本发明涉及天然产物多糖的提取与分离，更具体地说，涉及一种具有抗衰老活性牛大力多糖的制备方法。
背景技术：
：牛大力(millettiaspeciosachamp.)为豆科蝶形花亚科崖豆藤属植物美丽崖豆藤的干燥块根，两广地区广泛种植，常用于药膳、药酒，具有润肺补虚、活络壮筋、止咳清肺之功效，为岭南地区著名的药食两用植物。牛大力含有香豆素、生物碱和糖类等有效成分，现代药理学研究证实牛大力具有抗氧化、抗炎、免疫调节、保肝等多种药理作用。牛大力已作为主要原料应用于强力健身胶囊等多种中成药的生产，临床用于治疗肺炎、慢性支气管炎、病后体虚、腰肌劳损等慢性疾病。天然产物中多糖具有多种生物活性且毒副作用小等优点，如抗炎、增强免疫、抗氧化、降血糖等，越来越受到研究者的青睐。研究表明天然产物多糖具有抗氧化延缓衰老作用。衰老与氧化应激损伤导致的抗氧化能力减弱及细胞内活性氧簇水平增加关系密切，还与机体免疫功能下降有关。研究表明牛大力多糖由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖和果糖等组成，具有体外抗氧化活性和抗脂质过氧化作用。牛大力多糖可减少脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞raw264.7细胞释放炎症因子tnf-α、il-6、il-1，发挥抗炎作用。牛大力多糖能延长小鼠爬杆时间，增加小鼠游泳耐力，降低血乳酸、尿素氮的含量、提高血中乳酸脱氢酶含量，具有一定的抗疲劳作用。牛大力多糖可显著增加抗体形成细胞数目，促进淋巴细胞转化，提升吞噬细胞的吞噬能力。综上所述，尽管针对牛大力多糖的药理作用研究已有部分报道，但绝大多数文献仅包括体外试验结果，且未见牛大力多糖抗衰老活性的相关研究。目前，针对牛大力多糖提取及分离纯化的研究报道还较少。例如，除了采用传统的水提醇沉法以外，专利公开号cn109134685a的发明专利还公开了一种采用高压均质技术和微滤技术从牛大力中提取小分子量多糖的方法，可一定程度上提高纯度，但多糖得率得不到保证。文献《牛大力多糖酶法提取工艺优化及其抗氧化活性》报道单用纤维素酶酶解提取牛大力多糖成分，文献《双指标优化微波酶法辅助牛大力薯中多糖提取》使用微波辅助果胶酶提取牛大力薯中多糖。这些提取工艺获得的牛大力多糖得率均较低，且纯度还达不到药物或保健品添加剂的要求，因此，探讨一种牛大力多糖得率及纯度均较高的制备方法，对于开发牛大力这一珍贵中草药资源具有非常重要的意义。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种具有抗衰老活性牛大力多糖的制备方法，该方法获得的多糖得率和纯度高，具有较高生物活性，工艺适合于大规模生产。为实现本发明的第一个目的，提供如下的技术方案：一种具有抗衰老活性牛大力多糖的制备方法，包括以下步骤：(1)超声波-复合酶前处理：牛大力粉末与水搅拌均匀后添加复合酶，将混合液超声处理，灭活复合酶，获得酶解液；所述复合酶的组成为纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶，其中，所述纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的添加量依次为所述牛大力粉末质量的0.4～0.8％、0.2～0.6％、0.6～1.0％。(2)超高压处理：对酶解液进行超高压300～500mpa处理，获得牛大力多糖溶液。(3)醇沉，获得牛大力多糖粗品。(4)季铵盐纯化：将牛大力多糖粗品溶解，加入十六烷基三甲基溴化铵，离心收集沉淀，再用氯化钠溶液溶解沉淀，加无水乙醇产生白色沉淀，离心收集沉淀。