一种巴贝斯虫未定种鉴别检测的方法及试剂盒与流程

本发明涉及一种交叉引物恒温扩增结合免疫层析技术检测和鉴别检测巴贝斯虫未定种的方法与试剂盒，确切讲本发明涉及一种巴贝斯虫未定种病检测试剂盒及非疾病诊断方法。

背景技术：

羊的巴贝斯虫病(ovisbabesiosis)是由隶属于顶复门、巴贝斯虫科、巴贝斯属的原虫感染绵羊、山羊引起的一种以发热、黄疸、血红蛋白尿等为特征的血液原虫病，其传播媒介为蜱，严重感染时会引起动物死亡(uilenberg,2006)。到目前为止全世界报道的引起羊巴贝斯虫病的病原有绵羊巴贝斯虫(babesiaovis)莫氏巴贝斯虫(babesiamotasi)、粗糙巴贝斯虫(babesiacrassa)、叶状巴贝斯虫(babesiafoliata)和泰氏巴贝斯虫(babesiataylori)，其中致病力依次减弱。流行病学调查、病学生物学特征研究表明，在我国流行的巴贝斯虫有两个种，即莫氏巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种新疆株(guanetal.,2002,2009；liuetal.,2007；niuetal.,2009)。羊的巴贝斯虫病在我国流行范围广，危害严重，对我国养羊业的健康持续发展造成了巨大的威胁。关贵全等和王锦明等分别利用以莫氏巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种裂殖子可溶性抗原建立的间接elisa方法，对我国22个省份羊巴贝斯虫病的流行状况调查显示，莫氏巴贝斯虫的平均阳性率为43.5％，羊巴贝斯虫未定种为31.66％，该病在全国范围内均有流行(guanetal,2012；wangetal,2013)。

目前用于羊巴贝斯虫感染检测的方法有经典的血涂片染色法，该方法在染虫率很低的情况下难以检出病原，漏检率高，而且以形态学为主要特征的虫种鉴定且对操作人员的技能要求较高。于是寄生虫学家基于分子生物学开发了一系列的巴贝斯虫鉴别检测方法，有实时荧光定量pcr、反向线性印迹、多重pcr等，这些方法均具有灵敏度高、特异性强的特点，但是实时荧光定量pcr和多重pcr需要昂贵的仪器，多重pcr还需要对扩增产物进行凝胶电泳分析，对操作人员的技能要求高；反向线性印迹也需要对待检样品进行预扩增，操作繁琐、耗时长，而且不适合进行批量样品的检测，检测通量低。而且上述方法不能满足现场快速检测的应用。因此，亟待开发一种快速、高灵敏度和特异性的可用于临床现场检测的可靠方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种不依赖于昂贵仪器，操作简便快速科用于巴贝斯虫未定种鉴别检测的试剂盒及其检测方法，适用于基层临床检测的广泛使用。

本发明的一种巴贝斯虫未定种检测试剂盒中至少包括有一条序列为seqidno.3的交叉引物、序列为seqidno.1和seqidno.2的置换引物bxj-5a和bxj-4s、一对分别用fitc和生物素标记的探针seqidno.4和seqidno.5。

优选地，本发明的检测巴贝斯虫未定种试剂盒中还包括有免疫层析试纸和层析缓冲液，其中的免疫层析试纸条和层析缓冲液均购自杭州尤思达生物技术公司。

更优选地，本发明的检测巴贝斯虫未定种试剂盒中还有：10×isothermalamplificationbuffer、100mmmgso4、2.5mmdntpmix，bstdna聚合酶，isothermalamplificationbuffer，100mmmgso4，dntp，bstdna聚合酶，扩增增强剂甜菜碱。

