本发明属于生物技术领域，特别涉及一株耐酸能力强、耐受胃、肠液能力强、抑制肠道主要致病菌的发酵乳杆菌及其冻干粉的制备方法。
背景技术：
国家卫生部于2010年将发酵乳杆菌列入《可用于食品的菌种名单》，2016年将发酵乳杆菌cect5716列入《可用于婴幼儿食品的菌种名单》。发酵乳杆菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性，兼性厌氧。菌体形态为杆状，直径0.5～0.9μm，长度的差异比较大，多数为单个存在，也有成对排列。能在低ph值的人体胃液和高胆汁的肠道环境中存活，能够调节宿主体内微生物菌群的平衡，改善宿主体内系统环境，对宿主健康具有促进作用。
发酵乳杆菌为异型发酵乳酸杆菌，益生特性主要有：降解胆固醇、抑制肠道有害菌群、增强机体免疫力、抗氧化等。
发酵乳杆菌经培养、发酵、分离、冷冻干燥，加工制成发酵乳杆菌冻干粉，可应用在食品、饲料及药品等领域。发酵乳杆菌的耐受胃肠液能力是保证其能够通过人体胃肠液并发挥益生功能的关键因素。因此，获得耐受胃液能力强、耐肠液能力强、抑制肠道主要致病菌的发酵乳杆菌是非常重要的。
技术实现要素：
针对现有技术所述的发酵乳杆菌活菌数不高、耐胃肠液能力较差的问题，本发明的目的是提供一株活菌数高、耐酸能力强、耐胃肠液能力强、具有抑菌特性的发酵乳杆菌，以及该菌冻干粉的制备方法，在食品、保健食品或药物组合物中的用途。
本发明所述的发酵乳杆菌，所述菌株命名为发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005，该菌株已于2018年08月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccno.16259。
上述的发酵乳杆菌的冻干粉，制备方法包括如下步骤：
1)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的发酵乳杆菌菌种冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，15～30s，至冻存管内液体全部融化；
2)菌种活化：按照10％接种量，将复苏好的菌种直接接种至装有基础培养基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养17小时；
3)菌种扩培：按照5％接种量，将菌种活化结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养8小时；
4)一级发酵：按照5％接种量，将菌种扩培结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，发酵开始时，设定自动流加食品级naoh以调控菌液ph值至5.20-5.40，发酵进行9h开始，每0.5h监控菌液od值，当连续两次od值之差＜0.2时，停止发酵；
5)二级发酵：按照6％接种量，将一级发酵结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始时通过流加食品级naoh溶液至ph为5.20-5.40，发酵进行6h开始，每0.5h监控菌液od值，当连续两次od值之差＜0.2时，发酵结束；
6)发酵液离心：二级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，转速为12000-14000rpm，结束进料后，空转5min；
7)离心结束后，收集菌泥；
8)冻干保护剂添加，按照菌泥：保护剂＝1:1-3的体积比，向菌泥中添加冻干保护剂，并搅拌、混合均匀；
9)冷冻干燥：将混合均匀的菌粉，分装到冻干机托盘中，然后将冻干机托盘放入冻干机内进行菌粉的冻干，真空度0～1.0pa，冷冻干燥机温度设置共13个区段，第1区段预冻2h，结束温度为-40℃；第2区段7h，结束温度为-25℃；第3区段3h，结束温度为-20℃；第4区段3h，结束温度为-15℃；第5区段6h，结束温度为-10℃；第6区段6h，结束温度为-5℃；第7区段4h，结束温度为0℃；第8区段4h，结束温度为5℃；第9区段4h，结束温度为10℃；第10区段4h，结束温度为15℃；第11区段4h，结束温度为20℃；第12区段4h，结束温度为25℃；第13区段3.5h，结束温度为30℃；
10)冻干粉收集；
11)粉碎、包装：按质量要求进行粉碎后包装。
上述的发酵乳杆菌冻干粉，所述的基础培养基按照以下配方制成：葡萄糖25.0-35.0g/l、酵母蛋白胨20.0-25.0g/l、酵母浸出物3.0-8.0g/l、柠檬酸2.0-6.0g/l、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，用1mol/l食品级naoh溶液调培养基ph值至6.90-7.10，115℃下灭菌30min。