(5)透析脱盐：用去离子水溶解沉淀得复溶溶液，将溶液进行脱盐处理。(6)干燥：在–60～–20℃条件下干燥24～48h，得高纯度的牛大力多糖。进一步地，所述步骤(1)中加入水的量为牛大力粉末的10～40倍。进一步地，所述步骤(1)中复合酶的ph值为5.0～7.0，酶解温度45～60℃。进一步地，所述步骤(1)中超声处理的超声功率为250～450w，处理时间为0.5～2h。进一步地，所述步骤(2)中超高压处理的时间为5～15min。进一步地，所述醇沉的步骤为：将牛大力多糖溶液浓缩至1/4体积，向浓缩液中加入95％乙醇至终浓度为80％，边加边搅拌，3～6℃静置6～10h后，3000～4000rpm离心10～20min，保留沉淀。进一步地，所述步骤(4)中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为3％，氯化钠溶液的浓度为9.5～10.5％。进一步地，所述步骤(5)中将复溶溶液转入分子量为2～14kda透析袋内进行脱盐处理8～12h。进一步地，所述牛大力粉末的粒径为40～100目。本发明的第二个目的是提供上述的制备方法得到的牛大力多糖。本发明的第三个目的是提供所述牛大力多糖在制备抗衰老、抗氧化、增强免疫功能药物方面的应用。与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：1.本发明首次使用超声波-复合酶法提取牛大力多糖成分，复合酶能破坏细胞壁，有利于多糖溶出，可获得较高的多糖得率，提取条件温和可提高多糖生物活性。此外，中性蛋白酶可水解蛋白质，有利于去除蛋白。2.本发明超声波-复合酶前处理后，再使用超高压提取，可进一步提高牛大力多糖得率。3.使用凝胶层析法纯化多糖，成本高，工作量大，操作繁琐，不适合工业生产，本发明采用季铵盐法分离纯化多糖，相比凝胶层析法，成本低，操作简便，适合大规模生产。4.本发明提取工艺可直接获得得率与纯度较高的牛大力多糖，在抗衰老、抗氧化、增强免疫功能方面有明显效果。5.本发明多糖提取使用超声波-复合酶法与超高压技术，分离纯化采用季铵盐法，建立了快速、高效，低成本的牛大力多糖提取方法，可应用于工业化大规模生产。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。实施例1(1)超声波-复合酶前处理：牛大力干燥块根粉碎，过100目筛，得到牛大力粉末，添加40倍水，搅拌均匀，添加复合酶后，将混合液置于超声场中进行处理，复合酶组成为纤维素酶、木聚糖酶、中性蛋白酶，添加量依次为牛大力粉末质量的0.8％、0.6％、1.0％，ph值为6.5，酶解温度55℃，超声功率为450w，处理时间2h，处理完后灭活复合酶，获得酶解液。(2)超高压处理：对酶解液进行超高压500mpa处理15min，获得牛大力多糖溶液。(3)醇沉：将牛大力多糖溶液浓缩至1/4体积，向浓缩液中加入95％乙醇至终浓度为80％，缓慢加入，边加边搅拌，3℃静置10h后，4000rpm离心10min，保留沉淀，获得牛大力多糖粗品。(4)季铵盐纯化：将牛大力多糖粗品溶于4倍体积蒸馏水中，加入等体积3％十六烷基三甲基溴化铵，34℃下静置6h，4℃离心收集沉淀，再用10.5％氯化钠溶液溶解沉淀，加无水乙醇产生白色沉淀，离心收集沉淀。(5)透析脱盐：用去离子水溶解沉淀得复溶溶液，将溶液转入分子量为2～14kda透析袋内进行脱盐处理12h。(6)冷冻干燥：将截留液在–40℃条件下冷冻干燥48h，获得牛大力多糖，称重，计算多糖得率，采用苯酚-硫酸法测定多糖浓度。本方法所述牛大力多糖得率为5.42％，多糖纯度为92.3％。