用本发明的任一检测巴贝斯虫未定种试剂盒进行检测的方法包括以下步骤：

(1)提取待检样品基因组dna；

(2)以提取的基因组dna为模板，利用所述引物和探针建立的交叉引物恒温扩增反应体系和扩增条件进行扩增，扩增的反应条件为：63℃，70min；

(3)将扩增产物滴加至免疫层析试纸条，随后将试纸条置于含有层析缓冲液的容器中，静置1-2min后，根据如质控线和检测线显色情况确定受试样品是否感染巴贝斯虫未定种。具体判定为：当质控线和检测线均显色，则结果为阳性；若只有质控线处显色，则结果判定为阴性。

交叉引物扩增是一种新型的恒温扩增诊断检测方法，一种具有链置换活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)及多条引物，在恒温条件下可实现目标区域高效、快速的扩增。结合免疫层析试纸条，扩增产物的检测以肉眼可见的方式进行，整个检测过程只需要维持在特定的温度既可完成检测，所以特别适合有大量样品实验室场所和非实验室临床快速检测使用。

棒状体颈部蛋白2(rhoptryneckprotein2，ron2)是由棒状体分泌的跨膜蛋白，与微线体分泌的顶膜抗原l(apicalmembraneantigen1，amal)共同作用形成运动结合体(movingjunction，mj)(alexanderdletal.,2005；aikawaetal.,1978。因此，目前认为这些蛋白分子具有作为诊断标识、药物靶点和疫苗候选抗原研制顶复门寄生虫所引起疫病的防控技术的潜力(igonetetal.,2007；beghettoetal.,2005)。本发明以ron2为靶基因，建立了用于巴贝斯虫未定种鉴别检测的交叉引物恒温扩增试剂盒。

本发明公布了一种交叉引物恒温扩增结合免疫层析技术用于巴贝斯虫未定种的检测方法和试剂盒，与现有的方法相比具有下列优点：

(1)本发明操作简便、快速：整个检测过程在70分钟内全部完成，对操作人员技能要求低，只需要具备普通pcr操作的人员均可进行本操作。

(2)灵敏度高：本发明所建立的方法可以检测1pg的莫氏巴贝斯虫基因组dna，相当于染虫率为0.001％时然可以检测到阳性样品。

(3)本发明特异性高：交叉引物扩增中两条标记探针bxj-2a、bxj-3a和交叉引物bxj-2a1s识别巴贝斯虫未定种特异序列，保证了本方法的高度特异性。

(4)使用范围广：交叉引物扩增不需要昂贵的荧光定量pcr仪或pcr仪，只要有提供恒温的装置，如水浴锅、干烤箱等均可进行本检测，适用于基层临床样品的检测和流行病学调查。

(5)检测结果已读：结果经试纸条显色后，以肉眼可见的方式来读取，不需要进行专门的技术培训就可完成。

附图说明

图1.巴贝斯虫未定种交叉引物最佳反应温度的筛选。1-6号试纸条反应温度分别为53℃、56℃、58℃、60℃、63℃、65℃。

图2.莫氏巴贝斯虫交叉引物扩增最佳反应时间的筛选。1-5号试纸条反应时间分别为40min、50min、60min、70min、80min，6为阴性对照。

图3.巴贝斯虫未定种交叉引物特异性检测。1为阴性对照，2为莫氏巴贝斯虫天祝株，3为莫氏巴贝斯虫宁县株，4为莫氏巴贝斯虫河北株，5为巴贝斯虫未定种新疆株，6为莫氏巴贝斯未定种敦煌株，7为吕氏泰勒虫，8为尤氏泰勒虫。

图4.巴贝斯虫未定种交叉引物扩增灵敏度检测。1模板浓度为1ng/μl，2为100pg/μl，3为10pg/μl，4为1pg/μl，5为100fg/μl.

