识别人乳头瘤病毒HPV16-E7抗原的TCR的制作方法

本发明涉及t细胞抗原受体技术领域，尤其涉及能特异性识别并结合人乳头瘤病毒抗原hpv16-e7的tcr，以及包含编码所述tcr的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述tcr、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述tcr、核酸分子、载体、细胞、药物组合物的用途。

背景技术：

人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)是一种小型的双链dna病毒。根据hpv的致病性差异，可将hpv分为高危型和低危型两类。研究证实高危型hpv(包括hpv-16、18、31、33以及45)的持续性感染是导致多种恶性肿瘤的诱因。例如：hpv-16及hpv-18的感染可诱发宫颈癌及头颈癌；此外，约70％的直肠癌以及超过75％的舌根和扁桃体癌也均与hpv-16感染相关。尽管接种hpv疫苗可有效预防hpv感染所引发的癌症，然而对于已经感染hpv的肿瘤患者，尤其是晚期肿瘤患者，手术、放疗、化疗等常规疗法对患者病情的缓解均收效甚微。

高危型hpv病毒对细胞的感染和转化使得肿瘤细胞内表达hpv特异的肿瘤抗原，如癌蛋白e6及e7。这些抗原在正常人体组织中并无表达，是理想的t淋巴细胞识别并杀伤肿瘤细胞的靶点。然而，研究显示在宫颈癌患者的外周血中没有或仅存在数量稀少的hpv16-e711-19特异性的t细胞。t细胞受体基因修饰的t淋巴细胞过继免疫疗法(adoptivecelltransfer，act)通过将可识别病毒/肿瘤抗原的tcr基因整合至患者t细胞中，使得原本不具备抗原特异性的患者t细胞可识别并杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的效用(jin，b.y.，etal.2018，jciinsight，3(8)：e99488)。临床研究显示t细胞受体基因转导的t细胞用于治疗12例hpv阳性晚期肿瘤患者，(包括6例宫颈癌、4例直肠癌、1例口咽癌和1例阴道癌)，所有患者均未产生自身免疫、细胞因子释放等毒副作用，显示出该疗法良好的安全性和耐受性。此外，2名患者的肿瘤转移病灶消退，且分别获得3个月和6个月的持续性病情缓解(hinrichs，c.s.，etal.2017，americansocietyofclinicaloncology，35：3009-3009.)。

分离并鉴定得到特异性、亲和力良好的tcr是实施tcr基因修饰t细胞免疫治疗的基础。不同tcr分子的特性赋予了tcr-t产品不同的效用功能。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能识别并结合hla-a2-hpv16-e711-19抗原复合物的tcr，以及包含编码所述tcr的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述tcr、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述tcr、核酸分子、载体、细胞、药物组合物的用途。

所述hla-a2-hpv16-e711-19抗原复合物由人白细胞表面抗原hla-a2及hpv16-e711-19短肽(ymldlqpet)组成，表达于目标靶细胞表面。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明的第一方面，提供一种识别人乳头瘤病毒hpv16-e7抗原的tcr，所述tcr具有结合hla—a2-hpv16-e711-19抗原复合物的特性，所述tcr包含tcrα链可变区和tcrβ链可变区；

所述tcrα链可变区的cdr3氨基酸序列为cavlygnnrlaf(seqidno：7)，

和/或所述tcrβ链可变区的cdr3氨基酸序列为casslawrggsyneqff(seqidno：10)。

优选的，所述tcrα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

αcdr1：seqidno：5，

αcdr2：seqidno：6，

αcdr3：seqidno：7。

更优选的，所述tcrα链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

αcdr1：seqidno：11，

αcdr2：seqidno：12，

αcdr3：seqidno：13。

优选的，所述tcrβ链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

βcdr1：seqidno：8，

βcdr2：seqidno：9，

βcdr3：seqidno：10。

更优选的，所述tcrβ链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

βcdr1：seqidno：14，

βcdr2：seqidno：15，

βcdr3：seqidno：16。

优选的，以上所述的识别人乳头瘤病毒hpv16-e7抗原的tcr，所述tcrα链可变区的氨基酸序列为与seqidno：1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

