一种盐芽孢杆菌SYW-1及在棉花黄萎病防治中的应用的制作方法

本发明涉及微生物菌种及其应用的
技术领域：
，具体的涉及一种盐芽孢杆菌syw-1及在棉花黄萎病生物防治中的应用的
技术领域：
。
背景技术：
：植物根系及周围存在的大量细菌，其中一些是能够促进植物生长的根际细菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，pgpr)。某些根际细菌能够通过竞争、产生抗生素、合成铁载体以及诱导植物系统抗性等方式抑制植物土传病害，促进植物的生长。近年来，已有利用根际细菌对棉花立枯病进行生物防治的相关报道。对棉花苗期病害具有良好生防作用的木霉、粘帚霉等。棉花根际微生物是棉花微生态系统中重要组成部分，其中棉花根际微生物指接近棉花根部，在物理、化学和生物学特性上不同于周围土体，与棉花关系紧密的土壤微生物。李家恕和王祖农通过分离发现根际细菌距离根越近数量越大，生育期呈先增后降，开花期最高。张亚平采用分离培养方法研究了北疆棉花根际微生物，筛选到棉花立枯病拮抗菌。张凤华等研究指出水分处理对棉田土壤根际微生物数量的影响比施肥要明显，花铃期适水中肥处理数量最多，而吐絮期丰水高肥达最大。顾美英等通过分离发现新疆棉花黄萎病株根际土壤微生物总量大于健株根际土壤微生物总量，特别是真菌数量大幅度增加。沈其荣等采用微生物有机肥调控根际土壤微生物群落结构，改变了土壤微生物的区系，细菌的数量大大增加，真菌数量明显减少。从棉花根际分离筛选的拮抗菌适宜于在棉花根际定殖，拮抗菌的应用效果更加稳定。因此，利用棉花根际分离筛选适合棉花黄萎病防治的微生物菌种，开发高效的微生物菌剂，解决棉花植物-环境间的微生态平衡，对于防治棉花病害，提高棉花产量具有重要的实用价值。技术实现要素：针对现有技术未见有关棉花根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)用于棉花黄萎病生物防治研究报道的技术现状，本发明提供一种新菌种根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008及其在棉花黄萎病生物防治中的应用。本发明通过在棉花根际土壤中分离出一批根际拮抗菌菌株，从中筛选出一株盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008菌株，利用分离出的菌种生长温度宽、易培养等特点，利用syw-1菌悬液浸泡棉花种子，可促进棉花种子出芽，syw-1菌悬液施用于多年连作重病棉花地，可有效地防治棉花生育期的棉花黄萎病的作用，将棉花黄萎病对棉花生产的不利影响降低到最低限度，有利于提高棉花的产量和品质，具有显著和稳定的技术效果，作为棉花黄萎病生物防治中具有广泛而适用的价值。本发明采用的主要技术方案：本发明具体提供一种新菌种根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008。通过从棉花根际土壤筛选、分离出一株编号为syw-1的根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)菌种，将根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1通过现在常见的菌种鉴定手段获悉是一株新菌种，分离出的菌种具有生长温度宽、易培养等特点，该菌株菌悬液浸泡棉花种子，可促进棉花种子出芽，施用于多年连作重病棉花地，可有效地防治棉花生育期的棉花黄萎病的作用，将棉花黄萎病对棉花生产的不利影响降低到最低限度，有利于提高棉花的产量和品质，具有显著和稳定的技术效果，体现了筛选该菌种具有鲜明的应用价值导向。具体的，通过对棉花根际土壤进行微生物菌种的培养、分离，筛选一批优良菌种，并从中分离筛选出一株编号为syw-1的根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)菌种，经微生物学分类与鉴定属于根际盐芽孢杆菌属，该菌株最适生长条件为：生长温度范围在8-42℃，最适生长温度是30℃；ph生长范围4.9-11.2，培养基为胰蛋白胨大豆琼脂培养基。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》第九版和《常用细菌系统鉴定手册》对编号为syw-1菌株进行形态学、生理生化试验，确定syw-1菌株为根际盐芽孢杆菌属中的成员，但是具有与常见的根际盐芽孢杆菌属成员菌种不同的特点，具有一些新菌种的特性。进一步，本发明通过对上述编号为syw-1菌种进行基因测序，序列参见附后提供的seqidno:1所示，所得序列经常见网站进行比对分析，并构建系统发育树，经比对分析发现，菌株syw-1的16srdna序列与标准模式bacillushalotoleransstraindsm8802t同源性最高，序列相似度为96.01％，具有新菌种的鲜明技术特征，菌株syw-1与bacillushalotoleransstraindsm8802t的亲缘关系最近，利用本领域常见采用的mega5.0软件通过neighbor-joining方法建立系统进化树，结果经比对分析发现，菌株syw-1与bacillushalotoleransatcc25096t处于最小分支，是其近似种，置信值为89，表明该菌种作为新菌种的支持率较高，在进化树中体现较好的稳定性，经过系列菌种分子水平鉴定可知该菌株syw-1确定为bacillushalotolerans新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1。具体的，该菌株syw-1已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2017年12月04日，菌种保藏号为cgmccno.15008。经微生物学鉴定暂命名为根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1。新菌种根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长良好，在30℃下培养48h后，形成可见的菌落，该菌株菌落2-4mm且平滑，呈半透明、乳白色、表面湿润、边缘整齐，生长较快，革兰氏阳性菌；该菌株最适生长条件为：生长温度范围在8-42℃，最适生长温度是30℃；ph生长范围4.9-11.2。进一步，本发明提供根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008在促进棉花种子出芽中的应用，具有促进棉花种子萌发，防治棉花生育期的各类棉花黄萎病的作用，具有显著和稳定的技术效果，具有广泛的应用价值。通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本
