一种邓肯氏巴贝斯虫鉴别检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及一种邓肯氏巴贝斯虫病原检测试剂盒与检测方法，确切讲本发明涉及一种由邓肯氏巴贝斯虫引起的巴贝斯虫病检测试剂盒及非疾病诊断方法。

背景技术：

巴贝斯虫病(babesiosis)是由媒介蜱传播的血液原虫病，由隶属于顶复门、巴贝斯虫科、巴贝斯属的原虫感染人或动物引起的一种血液原虫病，该病广泛流行于热带、亚热带和温带，给养殖业造成了的巨大的经济损失，为人类健康带来了巨大的威胁(loboetal.2013；vannierandkrause2012)。巴贝斯虫病最早在1888年发现于罗马尼亚，病原为牛巴贝斯虫(babesv,1888)。两年后，德克萨斯牛红细胞中也发现类似的虫体，被命名为双芽巴贝斯虫。迄今为止，全世界共报道的巴贝斯虫有100多种，其中流行范围较广的人兽共患的巴贝斯虫病病原有三种，包括分歧巴贝斯虫(babesiadivergens)、田鼠巴贝斯虫(babesiamicroti)、邓肯氏巴贝斯虫(babesiaduncani)(levine,1988；jiaetal.,2018,kimetal.,2007；saito-itoetal.,2004)。

随着旅游业的快速发展、国际贸易的频繁进行、动物跨省交易，新发和复发传染病呈上升趋势。其中巴贝斯虫病也逐渐被人们所关注，由于其发病人数的增加，尤其是对免疫功能不全的人群，可能会引起死亡。邓肯氏巴贝斯虫是一种致病力较强的病原，目前该病原的检测方法有经典的血涂片染色法，该方法在染虫率很低的情况下难以检出病原，容易出现漏检的情况，而且以形态学为主要特征的虫种鉴定对操作人员的技能要求较高。基于聚合酶链式反应建立的分子生物学方法有以18s为靶基因的pcr结合基因测序法进行巴贝斯虫的检测方法，也可以检测邓肯氏巴贝斯虫的感染，但是不具有种的特异性，这种方法耗时长(约3-5天)，不能满足临床的快速检测要求。目前，邓氏巴贝斯虫特异性的检测方法还没有相关的报道，因此，亟待开发一种快速、灵敏度高和特异性好的可用于临床快速检测的方法。

技术实现要素：

本发明提供一种可克服现有技术不足的邓肯氏巴贝斯虫鉴别检测试剂盒，同时提供邓肯氏巴贝斯虫鉴别检测方法。

本发明的邓肯氏巴贝斯虫检测试剂盒中包括有序列为seqidno.1和seqidno.2的两条扩增引物，一条5′-端标记、3′-端标记hbq1的序列为seqidno.3的探针引物。

优选地，本发明的邓肯氏巴贝斯虫检测试剂盒中还有鉴别检测试剂mastermix。

为方便使用，本发明的邓肯氏巴贝斯虫检测试剂盒中还包括用于荧光定量检测的标准阳性质粒、标准阴性对照和所需的常规试剂。

本发明的邓肯氏巴贝斯虫检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)提取待检样品基因组dna；(2)以提取的基因组dna为模板，利用所述引物和探针建立的扩增反应体系和扩增条件进行扩增，所述扩增的反应条件为：预变性95℃2min一个循环；95℃5s，55℃30s，40个循环；(3)以扩增产物形成ct曲线，根据待检样品的ct值数值判定是否为邓肯氏巴贝斯虫阳性。

本发明的非疾病检测目的的邓肯氏巴贝斯虫检测方法是：提取待检测样品的基因组dna，再将所得到的待检dna用试剂盒中的扩增引物进行扩增，根据待检样品的ct值判定检测结果(ct值大于35，则为阴性；ct值小于35，则为阳性)。

本发明是一种用taqman实时荧光定量pcr技术于邓肯氏巴贝斯虫的检测方法和试剂盒。

taqman实时荧光定量pcr是一种pcr扩增时引入一条荧光探针，探针的两端分别标记一个荧光报告基团和荧光淬灭基团。探针完整时报告基团发出的荧光信号别淬灭基团吸收，探针结合在靶基因上，pcr扩增时taq酶具有5-3外切酶活性将探针降解，使报告基团和淬灭基团分离，使荧光检测系统可以接收到荧光信号。每扩增一条dna分子，就有荧光信号的形成，实现了pcr扩增与荧光信号的同步积累。实现对靶基因高效、快速的检测，广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等的病原检测中，适合大量样品的临床检测和流行病学调查。

与现有的检测方法相比具有下列优点：

(1)本发明检测速度快：整个检测过程在90分钟内全部完成，对操作人员技能要求低，具有分子生物学操作技能的工作人员均可顺利完成本操作。不需要对扩增产物进行后续处理，如琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定、基因测序等，减少了扩增子的污染风险。

(2)本发明特异性高：标记探针bwa-p特异性结合邓肯氏巴贝斯虫特异序列，保证了本方法的高度特异性，与其它感染动物(牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫、环形泰勒虫、东方泰勒虫、中华泰勒虫、莫氏巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫)或人(分歧巴贝斯虫、田鼠巴贝斯虫)的14中梨形虫均没有交叉反应。

(3)使用范围广：具有荧光定量pcr仪的实验室均可以利用本试剂盒进行邓肯氏巴贝斯虫的检测，一次可以检测96个样品，适用于大量临床样品的检测和流行病学调查。

附图说明

图1.邓肯氏巴贝斯虫荧光定量pcr引物、探针特异性检测。其中：1为染重率为5％的邓肯氏巴贝斯虫血液基因组，2为莫氏巴贝斯虫天祝株、莫氏巴贝斯虫宁县株，莫氏巴贝斯虫河北株、莫氏巴贝斯虫临潭株、巴贝斯虫未定种新疆株、巴贝斯未定种敦煌株、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、环形泰勒虫、东方泰勒虫、中华泰勒虫、分歧巴贝斯虫(18srrna重组质粒)、田鼠巴贝斯虫(18srrna重组质粒)。

