禽白血病P27蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种禽白血病p27蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

禽白血病是由反转录病毒禽白血病病毒(alv)引起的禽类肿瘤病的总称。感染鸡的alv有七个亚群，分别为a、b、c、d、e、j和k亚群，其中k亚群为最近发现的新亚群。alv-j最早在20世纪80年代末从英国分离到的外源性病毒，其致病性和感染性较强。我国1999年首次报道分离到alv-j，随后国内多个省均分离到该病毒，特别是2009年以来，国内多个省大面积爆发alv，给养殖业带来巨大的经济损失。

alv基因组主要由gag,pol,env基因组成，其中gag基因核苷酸在各亚群中高度保守，该基因组含有p27基因，表达的p27蛋白是群特异性抗原，在病毒总蛋白中含量较高，含有较多能够被检测的抗原位点，因此，检测p27成为检测禽白血病病毒的首选抗原。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种禽白血病p27蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一株杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株1f8，于2019年4月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno:c201944，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

一种禽白血病p27蛋白单克隆抗体，由保藏号为cctccno:c201944的杂交瘤细胞产生。

上述禽白血病p27蛋白单克隆抗体在禽白血病病原诊断技术领域的应用。

上述杂交瘤细胞株1f8的制备方法，包括如下步骤：

(1)通过原核表达制备禽白血病病毒p27蛋白作为抗原，将禽白血病病毒p27蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化；将乳化的佐剂经小鼠背部多点注射，首次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫采用弗氏不完全佐剂，免疫三次；

(2)第三次免疫后，尾静脉采取小鼠血液，检测血清中抗体效价，选出抗体效价水平较高的小鼠进行腹腔冲击免疫，即用不加佐剂的p27蛋白直接注入小鼠腹腔；

(3)无菌取出免疫小鼠的脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，检测融合细胞分泌的抗体效价，通过多次克隆筛选到由单个细胞长成的能够稳定分泌抗p27蛋白的杂交瘤细胞株。

上述方案中，步骤(1)所述三次免疫的剂量为50ug～70ug/次，步骤(2)所述腹腔冲击免疫的剂量为25ug～50ug，每次免疫的间隔时间均为14天。

上述方案中，第三次免疫7天后采取小鼠血液检测血清中抗体效价。

上述方案中，步骤(3)所述细胞融合是在腹腔冲击免疫后第3天进行，使用的融合剂为peg4000。

上述方案中，步骤(3)中细胞培养使用的培养基为含有胎牛血清的rpmi-1640培养基。

本发明的有益效果：采用本发明制备的单克隆抗体可以检测鸡是否感染禽白血病病毒，同时，可以准确的定位禽白血病病毒在感染鸡体内组织中的分布，为禽白血病的诊断提供有利的工具，为进一步研究该病奠定基础。

附图说明

图1为表达的禽白血病病毒p27蛋白的sds-page电泳分析结果。

图2为采用本发明的单克隆抗体进行免疫印记试验的结果。

图3为本发明所述单克隆抗体用于禽白血病病毒的检测结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1免疫原的制备

1.引物的设计与合成

参考已经发表的禽白血病病毒毒株设计一对引物:

p15′-tccgaattcggagttcatctattgcaacaa-3′，

p2：5′-gtactcgagttagcgcctgctacggtggtg-3′，

上下游引物分别添加bamhⅰ和hindⅲ酶切位点。引物由上海生物工程技术有限公司合成。

2.构建重组质粒pet-28a-p27：按照病毒dna/rna提取试剂盒说明书提取禽白血病病毒基因组，反转录后进行pcr扩增，反应条件为：95℃5min；94℃30s、52℃30s、72℃1min，进行33个循环，再72℃10min，4℃60min。将pcr产物经琼脂糖凝胶进行电泳，并对扩增片段进行回收，同时回收空载体pet-28a。经bamhⅰ和hindⅲ酶切后用t4dna连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α，挑取平板上的克隆接种，进行菌液pcr鉴定，阳性克隆送上海生物工程技术有限公司测序。

3.p27基因表达与蛋白纯化

将重组质粒pet-28a-p27转化进入大肠杆菌rosetta，挑取阳性单菌落扩大培养，加入iptg诱导表达，超声波破碎菌体后收集上清液，使用his-镍亲和层析柱进行纯化，用含咪唑的洗脱液进行洗脱，蛋白透析后测定浓度并用sds-page分析(图1)。