具体实施方式

实施例1：山羊或绵羊血液样品中莫氏巴贝斯虫的检测

1.血液基因组dna提取

用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行血液dna的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.引物设计

根据genbank公布的莫氏巴贝斯虫(临潭株、天祝株、宁县株和河北株)巴贝斯虫未定种(新疆株和敦煌株)ron2基因序列，经序列比对分析后，在种内保守，种间变异的序列设计交叉扩增引物，扩增长度为150bp。

置换引物bxj-5a：5'-aaagttgaaactcccacacc-3'

置换引物bxj-4s：5'-cgatgctctgctccaaggta-3'

交叉引物bxj-2a1s：5'-

ttgatataccggaggccgatccggttatcaacatttgtggcgac-3'

探针bxj-2a：5'-fitc-ttgatataccggaggccgatcc-3'

探针bxj-3a：5'-bio-tcttacggaatcacctttgcaa-3'

靶基因经过交叉引物恒温扩增，最终形成两端带有fitc和生物素标记的核苷酸片段，滴加于试纸条上后，胶体金标记的fitc鼠单抗与核酸片段形成复合物，当扩散到检测线时，复合物被生物素配体捕获；未被生物素标记的核酸复合物质控线上被羊抗鼠抗体捕获，在质控线处显色。

3.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管分别在53℃-65℃进行反应70min。选择最佳反应温度后，进行反应时间的优化，即在选择的最优反应温度下反应40min、50min、60min、70min，80min；同时设立阴性对照。

4.扩增产物试纸条检测

取上述反应产物5-10μl，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置1-2min，读取检测结果。

5.检测结果判定

当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

当质控线不显色，则检测结果无效。

实验结果结果表明(图1)，反应温度对扩增结果的影响不大，考虑到bst聚合酶活性最佳温度，扩增反应温度选择63℃；反应时间选择70min(图2)。

实施例2：交叉引物扩增检测的特异性检测

1.血液基因组dna提取

取-20℃保存的莫氏巴贝斯虫临潭株阳性、莫氏巴贝斯虫河北株阳性、莫氏巴贝斯虫宁县株阳性、巴贝斯虫未定种新疆株阳性、巴贝斯虫未定种敦煌株阳性、吕氏泰勒虫阳性、尤氏泰勒虫阳性、梨形虫阴性的绵羊血液200μl用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管分别在63℃进行反应60min。

3.扩增产物试纸条检测

取上述反应产物5-10μl，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置1-2min，读取检测结果。

4.检测结果判定

当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

当质控线不显色，则检测结果无效。

实验结果见图3，结果表明，本发明所使用的扩增引物组和检测探针对巴贝斯虫未定种具有良好的特异性，与感染羊的其它梨形虫没有发生交叉反应。

实施例3：交叉引物扩增的灵敏度试验

1.巴贝斯虫未定种裂殖子dna提取

取-80℃保存的巴贝斯虫未定种裂殖子100μl用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.基因组dna梯度稀释样品的制备

提取的巴贝斯虫裂殖子基因组dna样品用微量核酸测定仪进行测定(nanodrop2000，thermoscientific,usa)。浓度为50ng/μl，利用超纯水将基因组dna样品进行梯度稀释，依次为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl。

3.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管分别在63℃进行反应70min。

4.扩增产物分析

取上述反应产物5-10μl，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置1-2min，读取实验结果。

当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

当质控线不显色，则检测结果无效。

实验结果见图4，结果表明，本发明所使用的扩增引物组和检测探针对莫氏巴贝斯虫具有高的灵敏度，可以检测含虫体dna浓度1pg/μl的样品，相当于染虫率为0.001％的50μl红细胞。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种巴贝斯虫未定种鉴别检测的方法及试剂盒

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(置换引物bxj-5a)

<400>1

aaagttgaaactcccacacc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(置换引物bxj-4s)

<400>2

cgatgctctgctccaaggta20

<210>3

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(交叉引物bxj-2a1s)

<400>3

ttgatataccggaggccgatccggttatcaacatttgtggcgac44

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(探针bxj-2a)

<400>4

ttgatataccggaggccgatcc22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(探针bxj-3a)

<400>5

tcttacggaatcacctttgcaa22