基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法与流程

本发明属于核酸分子检测的技术领域，涉及基于枝状dna的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法，属于一种定性的核酸检测方法。

背景技术：

核酸的检测和分析对疾病的诊断和治疗起着非常重要的作用，如何快速精准地检测核酸序列是现代医学亟需解决的问题，也是个性化医疗的发展趋势，现主要检测的目标分为细菌和病毒病原体、癌症标志物、遗传性疾病等[1]。癌症是全球第二大致死病因[2]，很多病人由于未及时发现疾病，而错过了最佳的诊断和治疗时间，因此癌症的早期诊断对于人类健康和安全来说是至关重要的[3]。核酸可以作为一种肿瘤标志物，比如循环肿瘤dna(ctdna)是从肿瘤细胞上脱落下来的游离在外周血部位的单碱基突变dna[4]，携带有肿瘤细胞特异性的遗传信息，相对于正常人来说，它在癌症病人的血清中含量较高，若能在早期癌症患者的体内及时检出ctdna，则会在很大程度上提高癌症治愈的几率。细菌或病毒病原体的侵入会造成人体受到感染，当病原体dna发生核酸突变时，可能会使得病原体具备抗生素耐药性[5]，因此可通过检测病原体dna来判断患者所感染的疾病。当核酸变异发生在基因组编码区时，可能会改变氨基酸序列和蛋白的功能，进而造成人体遗传性疾病的发生，因此对基因核酸的检测可预知遗传性疾病发生的概率。然而对于临床样品来说，核酸的浓度是很低的，比如ctdna的浓度在μg/l和ng/l之间，病原体dna的浓度处于pg/l的级别[6]，因此如何在实际样品中实现高灵敏度、高精度的核酸检测仍然是现存的难题之一。

传统的核酸检测方法主要为基于核酸的直接杂交，包括印迹杂交、斑点杂交、原位杂交和酶联免疫吸附测定等方法[7]，但这些方法大多费时费力，需要利用荧光或同位素进行标记，而且灵敏度普遍较低。随后发展了两种方法，即基因组测序技术和聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)[8]，测序技术可用于大规模多重序列分析，无需提前知道所测的序列，这种方法可以得到人类基因组的数据，个体性的基因组差异促进了个体医疗的发展，但测序方法存在固有的误差率、耗时长、昂贵等缺点，无法做到全民普及；pcr方法可大量增加靶标核酸的拷贝数，具有高灵敏度，但易出现假阳性或假阴性的结果，不能进行多重分析，且需要复杂的操作和精密的仪器，尽管这两种是现临床常用的方法，但其局限性限制了它们的发展。基于此，发展了很多体外扩增的方法来尽量规避这些缺点，同时降低检测限，提高灵敏度和准确性。体外扩增技术通常包括两类，分别是酶辅助的体外扩增技术和无酶参与的体外扩增技术。酶辅助的体外扩增技术包括滚环扩增反应(rollingcircleamplification，rca)[9]、连接酶链式反应(helicase-dependentamplification，hda)[10]、环介导的等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)、基于核酸序列的扩增(nucleicacidsequence-basedamplification，nasba)[11]和酶辅助的靶标循环放大方法(enzyme-assistedtargetrecycling，eatr)[12]等，由于这些反应均需要酶的参与，而酶的活性易受外界储存、运输和处理等条件的影响，影响反应的正常进行，因此酶辅助的扩增技术所需的反应条件比较苛刻，费用高。另外，无酶参与的体外扩增技术包括杂交链式反应(hybridizationchainreaction，hcr)[13]、链置换反应(stranddisplacementreaction，sdr)[14]、催化发卡组装(catalytichairpinassembly，cha)[15]和dna酶介导的反应(dnazyme-mediatedassays)[16]，但这些方法对dna序列的设计要求较高，需要dna二级结构在一定条件下发生精确的动态响应，这些复杂的要求和扩增方法无疑增加了设计和实施的难度。