4.p27蛋白鉴定：纯化后的蛋白用sds-page电泳进行分析，然后将蛋白转印到nc膜上，用5％的脱脂奶粉进行封闭，用禽白血病阳性血清做为一抗孵育过夜，pbst洗涤3遍，加入1:500稀释的hrp-羊抗鸡二抗孵育1h，pbst洗涤3遍后dab显色，出现目的条带后终止。

结果显示：重组质粒pet-28a-p27经bamhⅰ和hindⅲ双酶切后分别有大小为717bp和5367bp的片段，与目的片段大小一致，经iptg诱导表达的p27蛋白大小约为28kda。蛋白经his-镍亲和层析柱进行纯化，sds-page分析显示纯化后蛋白杂带较少，蛋白浓度为1mg/ml。免疫印迹结果显示：p27蛋白与阳性血清发生免疫反应，表明本试验表达的p27蛋白具有免疫反应性。

实施例2杂交瘤细胞株的筛选

1.免疫小鼠：将纯化的p27蛋白作为抗原免疫balb/c小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心)，蛋白加入弗氏佐剂进行乳化，免疫剂量为50ug/只，采用颈背部多点注射，间隔2周免疫1次，第3次免疫后采取小鼠血液进行抗体检测，挑选抗体水平较高的小鼠进行腹腔冲击免疫，p27蛋白25ug/只。

2.细胞融合实验：无菌条件下取免疫小鼠的脾脏制备成脾细胞悬液，加入骨髓瘤细胞sp2/0细胞，通过细胞计数调整细胞比例约10:1左右。细胞混合液离心后弃掉上清，细胞在37℃无菌条件加入适量peg4000，补充rpmi-1640基础培养基，离心后加入含有hat的完全培养基悬浮细胞，细胞悬液均匀的铺入96孔细胞培养板中，放入37℃、5％co2的培养箱中培养。

3.阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆：细胞融合后10天左右，分别用p27蛋白和禽白血病病毒包被酶标板，对生长杂交瘤细胞孔的上清进行间接elisa方法检测，挑选两次检测均为阳性且阳性值较高、孔内集落数较少的的细胞孔进行亚克隆，加入饲养细胞陪伴杂交瘤细胞生长。克隆后1周左右取细胞上清用间接elisa方法检测，再次克隆。经过3次亚克隆后筛选到能够稳定分泌抗p27蛋白的单个杂交瘤细胞株。

4.杂交瘤细胞株的保存

将筛选到的杂交瘤细胞1f8扩大培养，待长势良好时离心，1000r/min5min，弃上清，用含10％dmso的完全培养基悬浮细胞，分装到2毫升冻存管中，放入程序降温盒中过夜，转入液氮中冻存，取其中10管于2019年4月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno:c201944，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

结果显示：经过细胞融合实验，最终筛选到能够稳定分泌抗p27蛋白的杂交瘤细胞株，命名1f8，于2019年4月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno:c201944，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。

实施例3腹水的制备与纯化

1.小鼠腹水的制备与纯化：取8周龄健康balb/c小鼠，腹腔注射不完全佐剂0.5ml/只，1周后，待杂交瘤细胞生长状态良好时注入到小鼠腹腔内，每只小鼠注入细胞1×10⁶个。10d左右，小鼠腹部明显膨胀，无菌条件下用针头收集腹水，4℃条件下10000r/min，离心10min，吸取上清-80℃保存。

2.腹水的纯化

取5毫升腹水按照常规辛酸-硫酸铵沉淀法对腹水进行纯化。具体步骤：腹水加入4倍体积的醋酸盐缓冲液，调ph值4.5，室温下用电磁搅拌器边搅拌边滴加辛酸，加入量为每毫升腹水加入25ul辛酸，搅拌30min后放入4℃过夜。4℃，10000r/min离心30min，收集上清并过滤去除杂质，加入10％体积的10×磷酸盐缓冲液，调ph值7.4，在4℃条件下缓慢加入硫酸铵粉末，加入量为每毫升0.277g，继续搅拌30min，4℃过夜。4℃，10000r/min离心30min，沉淀用少量透析液悬浮。按照琼脂糖凝胶proteing说明书纯化抗体，纯化后蛋白测定浓度并用sds-page电泳分析。

无菌条件下收取小鼠腹水，经辛酸-硫酸铵初步纯化后，经过proteing纯化后sds-page电泳分析，结果显示：在55kda和25kda左右分别有重链和轻链，大小正确且无杂带，说明纯化到单克隆抗体。