实施例2(1)超声波-复合酶前处理：牛大力干燥块根粉碎，过80目筛，得到牛大力粉末，添加30倍水，搅拌均匀，添加复合酶后，将混合液置于超声场中进行处理，复合酶组成为纤维素酶、木聚糖酶、中性蛋白酶，添加量依次为牛大力粉末质量的0.4％、0.5％、0.7％，ph值为6.0，酶解温度50℃，超声功率为350w，处理时间1.5h，处理完后灭活复合酶，获得酶解液。(2)超高压处理：对酶解液进行超高压450mpa处理10min，获得牛大力多糖溶液。(3)醇沉：将牛大力多糖溶液浓缩至1/4体积，向浓缩液中加入95％乙醇至终浓度为80％，缓慢加入，边加边搅拌，4℃静置8h后，3500rpm离心15min，保留沉淀，获得牛大力多糖粗品。(4)季铵盐纯化：将牛大力多糖粗品溶于3倍体积蒸馏水中，加入等体积3％十六烷基三甲基溴化铵，35℃下静置6h，4℃离心收集沉淀，再用10％氯化钠溶液溶解沉淀，加无水乙醇产生白色沉淀，离心收集沉淀。(5)透析脱盐：用去离子水溶解沉淀得复溶溶液，将溶液转入分子量为2～14kda透析袋内进行脱盐处理10h。(6)冷冻干燥：将截留液在–60℃条件下冷冻干燥36h，获得牛大力多糖，称重，计算多糖得率，采用苯酚-硫酸法测定多糖浓度。本方法所述牛大力多糖得率为5.25％，多糖纯度为90.4％。实施例3(1)超声波-复合酶前处理：牛大力干燥块根粉碎，过65目筛，得到牛大力粉末，添加20倍水，搅拌均匀，添加复合酶后，将混合液置于超声场中进行处理，复合酶组成为纤维素酶、木聚糖酶、中性蛋白酶，添加量依次为牛大力粉末质量的0.6％、0.4％、0.6％，ph值为5.0，酶解温度60℃，超声功率为300w，处理时间1h，处理完后灭活复合酶，获得酶解液。(2)超高压处理：对酶解液进行超高压400mpa处理10min，获得牛大力多糖溶液。(3)醇沉：将牛大力多糖溶液浓缩至1/4体积，向浓缩液中加入95％乙醇至终浓度为80％，缓慢加入，边加边搅拌，5℃静置8h后，3500rpm离心15min，保留沉淀，获得牛大力多糖粗品。(4)季铵盐纯化：将牛大力多糖粗品溶于3倍体积蒸馏水中，加入等体积3％十六烷基三甲基溴化铵，34℃下静置5h，4℃离心收集沉淀，再用10％氯化钠溶液溶解沉淀，加无水乙醇产生白色沉淀，离心收集沉淀。(5)透析脱盐：用去离子水溶解沉淀得复溶溶液，将溶液转入分子量为2～14kda透析袋内进行脱盐处理8h。(6)冷冻干燥：将截留液在–45℃条件下冷冻干燥24h，获得牛大力多糖，称重，计算多糖得率，采用苯酚-硫酸法测定多糖浓度。本方法所述牛大力多糖得率为5.17％，多糖纯度为88.1％。实施例4(1)超声波-复合酶前处理：牛大力干燥块根粉碎，过40目筛，得到牛大力粉末，添加10倍水，搅拌均匀，添加复合酶后，将混合液置于超声场中进行处理，复合酶组成为纤维素酶、木聚糖酶、中性蛋白酶，添加量依次为牛大力粉末质量的0.5％、0.2％、0.8％，ph值为7.0，酶解温度45℃，超声功率为250w，处理时间0.5h，处理完后灭活复合酶，获得酶解液。(2)超高压处理：对酶解液进行超高压300mpa处理5min，获得牛大力多糖溶液。(3)醇沉：将牛大力多糖溶液浓缩至1/4体积，向浓缩液中加入95％乙醇至终浓度为80％，缓慢加入，边加边搅拌，6℃静置6h后，3000rpm离心20min，保留沉淀，获得牛大力多糖粗品。(4)季铵盐纯化：将牛大力多糖粗品溶于2倍体积蒸馏水中，加入等体积3％十六烷基三甲基溴化铵，36℃下静置4h，4℃离心收集沉淀，再用9.5％氯化钠溶液溶解沉淀，加无水乙醇产生白色沉淀，离心收集沉淀。(5)透析脱盐：用去离子水溶解沉淀得复溶溶液，将溶液转入分子量为2～14kda透析袋内进行脱盐处理10h。