由于现有的核酸检测方法依然存在很多局限性，因此需开发新的方法实现靶标触发的信号级联放大的核酸检测。

参考文献

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技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种定性的、基于枝状dna的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法。

本发明的技术方案概述如下：

基于枝状dna的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法，包括如下步骤：

(1)制备一种n枝状dna：

设计并合成均带有相同的粘性末端的n条dna单链；分别溶于水中，振荡，得到n份终浓度为100μm的dna单链水溶液；n＝3或4；

第1条dna单链从3'端到5'端，分为1-1段、1-2段和1-3段；1-1段和1-2段之和的dna单链的核苷酸数为28-44个，1-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；

第2条dna单链从3'端到5'端，分为2-1段、2-2段和2-3段；2-1段和2-2段之和的dna单链的核苷酸数为28-44个，2-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；

第n条dna单链从3'端到5'端，分为n-1段、n-2段和n-3段，n-1段和n-2段之和的dna单链的核苷酸数为28-44个；n-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；

第1条dna单链的1-2段核苷酸序列与第2条dna单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；

第2条dna单链的2-2段核苷酸序列与第n条dna单链的n-1段核苷酸序列反向互补配对；

第n条dna单链的n-2段核苷酸序列与第1条dna单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；

第1条dna单链的1-3段核苷酸序列、第2条dna单链的2-3段核苷酸序列、第n条dna单链的n-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的5'端的一半序列均反向互补配对；

取等体积的n份dna单链水溶液，按照n条dna单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mm的nacl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到n枝状dna；

(2)制备一种m枝状dna：

设计并合成均带有相同的粘性末端的、不同于步骤(1)粘性末端的m条dna单链；分别溶于水中，振荡，得到m份终浓度为100μm的dna单链水溶液；m＝3或4；

第1条dna单链从5'端到3'端，分为1-1段、1-2段和1-3段；1-1段和1-2段之和的dna单链的核苷酸数为28-44个，1-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；

第2条dna单链从5'端到3'端，分为2-1段、2-2段和2-3段；2-1段和2-2段之和的dna单链的核苷酸数为28-44个，2-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；

第m条dna单链从5'端到3'端，分为m-1段、m-2段和m-3段，m-1段和m-2段之和的dna单链的核苷酸数为28-44个；m-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；

第1条dna单链的1-2段核苷酸序列与第2条dna单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；

第2条dna单链的2-2段核苷酸序列与第m条dna单链的m-1段核苷酸序列反向互补配对；

第m条dna单链的m-2段核苷酸序列与第1条dna单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；

第1条dna单链的1-3段核苷酸序列、第2条dna单链的2-3段核苷酸序列、第m条dna单链的m-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的3'端的一半序列均反向互补配对；

取等体积的m份dna单链水溶液，按照m条dna单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mm的nacl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到m枝状dna；

(3)将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子通过巯基连接在金基底表面，所述核酸探针分子的核苷酸从5'端到3'端分为p-1段和p-2段，共有核苷酸21-25个；p-1段核苷酸数为10个，均为腺嘌呤核苷酸，p-2段核苷酸数为11-15个，p-2可与待测靶标核酸分子3'端的一半序列互补配对；

(4)在步骤(3)获得的连接有核酸探针分子的金基底加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入一种n枝状dna，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入一种m枝状dna，反应，至生物传感器检测信号稳定；

(5)重复步骤(4)，直至加入一种n枝状dna或一种m枝状dna后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号。

本发明的优点：

本发明的基于枝状dna的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法，操作简便，无需酶的参与，无需分子标记，成本低廉，适用范围广泛，由于dna序列的可编程性使得该检测方法可针对于特定的核酸序列来设计，同时其级联放大的特点使其具有很好的灵敏性和准确度，该检测方法可应用于生物传感器、分子检测等领域。

附图说明

图1为验证合成n枝状dna和m枝状dna的电泳图(n＝4，m＝4)，其中m：marker；1：单链dna(seqidno.1)；2：实施例1中的n枝状dna；实施例1中的m枝状dna。