优选的，以上所述的识别人乳头瘤病毒hpv16-e7抗原的tcr，所述tcrβ链可变区的氨基酸序列为与seqidno：2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

本发明的另一方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码以上任一所述tcr的核苷酸序列或其互补序列。

优选的，所述核酸分子包含编码tcrα链可变区的核苷酸序列seqidno：3，和/或包含编码tcrβ链可变区的核苷酸序列seqidno：4。

本发明的另一方面，提供一种载体，所述载体含有以上任一所述的核酸分子。

优选的，所述载体为病毒载体。

更优选的，所述载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。

本发明的另一方面，提供一种细胞，所述细胞转导以上任一所述核酸分子或以上任一所述载体，该细胞可表达结合hla-a2-hpv16-e711-19抗原复合物的特异性tcr。

优选的，所述细胞为t细胞或干细胞。

本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含以上任一所述的tcr、以上任一所述的核酸分子、以上任一所述的载体或以上任一所述的细胞作为活性成分。

本发明的另一方面，以上任一所述的tcr、以上任一所述的核酸分子、以上任一所述的载体、以上任一所述的细胞、以上任一所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤或病毒感染的药物。

优选的，以上任一所述的tcr、任一所述的核酸分子、任一所述的载体、任一所述的细胞、任一所述的药物组合物分别用于制备治疗hpv阳性的各类恶性肿瘤的药物；进一步地，用于制备治疗宫颈癌、头颈癌、直肠癌、阴道癌的药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了能特异性识别并结合hla-a2-hpv16-e711-19抗原复合物的tcr，以及包含编码所述tcr的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述tcr、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述tcr、核酸分子、载体、细胞、药物组合物分别用于制备治疗肿瘤或病毒感染的药物的用途。

附图说明

图1为插入逆转录病毒载体的tcr序列元件示意图；

图2流式细胞术检测hla-a2-hpv16-e711-19特异性tcr(g8)基因修饰t细胞(tcr-t细胞)的转导效率；

图3为流式细胞术检测g8tcr-t细胞与靶细胞共培养后释放细胞因子(ifn-γ及il-2)及发挥细胞毒性功能(cd107a表达)的能力；

图4为elisa检测g8tcr-t细胞与人宫颈癌细胞系(hla-a2阳性且hpv16-e7抗原阳性)共培养后，特异性释放细胞因子的能力。

具体实施方式

为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书公开的内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。以下实施例的主要目的是用于进一步介绍本发明方法的具体实施过程，不代表本发明方法仅能按以下实施例实现。

实施例1：hla-a2-hpv16-e711-19特异性t细胞的克隆及测序

利用化学合成的短肽ymldlqpet(生工生物工程(上海)股份有限公司)体外刺激来源于hla-a2基因型且hpv阳性宫颈癌患者的外周血单个核细胞(pbmc)。经过2轮多肽刺激后，将多克隆t细胞(1×10⁵)与1×10⁵负载ymldlqpet短肽(靶细胞)或非目标短肽的t2细胞(对照细胞)于37℃共培养过夜。第二天检测培养上清中细胞因子ifn-r的释放量。将阳性多克隆t细胞(靶细胞od450-对照细胞od450＞1.0)进行有限稀释克隆，14天后elisa检测有限稀释后各孔t细胞与靶细胞的反应性。挑取阳性单克隆t细胞进行快速扩增。快速扩增14天后，用鼠抗人cd8抗体(bdbiosciences)及hla-a2-hpv16-e711-19四聚体染色(mbl)对t细胞进行染色，经流式细胞仪分选出cd8阳性且四聚体染色阳性的目标t细胞(克隆g8)。

分选后的t细胞(2-5×10⁶)经离心去除上清后重悬于1mltrizol(rneasyplusuniversalminikit，qiagen)，液氮速冻后送测序(免疫组库测序，苏州金唯智生物科技有限公司)。根据测序结果将测得频率最高的tcrα链及tcrβ链进行配对，pcr构建包含恒定区的全长tcr(tcr序列的元件示意图如图1所示)并插入逆转录病毒载体中。