(6)冷冻干燥：将截留液在–20℃条件下冷冻干燥24h，获得牛大力多糖，称重，计算多糖得率，采用苯酚-硫酸法测定多糖浓度。本方法所述牛大力多糖得率为5.06％，多糖纯度为91.2％。实施例5选用实施例1制备得到的牛大力多糖，进行以下实验，旨在证明牛大力多糖在抗衰老活性方面的应用。1.研究方法1.1模型制备、分组与给药小鼠60只，按随机数字表法分为6组，每组10只，分别为空白对照组、衰老模型组、阳性对照组及牛大力多糖高、中、低剂量组。牛大力多糖高、中、低剂量组及阳性对照组和衰老模型组分别皮下注射d-半乳糖(d-gal，0.5g/(kg·d))，空白对照组用生理盐水代替d-gal。同时每天开始灌胃给药牛大力多糖分别为200、100、50mg/(kg·d)；阳性对照组用维生素e25mg/(kg·d)，灌胃给药42d；空白对照组与衰老模型组灌等体积生理盐水。1.2学习记忆和抗疲劳能力试验分别通过跳台试验(末次给药后2h)、八臂迷宫试验(末次给药后，禁食12h)分析衰老小鼠的学习记忆能力变化；通过游泳耐力试验检测衰老模型小鼠的抗疲劳能力。跳台试验参照文献《越橘花色苷对d-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的改善作用及机制，山东医药，2017，57(13)：36-38》，迷宫试验和游泳耐力试验参照文献《荨麻多糖对d-半乳糖致衰老模型小鼠的抗衰老作用，中药材，2015，38(12)：2563-2567》进行。1.3氧化应激和免疫功能指标测定末次给药后，禁食不禁水12h，眼眶后静脉丛取血备用，其后脱臼处死并取出肝脏和全脑，分别用0.9％的生理盐水制备10％和5％的组织匀浆备用。肝脏、脑组织匀浆中的超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)活力及丙二醛(mda)水平检测均按照试剂盒说明书中的实验步骤进行。胸腺指数和脾脏指数等于各组织质量(mg)与小鼠体质量(g)的比值，以考察免疫功能情况。1.4果蝇生存试验取30d龄的黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)800只。随机分为对照组和牛大力多糖高、中、低4个实验组，每组雌、雄各100只。空白对照组用普通培养基喂饲，其余3组分别在普通培养基中添加高剂量(0.8％)、中剂量(0.4％)、低剂量(0.2％)牛大力多糖喂饲。每2d记录果蝇的死亡数及存活数，每3d更换一次培养基，直至果蝇全部死亡。实验结束计算每组果蝇平均寿命与平均最高寿命。1.5统计分析用spss20.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差别法，p<0.05表示差异有统计学意义。2.研究结果2.1学习记忆和抗疲劳能力比较与空白对照组比较，衰老模型组跳台潜伏期显著缩短，5min内错误次数明显增多，差异比较均具有统计学意义(p<0.05)，与衰老模型组比较，牛大力多糖各剂量组小鼠跳台潜伏期延长，5min内错误次数明显减少，差异比较均具有统计学意义(p<0.05)，见表1。与空白对照组比较，衰老模型组小鼠迷宫试验错误次数及通过时间显著增加，游泳时间明显缩短，差异比较均具有统计学意义(p<0.05)，牛大力多糖干预后，迷宫试验错误次数及通过时间减少，游泳时间延长，与衰老模型组比较均具有统计学意义(p<0.05)，见表2。