图2为待测靶标触发的信号级联放大的核酸检测信号图。

具体实施方式

生物传感器以石英晶体微天平为例。

n枝状dna和m枝状dna是两种不同粘性末端的枝状dna。

n枝状dna和m枝状dna的粘性末端是根据待测靶标分子的序列设计的，例如选择肿瘤标记物为待测靶标分子，利用本发明的方法可以检测样本中肿瘤标记物的存在与否。

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

实施例1

(1)制备n枝状dna，包括如下步骤：

设计并合成均带有相同的粘性末端的n条dna单链；分别溶于水中，振荡，得到n份终浓度为100μm的dna单链水溶液；n＝4；

表1.制备n枝状dna的单链序列；n＝4

第1条dna单链从3'端到5'端，分为1-1段、1-2段和1-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；1-1段和1-2段之和的dna单链的核苷酸数为36个，1-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；

第2条dna单链从3'端到5'端，分为2-1段、2-2段和2-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；2-1段和2-2段之和的dna单链的核苷酸数为36个，2-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；

第3条dna单链从3'端到5'端，分为3-1段、3-2段和3-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示，3-1段和3-2段之和的dna单链的核苷酸数为36个；3-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；

第4条dna单链从3'端到5'端，分为4-1段、4-2段和4-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示，4-1段和4-2段之和的dna单链的核苷酸数为36个；4-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；

第1条dna单链的1-2段核苷酸序列与第2条dna单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；

第2条dna单链的2-2段核苷酸序列与第3条dna单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对；

第3条dna单链的3-2段核苷酸序列与第4条dna单链的4-1段核苷酸序列反向互补配对；

第4条dna单链的4-2段核苷酸序列与第1条dna单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；

第1条dna单链的1-3段核苷酸序列、第2条dna单链的2-3段核苷酸序列、第3条dna单链的3-3段核苷酸序列、第4条dna单链的4-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的5'端的一半序列均反向互补配对；

取等体积的n份dna单链水溶液，按照n条dna单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mm的nacl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到n枝状dna；n＝4；

(2)制备m枝状dna，包括如下步骤：

设计并合成均带有相同的粘性末端的m条dna单链；分别溶于水中，振荡，得到m份终浓度为100μm的dna单链水溶液；m＝4；

表2.制备m枝状dna的单链序列，m＝4

第1条dna单链从5'端到3'端，分为1-1段、1-2段和1-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；1-1段和1-2段之和的dna单链的核苷酸数为36个，1-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；

第2条dna单链从5'端到3'端，分为2-1段、2-2段和2-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；2-1段和2-2段之和的dna单链的核苷酸数为36个，2-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；

第3条dna单链从5'端到3'端，分为3-1段、3-2段和3-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；3-1段和3-2段之和的dna单链的核苷酸数为36个；3-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；

第4条dna单链从5'端到3'端，分为4-1段、4-2段和4-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；4-1段和4-2段之和的dna单链的核苷酸数为36个；4-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；

第1条dna单链的1-2段核苷酸序列与第2条dna单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；

第2条dna单链的2-2段核苷酸序列与第3条dna单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对；

第3条dna单链的3-2段核苷酸序列与第4条dna单链的4-1段核苷酸序列反向互补配对；

第4条dna单链的4-2段核苷酸序列与第1条dna单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；

第1条dna单链的1-3段核苷酸序列、第2条dna单链的2-3段核苷酸序列、第3条dna单链的3-3段核苷酸序列、第4条dna单链的4-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的3'端的一半序列均反向互补配对；

取等体积的m份dna单链水溶液，按照m条dna单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mm的nacl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到m枝状dna；m＝4；

n枝状dna和m枝状dna的合成结果见图1；

(3)将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子seqidno.22通过巯基连接在金基底表面，包括如下步骤：