发明内容，可以达到以下有益效果：(1)本发明提供的根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008是一种典型的新菌种，该菌株最适生长条件为：生长温度范围在8-42℃，最适生长温度是30℃；ph生长范围4.9-11.2，利用分离出的菌种生长温度宽、易培养等特点，该菌株菌悬液能促进棉花种子出芽，且能有效防治棉花生育期的棉花黄萎病，定其为根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1。(2)将本发明分离筛选的根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008，在以玉米浆和酵母膏为主要原料的培养基中，发酵条件为：温度32℃，转速200rpm，通气1:0.3，培养24h获得菌悬液；用1×109cfu/ml菌悬液浸种棉花种子的出芽、出苗齐、叶色浓有促进作用，多年连作重病棉花地田间施用syw-1菌悬液5000ml，浓度7×108cfu/ml，防效为69.9％，可有效地防治棉花生育期的棉花黄萎病的作用，将棉花黄萎病对棉花生产的不利影响降低到最低限度，有利于提高棉花的产量和品质，具有显著和稳定的技术效果，作为棉花黄萎病生物防治中具有广泛而适用的价值。附图说明图1所示为根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008的菌落形态图。图2所示为根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008的系统发育树图。图3所示为根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008的生长曲线图。具体实施方式下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉0ml；活化培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph7.3±0.1；种子培养基：蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2。本发明中涉及到的主要试剂：甘油，牛肉膏，酵母膏，氯化钠，氢氧化钠，葡萄糖，硫酸镁，硫酸锌，硫酸亚铁，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，琼脂，蔗糖，次氯酸钠，pcr预混液(takarabiotechnology)，其余试剂均为分析纯。主要仪器与试剂：tg328a型分析天平，ab204-n型电子天平，phs-3tc(0.01级)精密数显酸度计，101-2型干燥箱，uv-2100分光光度计，hyg-ⅱ回转式恒温调速摇瓶柜，ls-b50l立式压力蒸汽灭菌器，超净工作台，3k15台式冷冻离心机。实施例一：根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1的分离、筛选及鉴定(一)分离、筛选：从棉花根际土壤中通过梯度稀释法分离出多株细菌，采用平板对峙法，根据有无抑菌圈判断其是否具有拮抗作用，初步筛选出对棉花黄萎病病原具有一定拮抗能力的菌株。对具有拮抗作用的菌株进行进一步试验，筛选出拮抗能力较强的菌株以备后续试验。通过在棉花根际土壤中分离、筛选和培养，获得一批根际微生物的菌株，从中筛选出一株编号为syw-1的菌株，经微生物学分类与鉴定，属于芽孢杆菌属的bacillushalotolerans。(二)分类、鉴定：1、生理生化测定(1)通过生长条件研究结果显示根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1为一种革兰氏阳菌。在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长良好，在30℃下培养48h后，形成可见的菌落，该菌株菌落2-4mm且平滑，呈半透明、乳白色、表面湿润、边缘整齐，生长较快，参见附图1所示；菌体生长温度范围在8-42℃，最适生长温度是30℃；ph生长范围4.9-11.2。(2)主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、甘露糖、木糖、半乳糖、果胶糖；使用的无机组分包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水合硫酸亚铁。(3)通过对syw-1菌株进行形态学测定，并对菌株syw-1的形状、大小、生理生化反应进行检测，本发明的syw-1菌株生物学特性参见表1所示。表1：菌株syw-1的生理生化特性项目结果项目结果葡萄糖+半乳糖苷酶+果胶糖+淀粉酶+木糖+柠檬酸盐利用+山梨醇+二羟基丙酮酸产生+蜜二糖–赖氨酸脱羧酶+乳糖–精氨酸水解酶+棉子糖+鸟氨酸脱羧酶+海藻糖+45℃+注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。通过上根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1的菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定：菌体形态观察、菌株培养特征观察、需氧性和运动性测定、生长温度测定、耐盐试验、柠檬酸盐利用试验、触酶试验、糖类发酵试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解，均参照《常用细菌系统鉴定手册》的方法进行。2、根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-116srdna的序列测定与分析：(1)挑取少量syw-1菌的单菌落，放入盛有25μl无菌水的ep管中，100℃煮沸8-10min，后迅速放入冰水混合物中5min。