表1牛大力多糖对衰老小鼠跳台潜伏期和跳台错误次数的影响(n＝10)组别跳台潜伏期/s错误反应次数/次·5min-1空白对照组144.2±21.51.8±0.7衰老模型组58.3±9.8*7.9±2.6*阳性对照组131.2±17.5#2.8±1.4#多糖高剂量组118.8±18.4#4.6±0.9#多糖中剂量组103.9±14.3#5.8±1.7#多糖低剂量组94.0±24.7#6.5±1.9#注：与空白对照组比较，*p<0.05；与衰老模型组比较，#p<0.05。表2牛大力多糖对衰老小鼠迷宫试验和游泳时间的影响(n＝10)注：与空白对照组比较，*p<0.05；与衰老模型组比较，#p<0.05。2.2脑组织和肝脏组织氧化应激情况比较与空白对照组比较，衰老模型组小鼠脑和肝脏组织中sod、gsh-px水平显著降低(p<0.05)，mda含量明显增多(p<0.05)；与衰老模型组比较，牛大力多糖各剂量组小鼠脑和肝脏组织中sod、gsh-px水平均明显升高，mda含量则明显减少，差异比较均具有统计学意义(p<0.05)，见表3、表4。表3牛大力多糖对衰老小鼠脑组织抗氧化能力的影响(n＝10)组别sod/u·mg-1gsh-px/u·mg-1mda/nmol·mg-1空白对照组217.9±9.398.6±2.43.8±0.3衰老模型组116.8±7.7*56.7±2.6*8.7±0.2*阳性对照组198.0±9.3#86.2±2.7#4.2±0.4#多糖高剂量组205.1±16.1#85.1±1.4#4.7±0.1#多糖中剂量组187.5±9.5#74.9±3.5#5.2±0.1#多糖低剂量组147.3±9.2#69.3±2.7#7.5±0.4#注：与空白对照组比较，*p<0.05；与衰老模型组比较，#p<0.05。表4牛大力多糖对衰老小鼠肝脏组织抗氧化能力的影响(n＝10)组别sod/u·mg-1gsh-px/u·mg-1mda/nmol·mg-1空白对照组184.5±12.0120.8±8.73.6±0.2衰老模型组107.7±5.8*78.0±4.7*9.4±0.5*阳性对照组161.9±8.4#112.3±5.2#4.6±0.4#多糖高剂量组171.2±2.4#104.6±8.5#4.8±0.3#多糖中剂量组163.6±5.9#99.1±5.2#6.3±0.7#多糖低剂量组127.1±4.5#92.4±8.3#8.0±0.9#注：与空白对照组比较，*p<0.05；与衰老模型组比较，#p<0.05。2.3免疫功能比较与空白对照组比较，衰老模型组小鼠胸腺指数和脾脏指数均显著减小(p<0.05)；牛大力多糖高、中剂量干预后，胸腺指数和脾脏指数增大，与衰老模型组比较，差异均具有统计学意义(p<0.05)，阳性对照组小鼠胸腺指数和脾脏指数也显著大于衰老模型组(p<0.05)，见表5。表5牛大力多糖对衰老小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响(n＝10，mg/g)注：与空白对照组比较，*p<0.05；与衰老模型组比较，#p<0.05。2.4果蝇生存情况比较与对照组比较，牛大力多糖可显著延长雄性、雌性果蝇的的平均寿命，差异比较具有统计学意义(p<0.05)；牛大力多糖各剂量组雄性、雌性果蝇的最高寿命也明显大于对照组(p<0.05)，见表6。表6牛大力多糖对果蝇寿命的影响(n＝100)注：与对照组比较，*p<0.05。3.研究结论牛大力多糖可改善d-半乳糖所致衰老小鼠的学习记忆能力、增强抗疲劳能力和免疫功能、及提高衰老小鼠肝、脑组织抗氧化活性，还可延长果蝇生存时间，以上结果表明，牛大力多糖具有显著抗衰老活性。以上所述仅为本发明的部分实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12