上述的发酵乳杆菌冻干粉，所述的基础培养基按照以下配方制成：葡萄糖30.0g/l、酵母蛋白胨22.0g/l、酵母浸出物6.0g/l、柠檬酸4.0g/l、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，用1mol/l食品级naoh溶液调培养基ph值至7.00，115℃下灭菌30min。
上述的发酵乳杆菌冻干粉，所述的优化培养基按照以下配方制成：酵母蛋白胨25.0-35.0g/l、葡萄糖20.0-30.0g/l、酵母浸出物5.0-15.0g/l、乳糖15.0-25.0g/l、结晶果糖2.0-8.0g/l、柠檬酸2.0-6.0g/l、l-苹果酸5.0g/l、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/l食品级naoh溶液调培养基ph值至6.00-6.50。
上述的发酵乳杆菌冻干粉，所述的优化培养基按照以下配方制成：酵母蛋白胨30.0g/l、葡萄糖25.0g/l、酵母浸出物10.0g/l、乳糖20.0g/l、结晶果糖5.0g/l、柠檬酸4.0g/l、l-苹果酸5.0g/l、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/l食品级naoh溶液调培养基ph值至6.20。
上述的发酵乳杆菌冻干粉，所述的冻干保护剂配方为：海藻糖10-15％；甘油0.02-1.20％；谷氨酸钠0.5-1.0％；vc钠0.05-0.20％。
上述的发酵乳杆菌冻干粉，所述的冻干保护剂配方为：海藻糖12％；甘油1.0％；谷氨酸钠1.0％；vc钠0.1％。
上述的发酵乳杆菌冻干粉在制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌食品、药物中的应用。
本发明所述的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005分离自顺产健康2月龄的男婴粪便中，是一株耐消化道逆环境能力强的发酵乳杆菌，具有发酵乳杆菌的典型特征，革兰氏阳性，兼性厌氧，无芽孢，菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，中间有凸起，边缘整齐，直径约2-4mm；细胞呈短杆状，直径长度比约为1：2～1：4，单个或成对排列。其理化特征是：接触酶阴性，氧化酶阴性，上述发酵乳杆菌cgmccno.16259的细胞形态和理化实验结果详见表1。
表1发酵乳杆菌cgmccno.16259的细胞形态和理化实验结果
上述发酵乳杆菌cgmccno.16259生长温度为35～38℃，最适生长温度为35℃。
上述发酵乳杆菌cgmccno.16259在mrs改良培养基中35℃静置培养17小时，ph值降至4.15，检测活菌数为5.8×109cfu/ml。
通过在美国生物工程信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)查阅国际相关的基因库，将本发明的发酵乳杆菌cgmccno.16259的16srdna序列与genbank提交菌株序列相似性比较，鉴定菌株hcs08-005为发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)，比较结果见表2。
表2发酵乳杆菌cgmccno.16259的16srdna序列与genbank提交菌株序列相似性比较
上述发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005具有以下优点：
1.本发明的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005分离筛选自健康顺产2月龄男婴粪便中，确保其来源的安全性，而且更利于定植在婴幼儿的肠道中。
2.本发明的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005具有较强的耐酸、耐胃、肠液的能力，可通过胃肠道的逆环境有效定植于肠道内，发挥其功能特性。
3.益生菌对致病菌的抑制特性主要表现在抑制致病菌的生长，防止细菌性腹泻，发挥益生菌功能，提高宿主免疫力，维持肠道微生态平衡。本发明的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005具有较好的抑菌特性。