其中，tcrα链可变区氨基酸序列为seqidno：1。

tcrα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

αcdr1：tsgfng(seqidno：5)，

αcdr2：nvldgl(seqidno：6)，

αcdr3：cavlygnnrlaf(seqidno：7)。

tcrα链可变区核苷酸序列为seqidno：3。

tcrα链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

αcdr1：acatctgggttcaacggg(seqidno：11)，

αcdr2：aatgttctggatggtttg(seqidno：12)，

αcdr3：tgtgctgtcctctatgggaacaacagactcgctttt(seqidno：13)。

tcrβ链可变区氨基酸序列为seqidno：2。

tcrβ链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

βcdr1：sghdt(seqidno：8)，

βcdr2：yyeeee(seqidno：9)，

βcdr3：casslawrggsyneqff(seqidno：10)。

tcrβ链可变区核苷酸序列为seqidno：4。

tcrβ链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

βcdr1：tctgggcatgacact(seqidno：14)，

βcdr2：tattatgaggaggaagag(seqidno：15)，

βcdr3：tgtgccagcagcttggcgtggcgggggggctcctacaatgagcagttcttc(seqidno：16)。

实施例2：制备hla-a2-hpv16-e711-19特异性tcr基因修饰的t细胞

将目标tcr克隆至逆转录病毒载体pmsgv1中(addgene)构建pmsgv1-g8tcr载体。转染病毒包装细胞系293gp细胞pmsgv1-g8tcr及pvsv-g质粒，制备逆转录病毒并采用病毒上清转导t细胞。

转染操作如下：第0天将293gp细胞接种至6孔板(6×10⁵/孔)；第1天，pmsgv1-g8tcr及pvsv-g质粒转染293gp细胞(2μgpmsgv1-g8tcr及1.4μgpvsv-g/孔)，同一天，采用抗人cd3抗体(okt3)活化健康人的pbmc；第3天，收集含病毒上清的培养液，并添加新鲜的培养液(含10％胎牛血清的dmen)至293gp细胞中；用收集的病毒上清离心转染活化后的t细胞；第4天采用同样的方法第二次转染活化的t细胞；第5天将转染后的t细胞收集至t25培养瓶中进行培养(培养液为含10％胎牛血清及300u/mlil2的x-vivo(lonza))。第10天流式检测目标tcr的表达水平，如图2所示，tcr的转导效率(四聚体染色的阳性率)为39％。

实施例3：hla-a2-hpv16-e711-19特异性tcr基因修饰t细胞的体外功能验证

流式细胞术检测：靶细胞的制备如下，将负载目标hpv16-e711-19多肽及对照多肽cmv-pp65495-503的t2细胞(hla-a2⁺)与tcr-t细胞于37℃共培养4小时后，流式细胞术检测t细胞细胞毒性功能标志物cd107a的表达、细胞因子ifn-γ及il-2的表达，如图3所示，hla-a2-hpv16-e711-19特异性tcr基因修饰t细胞可特异性识别靶细胞释放细胞因子并发挥细胞毒性效用。

elisa检测：将hla-a2⁺且hpv⁺的人宫颈癌细胞系caski(atcc)分别与cd4⁺以及cd8⁺g8tcr-t细胞进行共培养(37℃，16h)，取培养上清检测ifn-γ的释放量，如图4所示，cd4⁺以及cd8⁺的对照t细胞均不识别caski靶细胞，而tcr基因修饰后的cd4⁺以及cd8⁺t细胞均可特异性识别靶细胞并释放细胞因子，表明该tcr发挥功能不依赖于cd8分子，具有较高的亲和力。

以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

序列表

<110>深圳因诺免疫有限公司；深圳市因诺转化医学研究院

<120>识别人乳头瘤病毒hpv16-e7抗原的tcr

<130>20190624

<141>2019-07-17

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>109

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>1

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<213>人(homosapiens)

<400>16

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