离心10000r/min、5min，4℃保存，用时取上清。16srrna基因序列测定及其系统进化树的构建：按常规方法提取细菌菌株的总dna，(2)采用特异性引物进行16srdna的pcr扩增，引物设计如下:pa：5′-agagtttgatcctggctcag-3′；pb：5′-aaggaggtgatccagccgca-3′。pcr反应体系总体积50μl，10×pcr缓冲液5μl，引物各20pmol，模板dna(1000ng/μl)1μl，taqtm0.5u，dntp8μl。pcr扩增条件：首先在94℃预变性2min，然后98℃10s、55℃30s、72℃1.5min，循环30次，最后在72℃延伸10min。pcr产物的纯化：取8μl的pcr产物，在1％琼脂糖凝胶中电泳，用takarapcrfragmentrecoverykit从胶中回收目的片段，溶于20μl的高纯水中。对pcr产物用pa(+)和pb(-)作测序引物，测定16srdna序列，序列参见附后提供的seqidno:1所示。(3)将测序得到的16srdna序列与genbank数据库中的核苷酸序列进行blast分析，从中获取相近的16srdna序列，用clustalx软件和mega5.2neighbor-joining法构建系统进化树，参见附图2所示，经比对分析发现，菌株syw-1的16srdna序列与标准模式bacillushalotoleransstraindsm8802t同源性最高，序列相似度为96.01％，利用本领域常见采用的mega5.0软件通过neighbor-joining方法建立系统进化树，结果经比对分析发现，菌株syw-1与bacillushalotoleransatcc25096t处于最小分支，是其近似种，置信值为89，表明该菌种作为新菌种的可能性较高，在进化树中体现较好的稳定性，经过系列菌种分子水平鉴定可将该菌株syw-1确定为根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1。综合16srdna序列分析、系统发育分析、微生物学特性分析结果，表明本发明提供的根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1为根际盐芽孢杆菌属的一株细菌新种，将其暂命名为根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1。菌株已于2017年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.15008。实施例二：棉花根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1的生长因子根据上述实施例提供的棉花根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008特性确定其具体的生长因子，将菌株syw-1接种培养，测定温度、ph、盐、抗生素对菌株syw-1生长的影响，结果参见表2所示。表2：温度、ph、盐、抗生素对菌株syw-1生长的影响生长曲线及培养条件，将根际syw-1菌按以下方式进行培养，培养条件为：tsa固体培养基，ph7.0，34℃条件下培养28h，其生长曲线，参见附图3所示。通过以上结果得出syw-1作为种子的最佳培养时间为20h，最适生长ph为7.0，大量产芽孢时间为24h。通过上述对于根际syw-1菌的生长因子及生理理化实验数据可知，根际syw-1菌与常见的芽孢杆菌(bacillushalotolerans)完全不同，与常见的根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)相比具有新菌种的属性和特点。实施例三：棉花根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1的发酵工艺研究将syw-1菌株接于活化培养基上，于30℃恒温培养2d，按一定的接种量，接入装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃、180rmp条件下，摇瓶培养1d，再按照2％的接种量接种于装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃、180rmp条件下，摇瓶培养3d；通过碳、氮源、ph值等的优化来实现发酵获得syw-1菌悬液目的。od值测定：取发酵液0.5ml，加2.5mhcl1ml，加13.5ml去离子水，混匀，用分光光度计，在600nm波长下测定。(1)培养基ph的确定按ph值6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，在200r/min，温度30℃条件下发酵，得出最适生长ph值为7.0。(2)碳源优化在种子培养基的基础上继续优化碳源，碳源分别为葡萄糖、蔗糖、玉米浆，其他成分为kh2po40.1％，k2hpo40.1％，mgso4·7h2o0.05％，ph7.0；试验均为3次重复。培养3d后测定菌悬液的od值，试验结果参见表3所示。表3：发酵培养基不同碳源对syw-1菌株的影响(3)氮源的优化在种子培养基的基础上继续优化氮源，氮源分别为蛋白胨，酵母膏，(nh4)2so4，其他成分为kh2po40.1％，k2hpo40.1％，mgso4·7h2o0.05％，ph7.0。试验均为3次重复，通过不同氮源od值检测，得出菌株的最适氮源，试验结果参见表4所示。表4：发酵培养基不同氮源对syw-1菌株的影响根据表3、表4的试验结果，确定最佳碳源为玉米浆，最佳氮源为酵母膏。实施例四：棉花根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1发酵罐发酵试验在以玉米浆和酵母膏为主要原料的培养基中，发酵条件为：温度32℃，转速200rpm，通气1:0.3，时间在24h。其结果见如下表5：表5：根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-110l发酵试验结果菌株发酵时间稀释倍数od(600nm)syw-148h502.825发酵结束后平板计数结果表明，syw-1菌发酵液全部存活，经冻干处理，菌体存活率高于90％。