表3.5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子的序列

a.所述的5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子从5'端到3'端分为p-1段和p-2段，分别用单划线和双划线表示，共有核苷酸25个；p-1段核苷酸数为10个，均为腺嘌呤核苷酸；p-2段核苷酸数为15个，可与待测靶标核酸分子3'端的一半序列互补配对；

b.将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子溶于水中，振荡，得到终浓度为100μm的核酸探针分子溶液；将核酸探针分子溶液稀释至0.1μm，并加入终浓度为1mm的三(2-羧乙基)膦，振荡1h；

c.选用石英晶体微天平作为生物传感器，金芯片作为基底，将金基底浸泡在h2o、h2o2和nh3·h2o体积比为5:1:1的溶液中，在75℃水浴锅中处理5min，然后分别用水和乙醇清洗三次，n2吹干；

c.取步骤b处理过的核酸探针分子溶液200μl滴加在金基底表面，37℃条件下静置16h，然后用水和乙醇分别清洗三次，n2吹干；随后将固定有核酸探针分子的金基底浸泡在1mm6-巯基-1-己醇(mch)溶液中1h，然后用水和乙醇分别清洗三次，n2吹干；

(4)

a.选用石英晶体微天平为生物传感器；所述的待测靶标核酸分子seqidno.23的总碱基数为30个，分为两部分，5'端的15个碱基与n枝状dna的粘性末端互补配对，3'端的15个碱基与核酸探针分子、m枝状dna的粘性末端均互补配对；n＝4；m＝4；

b.在步骤(3)获得的连接有核酸探针分子的金基底加入待测靶标核酸分子，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；

c.加入n枝状dna，浓度为0.1μm，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；n＝4；

d.加入待测靶标核酸分子，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；

e.加入m枝状dna，浓度为0.1μm，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；m＝4；

f.重复步骤a-e，直至加入n枝状dna或m枝状dna后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号；n＝4；m＝4。

靶标触发的级联放大的核酸检测信号，见图2。从图2中可知，待测样品中含有靶标核酸分子。

实施例2

(1)制备n枝状dna，包括如下步骤：

设计并合成均带有相同的粘性末端的n条dna单链；分别溶于水中，振荡，得到n份终浓度为100μm的dna单链水溶液；n＝3；

表4.制备n枝状dna的单链序列，n＝3

第9条dna单链从3'端到5'端，分为9-1段、9-2段和9-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；9-1段和9-2段之和的dna单链的核苷酸数为28个，9-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；

第10条dna单链从3'端到5'端，分为10-1段、10-2段和10-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；10-1段和10-2段之和的dna单链的核苷酸数为28个，10-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；

第11条dna单链从3'端到5'端，分为11-1段、11-2段和11-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示，11-1段和11-2段之和的dna单链的核苷酸数为28个；11-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；

第9条dna单链的9-2段核苷酸序列与第10条dna单链的10-1段核苷酸序列反向互补配对；

第10条dna单链的10-2段核苷酸序列与第11条dna单链的11-1段核苷酸序列反向互补配对；

第11条dna单链的11-2段核苷酸序列与第9条dna单链的9-1段核苷酸序列反向互补配对；

第9条dna单链的9-3段核苷酸序列、第10条dna单链的10-3段核苷酸序列、第11条dna单链的11-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的5'端的一半序列均反向互补配对；

取等体积的n份dna单链水溶液，按照n条dna单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mm的nacl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到n枝状dna；n＝3；

(2)制备m枝状dna，包括如下步骤：

设计并合成均带有相同的粘性末端的m条dna单链；分别溶于水中，振荡，得到m份终浓度为100μm的dna单链水溶液；m＝3；

表5.制备m枝状dna的单链序列，m＝3

第12条dna单链从5'端到3'端，分为12-1段、12-2段和12-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；12-1段和12-2段之和的dna单链的核苷酸数为28个，12-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；

第13条dna单链从5'端到3'端，分为13-1段、13-2段和13-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；13-1段和13-2段之和的dna单链的核苷酸数为28个，13-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；

第14条dna单链从5'端到3'端，分为14-1段、14-2段和14-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；14-1段和14-2段之和的dna单链的核苷酸数为28个；14-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；

