400.1[m+h]+,422.0[m+na]+.
步骤e实施例1–17化合物制备通法：
将化合物(d)或其类似物0.20g和1.3当量的取代芳胺加入到5ml异丙醇中，加入1.0当量的对甲苯磺酸，升温至83℃回流反应10-18小时，待反应完毕，将反应混合物冷却至室温，析出大量固体，过滤出固体，滤饼用异丙醇洗涤三次，干燥得白色固体产物。
按照实施制备通法，分别制得实施例1–17化合物见表1。
表1：
体外抗肿瘤细胞活性
对本发明实施例的部分化合物进行了体外抑制人胃癌细胞mkn-45、人结肠癌细胞ht-29、人肺腺癌a549、人慢性髓系白血病细胞k562、人胃肠道间质瘤细胞gist882、伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤细胞gist-1210活性筛选和c-met激酶活性筛选。
体外细胞毒活性测试
(1)人胃癌细胞mkn-45、人结肠癌细胞ht-29、人肺腺癌a549、人慢性髓系白血病细胞k562、人胃肠道间质瘤细胞gist882、伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤细胞gist-1210细胞分别复苏并传代2-3次稳定后，用胰蛋白酶溶液(0.25％)使其从培养瓶底部消化下来。将细胞消化液倒入离心管中后，之后加入培养液以终止消化。将离心管在800r/min下离心10min，弃去上清液后加入5ml培养液，吹打混匀细胞，吸取10μl细胞混悬液加入细胞计数板中计数，调整细胞浓度为104个/孔。96孔板中除a1孔为空白孔不加细胞外，其余皆加入100μl细胞混悬液。将96孔板放入培养箱中培养24h。
(2)用50μl二甲基亚砜溶解受试样品，然后加入适量培养液，使样品溶解成2mg/ml药液，然后在24孔板中将样品稀释为20,4,0.8,0.16,0.032μg/ml。
每个浓度加入3孔，其中周围两行两列细胞长势受环境影响较大，只和为空白细胞孔使用。将96孔板放入培养箱中培养72h。
(3)将96孔板中带药培养液弃去，用磷酸缓冲溶液(pbs)将细胞冲洗两遍，在每孔中加入mtt(四氮唑)(0.5mg/ml)100μl放入培养箱中4h后，弃去mtt溶液，加入二甲基亚砜100μl。在磁力振荡器上振荡使存活细胞与mtt反应产物甲臜充分溶解，放入酶标仪中测定结果。通过bliss法可求出药物ic50值。实施例化合物及阳性对照药foretinib的抑制人胃癌细胞mkn-45、人结肠癌细胞ht-29、人肺腺癌a549、人慢性髓系白血病细胞k562、人胃肠道间质瘤细胞gist882、伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤细胞gist-1210的活性结果见表2。
c-met酶活性测试
用于测量c-met激酶活性的试验基于酶联免疫吸附试验(elisa)。具体操作是：
室温下，在0.25mg/mlpgt包被的板上，将实施例化合物、50pmc-met(his-标记的重组人met(氨基酸974-末端)，通过杆状病毒表达)和5μmatp在试验缓冲液中(25mmmops,ph7.4，5mmmgcl2，0.5rammncl2，100μm原钒酸钠，0.01％tritonx-100，1mmdtt，最后dmso浓度1％(v/v))温育20分钟。通过冲洗除去反应混合物并用0.2μg/ml缀合辣根过氧化物酶(hrp)的磷酸酪氨酸特异性单克隆抗体(py20)检测磷酸化聚合物底物。加入1m磷酸终止显色后，于450nm处通过分光光度法定量显色的底物(tmb)的颜色。实施例化合物及阳性对照品(foretinib)对c-met激酶的抑制数据见表2。
化合物的抑制人胃癌细胞mkn-45、人肺腺癌a549和c-met激酶活性结果见表2所示，表2中的ic50≦10.0μm，以a表示，ic50﹥10.0μm，以b表示，nd表示未测试。
表2
从表2可以清楚地看出，本发明所要保护的通式(ⅰ)的化合物在体外对肿瘤细胞株和c-met激酶均具有良好的体外抗肿瘤活性。该类化合物具有良好的抗肿瘤药物开发应用前景。
尽管已经通过特定实施方案描述了本发明，但修改和等价变化对于精通此领域的技术人员而言是显见的，且它们都包含在本发明范围之内。