4.本发明的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005采用优选的冻干保护剂，制成冻干粉后，活菌数可达5千亿cfu/g以上，存活率高，定植能力强，可应用于食品、饲料、药品等领域。
本发明所述的耐酸能力强、耐受胃、肠液能力强、具有较好的抑菌特性的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005，其已于2018年08月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为cgmccno.16259。
具体实施方式
实施例1发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005cgmccno.16259菌株的筛选及生理生化特性
男婴粪便5g加到5ml缓冲蛋白胨液中，以10倍稀释法稀释至10-3，每个稀释度分别划线到mrs/tja改良培养基平板上。37℃培养24～48h(平板放入自封袋中)；挑取具有目的菌株典型特征(观察形态、大小、色泽、及其透明度等)、菌落较大、活性较强的单菌落，于mrs/tja改良培养基进行划线纯化培养，如此反复2～3次，直到划线平皿中菌落特征一致；每个纯化后的平皿挑取2个以上单菌落进行涂片、革兰氏染色，并且在显微镜下观察其颜色、菌体形状是否一致，从而确定该平皿中菌落是否为纯培养物。如镜下观察结果一致，则将得到的纯培养物(平皿菌落)作为疑似菌株，将对应平皿编号，待鉴定；如镜下观察结果不一致，则继续进行上述操作。最终得到的纯培养物进行糖发酵鉴定，api鉴定，16srdna全序列测序鉴定。最终筛选得到一株发酵乳杆菌，命名为发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005，已于2018年08月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccno.16259。其序列如seqidno:1所示。
上述发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005菌株为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐，表面光滑细密，白色或乳白色；菌体呈短杆状，成堆或成链排列；其生理生化特征是：其生理生化特征是：接触酶阴性，氧化酶阴性，可利用d-核糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-果糖、d-甘露糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖。
实施例2发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)hcs08-005cgmccno.16259制成食品添加剂发酵乳杆菌冻干粉
包括如下步骤：
1、菌种发酵
1.1)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的发酵乳杆菌菌种冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，15～30s，至冻存管内液体全部融化；
1.2)菌种活化：按照10％接种量，将复苏好的菌种直接接种至装有10ml基础培养基的50ml三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养17小时；
1.3)菌种扩培：按照5％接种量，将菌种活化结束的菌悬液接种至装有100ml基础培养基的250ml三角瓶中，按此接种4瓶，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养8小时；
1.4)一级发酵：按照5％接种量，将菌种扩培结束的菌悬液接种至装有140l优化培养基的200l发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，发酵开始时，设定自动流加食品级naoh以调控菌液ph值在5.30，同时校正电极，保证系统显示ph与实测值相差小于0.05；发酵进行9h开始，每0.5h监控菌液od值，当连续两次od值之差＜0.2时，则停止发酵；
1.5)二级发酵：按照6％接种量，将一级发酵结束的菌悬液接种至装有140l优化培养基的200l发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始时通过流加食品级naoh溶液来维持恒定ph为5.30，同时校正电极，保证系统显示ph与实测值相差小于0.05；发酵进行6h开始，每0.5h监控菌液od值，当连续两次od值之差＜0.2时，发酵结束；