第12条dna单链的12-2段核苷酸序列与第13条dna单链的13-1段核苷酸序列反向互补配对；

第13条dna单链的13-2段核苷酸序列与第14条dna单链的14-1段核苷酸序列反向互补配对；

第14条dna单链的3-2段核苷酸序列与第12条dna单链的12-1段核苷酸序列反向互补配对；

第12条dna单链的12-3段核苷酸序列、第13条dna单链的13-3段核苷酸序列、第14条dna单链的14-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的3'端的一半序列均反向互补配对；

取等体积的m份dna单链水溶液，按照m条dna单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mm的nacl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到m枝状dna；m＝3；

(3)将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子seqidno.24通过巯基连接在金基底表面，包括如下步骤：

表6.5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子的序列

a.所述的5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子从5'端到3'端分为p-1段和p-2段，分别用单划线和双划线表示，共有核苷酸21个；p-1段核苷酸数为10个，均为腺嘌呤核苷酸；p-2段核苷酸数为11个，可与待测靶标核酸分子3'端的一半序列互补配对；

b.将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子溶于水中，振荡，得到终浓度为100μm的核酸探针分子溶液；将核酸探针分子溶液稀释至0.1μm，并加入终浓度为1mm的三(2-羧乙基)膦，振荡1h；

c.选用石英晶体微天平作为生物传感器，金芯片作为基底，将金基底浸泡在h2o、h2o2和nh3·h2o体积比为5:1:1的溶液中，在75℃水浴锅中处理5min，然后分别用水和乙醇清洗三次，n2吹干；

c.取步骤b处理过的核酸探针分子溶液200μl滴加在金基底表面，37℃条件下静置16h，然后用水和乙醇分别清洗三次，n2吹干；随后将固定有核酸探针分子的金基底浸泡在1mm6-巯基-1-己醇(mch)溶液中1h，然后用水和乙醇分别清洗三次，n2吹干；

(4)

a.选用石英晶体微天平为生物传感器；所述的待测靶标核酸分子seqidno.25的总碱

基数为22个，分为两部分，5'端的11个碱基与n枝状dna的粘性末端互补配对，3'

端的11个碱基与核酸探针分子、m枝状dna的粘性末端均互补配对；n＝3；m＝3；

b.在步骤(3)获得的连接有核酸探针分子的金基底加入待测靶标核酸分子，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；

c.加入n枝状dna，浓度为0.1μm，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；n＝3；

d.加入待测靶标核酸分子，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；

e.加入m枝状dna，浓度为0.1μm，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；m＝3；

f.重复步骤a-e，直至加入n枝状dna或m枝状dna后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号；n＝3；m＝3。

实施例3

(1)制备n枝状dna，包括如下步骤：

设计并合成均带有相同的粘性末端的n条dna单链；分别溶于水中，振荡，得到n份终浓度为100μm的dna单链水溶液；n＝4；

表7.制备n枝状dna的单链序列；n＝4

第15条dna单链从3'端到5'端，分为1-1段、1-2段和1-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；15-1段和15-2段之和的dna单链的核苷酸数为44个，1-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；

第16条dna单链从3'端到5'端，分为16-1段、16-2段和16-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；16-1段和16-2段之和的dna单链的核苷酸数为44个，16-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；

第17条dna单链从3'端到5'端，分为17-1段、17-2段和17-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示，17-1段和17-2段之和的dna单链的核苷酸数为44个；17-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；

第18条dna单链从3'端到5'端，分为18-1段、18-2段和18-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示，18-1段和18-2段之和的dna单链的核苷酸数为44个；18-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；