实施例五：棉花根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1对棉花种子发芽的作用(1)浸种催芽试验用109cfu/ml菌悬液浸种3min，置于垫有湿润滤纸的培养皿内，28℃培养3d、5d、7d，检测出芽率，清水浸种为对照。(2)拮抗菌对棉花种子发芽的作用试验结果参见表6所示，经syw-1菌悬液处理3d、5d、7d的棉花种子出芽率均明显高于对照组。表明一定浓度的syw-1菌悬液对棉花种子的出芽有促进作用，经syw-1菌悬液浸种的棉花种子出苗早、出苗齐、叶色浓。表6：syw-1菌悬液浸种对棉花出苗的影响注：大写字母分别表示p＝0.01时的显着差异。实施例六：棉花根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1的田间生防试验(1)田间防效测定2016-2018年，连续3年在新疆博乐进行田间防效测定。选取多年连作重病棉花地，棉花播种后用拮抗菌液随水滴灌13h，出苗后分苗期、蕾期2次处理，每亩施用根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1菌悬液5000ml，浓度7×108cfu/ml，以清水处理作为对照，每个处理3次重复，每个重复面积为6667m2，对照分散于各个处理组之间。8月下旬调查1次，记录各级发病株数，计算病情指数。8月下旬开始进行调查，按通用的5级标准记载病情，即：0级：健株，无病状；1级：1～2片子叶发病；2级：1片真叶发病；3级：2片以上真叶发病或脱落仅剩心叶；4级：植株生长点或全株枯死。以接种后第25d调查的结果计算病情指数并划分品种的抗、感类型。(2)田间防效试验测定表7结果表明，根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1能降低棉花黄萎病的病情指数，防效为69.9％。syw-1菌株对棉花主要棉花黄萎病有很好的防治效果。菌株syw-1与对照存在显著性差异。表7：syw-1菌悬液对棉花主要棉花黄萎病的田间试验防效通过上述系列实施例提供的根际盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)syw-1cgmccno.15008是一种典型的新菌种，该菌株最适生长条件为：8-42℃，最适生长温度是30℃；ph生长范围4.9-11.2，利用分离出的菌种生长温度宽、易培养等特点，利用syw-1菌悬液浸泡棉花种子，可促进棉花种子出芽，syw-1菌悬液施用于多年连作重病棉花地，可有效地防治棉花生育期的棉花黄萎病的作用，将棉花黄萎病对棉花生产的不利影响降低到最低限度，有利于提高棉花的产量和品质，具有显著和稳定的技术效果，作为棉花黄萎病生物防治中具有广泛而适用的价值。上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。序列表<110>新疆农业科学院微生物应用研究所（中国新疆-亚美尼亚生物工程研究开发中心）<120>一种盐芽孢杆菌syw-1及在棉花黄萎病防治中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1091<212>dna<213>盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)<400>1aggagcgtgggctgcctaatcatgcaagtccgagcggacagatgggagcttgctccctga60tgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactc120cgggaaaccggggctaataccggatgcttgtttgaaccgcatggatcaaacataaaaggt180ggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaatgg240ctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgag300acacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtc360tgacggatcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagg420gaagaacaagtaccgttccaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacg480gctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattatt540gggcgtaaagggctcgcaggcggttccttaattctgatgtgaaagcccccggctcaaccg600gggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtg660tagcggtgaaatgcctagagatgtggaggaacaccagtggcgaatgcgactctctggtct720gtaactgacgctgaggagcgaaagcgtgaggagcgaacacgattatataccctggtagtc780cacgcccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttactgctgcagct840cacgcattacacactccgcctggggagtacggtcgcgagattgaaactcaaaggaattga900cgggggcccgcacatgcggtggagtatgtggtttaaattcgaagcaacgcgaagaacctt960accaggtcctggacatcctctgacattcgtagatgatggacgtcccctttcaggggcaga1020ctgatcatggggacgcatgttggttcgttcagctacgtggacttcttagttgacctatcc1080attcagattgc1091当前第1页12