基础培养基组成及制备：葡萄糖30.0g/l、酵母蛋白胨22.0g/l、酵母浸出物6.0g/l、柠檬酸4.0g/l、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，用1mol/l食品级naoh溶液调培养基ph值至7.00，115℃下灭菌30min；
优化培养基组成及制备：酵母蛋白胨30.0g/l、葡萄糖25.0g/l、酵母浸出物10.0g/l、乳糖20.0g/l、结晶果糖5.0g/l、柠檬酸4.0g/l、l-苹果酸5.0g/l、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/l食品级naoh溶液调培养基ph值至6.20；
1.6)发酵液离心：二级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，转速为13000rpm，结束进料后，空转5min，离心结束，收集菌泥。
注：1.1)—1.6)操作均需在10万级净化车间内进行。
2、冻干保护剂的优化
2.1)根据发酵乳杆菌自身特性，本发明设计了如下特定原料和配比含量的冻干保护剂。其中脱脂乳能稳定细胞膜结构防止细胞受到损伤，复水的过程中也可以保护膜结构免受冲击；海藻糖可以降低干燥细胞的相变温度，当磷脂干燥脱水时，海藻糖或蔗糖在失水部位以氢键和磷脂的极性端相连，防止状态的转变和复水时的渗漏，从而提高细胞的存活率；甘油既能透过细胞壁又可透过细胞膜，在溶液中易结合水分子，通过水合作用使溶液的粘性增加，弱化了水的结晶过程，从而保护细胞；谷氨酸钠与水的密切作用使干粉保留了适量的水分，满足了菌体维持生命的最低需求，与vc钠(抗坏血酸钠)能够同时抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成，以防止对细胞膜造成不可逆转的破坏。
冻干保护剂方案由以下质量份的原料组成，保护剂方案组份见表3。
表3保护剂优化方案组份
按照上述保护剂方案组份称取各原料，溶解余量纯化水中，115℃条件下灭菌30分钟，室温冷却后将制得的冻干保护剂冷藏于-4℃冰箱内备用；
按照菌泥：保护剂＝1:2的体积比，向菌泥中添加冻干保护剂，并搅拌、混合均匀，以1.1l/盘装载量分装到冻干机托盘，然后将冻干机托盘放入冻干机内进行菌粉的冻干，粉碎后测定活菌数，计算存活率，优化保护剂配方。
存活率＝冻干后活菌数/冻干前活菌数×100％
表4冻干保护剂方案组份优化结果
根据表4结果，采用方案5作为冻干保护剂，发酵乳杆菌hcs08-005冻干粉的活菌数和存活率最高，故方案5为优选冻干保护剂，其组份为：海藻糖12％；甘油1.0％；谷氨酸钠1.0％；vc钠0.1％。发酵乳杆菌hcs08-005在冻干过程中产酸速率快，其代谢产物与脱脂乳相互作用，导致泥混保护剂状态过于粘稠，直至凝结，造成菌粉活菌数低，故在保护剂配方中去除脱脂乳。
2.2)不同菌泥与保护剂比例发酵乳杆菌hcs08-005活菌数
根据上述优化保护剂方案配制冻干保护剂，按表5中菌泥与保护剂的比例进行冻干，测定活菌数。进一步确定菌泥与保护剂的最佳比例为1:2，可确保提高每克菌粉活菌数。
表5不同菌泥与保护剂比例发酵乳杆菌hcs08-005活菌数
注：2.1)—2.2)操作均需在10万级净化车间内进行。
3、冷冻干燥
按上述优化保护剂方案配制6l冻干保护剂：称取海藻糖720.0g，谷氨酸钠60.0g，甘油60.0g，抗坏血酸钠6.0g，溶解于5154g纯化水中，115℃条件下灭菌30分钟，室温冷却后将制得的冻干保护剂冷藏于-4℃冰箱内备用；
3.1)冷冻干燥：收集菌泥2.93l，按照菌泥：冻干保护剂＝1:2的体积比，添加冻干保护剂，并搅拌、混合均匀，以1.1l/盘装载量分装到冻干机托盘，然后将冻干机托盘放入冻干机内进行菌粉的冻干，冷冻干燥机温度设置见表6，真空度0～1.0pa，持续冻干54.5小时；
表6冷冻干燥机温度设置表
3.2)环境温度25℃以下，湿度小于35％收集冻干粉，检测活菌数为6.40×1011cfu/ml；
3.3)按质量要求进行粉碎后包装。
注：3.1)—3.3)操作均需在10万级净化车间内进行。
实施例3筛选的发酵乳杆菌hcs08-005耐消化道逆环境实验
益生菌耐消化道的逆环境是其能够在肠道存活、生长并发挥功效的先决条件之一。
1、耐酸试验