第15条dna单链的15-2段核苷酸序列与第16条dna单链的16-1段核苷酸序列反向互补配对；

第16条dna单链的16-2段核苷酸序列与第17条dna单链的17-1段核苷酸序列反向互补配对；

第17条dna单链的17-2段核苷酸序列与第18条dna单链的18-1段核苷酸序列反向互补配对；

第18条dna单链的18-2段核苷酸序列与第15条dna单链的15-1段核苷酸序列反向互补配对；

第15条dna单链的15-3段核苷酸序列、第16条dna单链的16-3段核苷酸序列、第17条dna单链的17-3段核苷酸序列、第18条dna单链的18-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的5'端的一半序列均反向互补配对；

取等体积的n份dna单链水溶液，按照n条dna单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mm的nacl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到n枝状dna；n＝4；

(2)制备m枝状dna，包括如下步骤：

设计并合成均带有相同的粘性末端的m条dna单链；分别溶于水中，振荡，得到m份终浓度为100μm的dna单链水溶液；m＝3；

表8.制备m枝状dna的单链序列，m＝3

第19条dna单链从5'端到3'端，分为19-1段、19-2段和19-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；19-1段和19-2段之和的dna单链的核苷酸数为44个，1-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；

第20条dna单链从5'端到3'端，分为20-1段、20-2段和20-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；20-1段和20-2段之和的dna单链的核苷酸数为44个，20-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；

第21条dna单链从5'端到3'端，分为21-1段、21-2段和21-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；21-1段和21-2段之和的dna单链的核苷酸数为44个；21-3段的dna单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；

第19条dna单链的19-2段核苷酸序列与第20条dna单链的20-1段核苷酸序列反向互补配对；

第20条dna单链的20-2段核苷酸序列与第21条dna单链的21-1段核苷酸序列反向互补配对；

第21条dna单链的21-2段核苷酸序列与第19条dna单链的19-1段核苷酸序列反向互补配对；

第19条dna单链的19-3段核苷酸序列、第20条dna单链的20-3段核苷酸序列、第21条dna单链的21-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的3'端的一半序列均反向互补配对；

取等体积的m份dna单链水溶液，按照m条dna单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mm的nacl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到m枝状dna；m＝3；

(3)将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子seqidno.26通过巯基连接在金基底表面，包括如下步骤：

表9.5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子的序列

a.所述的5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子从5'端到3'端分为p-1段和p-2段，分别用单划线和双划线表示，共有核苷酸25个；p-1段核苷酸数为10个，均为腺嘌呤核苷酸；p-2段核苷酸数为15个，可与待测靶标核酸分子3'端的一半序列互补配对；

b.将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子溶于水中，振荡，得到终浓度为100μm的核酸探针分子溶液；将核酸探针分子溶液稀释至0.1μm，并加入终浓度为1mm的三(2-羧乙基)膦，振荡1h；

c.选用石英晶体微天平作为生物传感器，金芯片作为基底，将金基底浸泡在h2o、h2o2和nh3·h2o体积比为5:1:1的溶液中，在75℃水浴锅中处理5min，然后分别用水和乙醇清洗三次，n2吹干；

c.取步骤b处理过的核酸探针分子溶液200μl滴加在金基底表面，37℃条件下静置16h，然后用水和乙醇分别清洗三次，n2吹干；随后将固定有核酸探针分子的金基底浸泡在1mm6-巯基-1-己醇(mch)溶液中1h，然后用水和乙醇分别清洗三次，n2吹干；

(4)

a.选用石英晶体微天平为生物传感器；所述的待测靶标核酸分子seqidno.27的总碱基数为30个，分为两部分，5'端的15个碱基与n枝状dna的粘性末端互补配对，3'端的15个碱基与核酸探针分子、m枝状dna的粘性末端均互补配对；n＝4；m＝3；

b.在步骤(3)获得的连接有核酸探针分子的金基底加入待测靶标核酸分子，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；

c.加入n枝状dna，浓度为0.1μm，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；n＝4；

d.加入待测靶标核酸分子，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；

e.加入m枝状dna，浓度为0.1μm，通入体积为2ml，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；m＝3；

f.重复步骤a-e，直至加入n枝状dna或m枝状dna后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号；n＝4；m＝3。

序列表

<110>天津大学

<120>基于枝状dna的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法

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