实施例4单克隆抗体的鉴定

1.效价测定：将单克隆抗体从1:3200开始倍比稀释，加入到包被p27蛋白的酶标板中，100ul/孔，37℃孵育40min，弃去液体，洗涤3遍拍干，加入1:4000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100ul/孔，37℃孵育40min，弃去液体，洗涤3遍拍干，加入显色液避光显色10min，加入终止液，用酶标仪测定波长630处的吸光值。结果显示：稀释后的单克隆抗体经间接elisa方法测定，1f8抗体效价为3200x2¹⁶，抗体效价较高。

2.单克隆抗体亚类鉴定：将单克隆抗体1:2000倍稀释，加入到包被p27蛋白的酶标板中，100ul/孔，37℃孵育40min，弃去液体，洗涤3遍拍干，分别加入1:2000稀释的hrp标记的羊抗鼠igm、igg1、igg2a、igg2b、igg3，100ul/孔，37℃孵育40min，弃去液体，洗涤3遍拍干，加入显色液避光显色10min，加入终止液，用酶标仪测定波长60处的吸光值。结果显示：该杂交瘤细胞亚类属于igg1。

3.免疫印记鉴定：将p27蛋白用sds-page电泳进行分析，然后将蛋白转印到nc膜上，用5％的脱脂奶粉进行封闭，加入1:500稀释的单克隆抗体孵育过夜，用pbst洗涤3遍，加入1：2000稀释的hrp-羊抗鼠二抗孵育1h，用pbst洗涤3遍，最终使用dab显色并拍照(图2)。图2结果显示：单克隆抗体能与p27蛋白发生特异性反应，说明本发明筛选到的杂交瘤细胞株能分泌针对p27蛋白的特异性抗体。

4.单克隆抗体特异性实验：将禽白血病病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌分别包被到酶标板中，一抗为1:2000稀释的单克隆抗体，37℃孵育40min，弃去液体，洗涤3遍拍干，加入1:4000稀释的hrp-羊抗鼠igg，孵育40min，弃去液体，洗涤3遍拍干，加入显色液避光显色10min，加入终止液，用酶标仪测定波长630处的吸光值。间接elisa实验结果显示，单克隆抗体与alv发生特异性反应，不与其他病毒和细菌发生反应，表明本发明制备的单克隆抗体特异性良好。

实施例5禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体免疫组化应用

1.石蜡切片的制备：放血处死禽白血病为阳性的病鸡，剖开腹腔，取新鲜的布满肿瘤的肝脏、脾脏和肾脏，放入含4％的多聚甲醛溶液固定2天。放入自动脱水机中进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后，对组织进行包埋，石蜡切片厚度为4μm。

2.免疫组织化学染色：切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，最终放入流水中冲洗5min。切片用3％过氧化氢水溶液室温避光处理30min，分别用纯水和pbs洗涤1次，每次5min，以消除内源性过氧化物酶活性。将玻片浸入枸橼酸盐缓冲液中，置微波炉高火至沸腾，休息1min，低火25min，冷却后用pbs洗涤3次，每次5min。将切片置于湿盒中，滴加5％bsa于组织上，室温孵育30min。将制备的单克隆抗体1：:100稀释，滴加到组织上，4℃冰箱孵育过夜，pbs洗涤3次，每次5min。将稀释的hrp-羊抗鼠igg滴加到组织上，常温孵育30min，pbs洗涤3次，每次5min。使用dab显色液室温孵育10min左右，随时终止反应。苏木素复染2min，流水冲洗后分化液作用20s左右，纯水清洗2min，95％乙醇1min，100％乙醇2min×2次，二甲苯2min×3次，中性树脂封片。放在显微镜下观察。

图3为免疫组化染色后的显微图，图3可以看到肝脏和肾脏组织中胞浆和胞核着色较深，单克隆抗体在免疫检测中特异地检测到p27蛋白，本发明的单克隆抗体可以用于禽白血病病毒的检测。

采用本发明的单克隆抗体进行免疫组化试验检测组织是否感染禽白血病，其结果显示可以通过本发明的单克隆抗体明确的检测出禽白血病病毒p27蛋白在组织中的分布。该结果表明此单克隆抗体可在免疫组化试验中特异地检测p27蛋白，该蛋白在感染禽白血病病毒的鸡组织中表达，由此可以鉴定鸡是否感染禽白血病。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。