将传代三次的菌液按照10％的接种量分别接种于空白对照培养基、ph2.0和ph3.0的基础mrs培养基中。37℃静置培养，于17h取样，用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000μl进行混菌计数操作，每个稀释度2次重复，37℃静置培养36-48h后计数。
耐酸试验数据指标：
测得空白对照的活菌数用n0表示，其他ph条件下测得的活菌数用n′表示，其耐酸性活菌数对数比率计算公式如下：
受试菌株耐酸性试验存活率(％)＝lgcfun′/lgcfun0×100％；
表7hcs08-005耐酸试验数据表
由表7可知，hcs08-005菌株在ph3.0的条件下经过17h后，活菌对数比率达87.2％；ph2.0条件下处理17h活菌对数比率达50.1％，这个存活率可保证其通过胃酸的抑制作用仍保持较高活性，从而发挥其益生作用。
2、耐胆盐试验
将传代三次的菌液按照10％的接种量分别接种于未含有牛胆盐(空白对照)、含有0.1％、0.2％和0.3％牛胆盐浓度的mrs液体培养基，37℃静置培养，于17h取样，测定活菌数。
耐胆盐试验数据指标：
测得空白对照的活菌数用n0表示，其他胆盐浓度条件下测得的活菌数用n′表示，其耐胆盐活菌数对数比率计算公式如下：
受试菌株耐胆盐试验存活率(％)＝lgcfun′/lgcfun0×100％；
表8hcs08-005耐胆盐试验数据表
由表8可知，虽然hcs08-005菌株随胆盐浓度的升高，活菌数逐渐下降，但是在0.3％胆盐浓度处理条件下，活菌对数比率仍然可保持在27.4％。
3、模拟胃液试验
将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10ml离心(5000×g，10min，5℃)获得菌泥，用pbs缓冲液冲洗3次，获得的菌泥重悬于10ml模拟胃液中，37℃条件下消化3h，分别于0h、3h取样测活菌数。
活化三代后的受试菌株在第三代培养液中的活菌数用n表示，经在模拟胃液培养基中消化3h后计数测得的活菌数用n″表示，受试菌株模拟胃液试验存活率计算公式如下：
受试菌株模拟胃液试验存活率(％)＝lgcfun″/lgcfun×100％；
表9hcs08-005模拟胃液试验数据表
由表9可知，hcs08-005菌株在模拟胃液中的存活能力较强，经3h处理，存活率可达到85.4％，其在胃内停留较长时间仍保持较高活性。
4、模拟肠液试验
将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10ml离心(5000×g，10min，5℃)获得菌泥，用pbs缓冲液冲洗3次，获得的菌泥重悬于10ml的人工肠液中，37℃条件下培养，于0h、2h、4h分别取样测活菌数。
活化三代后的受试菌株在第三代培养液中的活菌数用n表示，经在模拟肠液培养液中培养2h、4h后计数测得的活菌数用n″表示，受试菌株模拟肠液试验存活率计算公式如下：
受试菌株模拟肠液试验存活率(％)＝lgcfun″/lgcfun×100％；
表10hcs08-005模拟肠液试验数据表
由表10可知，hcs08-005菌株在模拟肠液中的存活能力强，随处理时间延长，活菌数基本没有下降，存活率高达约100％。
综上，说明该菌株具有较强的耐酸耐胆盐能力，且能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性。
实施例4菌株抑菌功能特性实验
指示菌株准备：取实验菌株冻存管在37℃水浴锅中使其迅速溶化，用微量移液器取100微升菌液加入10ml液体培养基中，大肠杆菌/金黄色葡萄球菌/鼠伤寒沙门氏菌/志贺氏菌37℃恒温过夜培养。
制备固体培养基，将培养至对数期的致病菌稀释至菌液浓度为105cfu/ml，取菌悬液100μl均匀涂布于固体培养基上，用镊子将无菌牛津杯竖于涂布有菌液的平皿中，每个牛津杯中加入200μl受试样品。将平皿置于适宜温度的恒温培养箱中，培养适当时间后观察拍照，并用游标卡尺计量抑菌圈直径。
实验结果见表11。表11中采用牛津杯法，牛津杯内直径6mm，外直径8mm；使用受试菌株发酵液上清，分别进行3倍、5倍浓缩以及直接取原上清进行试验。
表11抑菌谱记录表
通过试验结果可以得出，hcs08-005对胃肠道中主要致病菌有明显抑菌作用。
<110>汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司
<120>一种发酵乳杆菌及其冻干粉的制备方法
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<213>发酵乳杆菌（lactobacillusfermentum）hcs08-005
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