图2.引物、探针最佳浓度筛选。

图3.邓肯氏巴贝斯虫荧光定量pcr灵敏度检测。

图4.临床样品检测。

具体实施方式

本发明的具体方案包括以下内容：

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物序列合成由上海生物工程股份有限公司完成。

(1)引物及探针：

上游引物bwa-f：5'-gcagttaaaaagctcgta-3'

下游引物bwa-r：5'-aaacactctaattttctc-3'

探针bwa-p：5'-fam-ctctggcggtggttctcc-hbq1-3'

(2)提取待检样品全血基因组dna

取待检全血200μl，利用血液基因组dna提取试剂盒提取基因组dna(试剂盒购自qiagen公司，货号51306)，操作方法参照说明书进行。

(3)扩增反应体系

(4)扩增反应条件：优选地，所述荧光定量pcr扩增反应条件为95℃预变性2min；95℃变性5s，退火及延伸55℃30s，40个循环。

(5)检测结果判定

阳性对照ct值应小于35，阴性对照ct值应大于35；

当待检样品ct值小于35，则判定为邓肯氏巴贝斯虫阳性；

当待检样品ct值大于35，则为阴性

实施例1：血液样品中邓肯氏巴贝斯虫的检测

1.血液基因组dna提取

用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行血液dna的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.引物设计

根据genbank公布的邓肯氏巴贝斯虫18srrna基因为靶序列，经序列比对分析后，在变异区设计扩增引物和探针：

上游引物bwa-f：5'-gcagttaaaaagctcgta-3'

下游引物bwa-r：5'-aaacactctaattttctc-3'

探针bwa-p：5'-fam-ctctggcggtggttctcc-hbq1-3'

3.taqman荧光定量pcr扩增

反应体系：

将上述反应管置于荧光定量pcr仪中，反应程序如下：taq酶激活与预变性95℃2min；变性95℃5s，55℃30s，40个循环；55℃采集荧光信号。

4.检测结果判定

阳性对照ct值应小于35，阴性对照ct值应大于35；

当待检样品ct值小于35，则判定为邓肯氏巴贝斯虫阳性；

当待检样品ct值大于35，则为阴性。

实施例2：taqman荧光定量pcr引物和探针的特异性

1.血液基因组dna提取

感染莫氏巴贝斯虫天祝株、莫氏巴贝斯虫宁县株，莫氏巴贝斯虫河北株、莫氏巴贝斯虫临潭株、巴贝斯虫未定种新疆株、巴贝斯未定种敦煌株、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、环形泰勒虫、东方泰勒虫和中华泰勒虫的抗凝血有兰州兽医研究所蜱与蜱传播研究室提供，分歧巴贝斯虫(18srrna重组质粒)、田鼠巴贝斯虫(18srrna重组质粒)由上海生工生物公司合成。取血液200μl用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管置于荧光定量pcr仪中，反应程序如下：taq酶激活与预变性95℃2min；变性95℃5s，55℃30s，40个循环；55℃采集荧光信号。

3.检测结果判定

阳性对照ct值应小于35，阴性对照ct值应大于35；

当待检样品ct值小于35，则判定为邓肯氏巴贝斯虫阳性；

当待检样品ct值大于35，则为阴性。

实验结果见图1，结果表明，本发明所使用的扩增引物和检测探针具有良好的特异性，与感染动物和人的其它梨形虫没有发生交叉反应。

实施例3：taqman荧光定量pcr引物和探针浓度的筛选

1.邓肯氏巴贝斯虫基因组dna提取

邓肯氏巴贝斯虫株(atccpra-302)腹腔注射黄金地鼠，8天后血涂片镜检染虫率为10％，麻醉后心脏采集抗凝血，取血液200μl用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.荧光定量pcr扩增

反应体系：

引物浓度依次为0.2、0.4、0.6、0.8μl，探针浓度为0.2、0.4、0.6、0.6μl进行最佳引物浓度和探针浓度的筛选。

将上述反应管置于荧光定量pcr仪中，反应程序如下：taq酶激活与预变性95℃2min；变性95℃5s，55℃30s，40个循环；55℃采集荧光信号。

3.结果判定

以扩增曲线接近s型，ct值最小的引物和探针浓度为荧光定量pcr的最佳引物和探针浓度。

实验结果见图2，结果表明，本发明所使用的引物和检测探针的最佳浓度均为0.3μm.

实施例3：taqman引物扩增的灵敏度试验

1.邓肯氏巴贝斯虫dna提取

取邓肯氏巴贝斯虫感染的黄金地鼠血液200μl用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.18srrna重组质粒的制备

(1)以提取的邓肯氏巴贝斯虫基因组为模板进行18srrna基因的扩增

扩增引物：piro-f140：5’-ccatggataaccgtgctaattg-3’

piro-r1380：5’-catctaagggcatcacagacc-3’

采用50μl的pcr反应体系，反应条件为94℃预变性3min，然后94℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环，72℃延伸5min。取5μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的pcr产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(zymo)进行纯化回收，将回收的dna片段与pmd19-simple载体进行连接，反应体系如下：

配制完成后置于16℃进行连接过夜。

(3)pmd19-simple连接产物的转化以及pcr鉴定

(a)-80℃的超低温冰箱中取出dh5α感受态细胞，置于冰上融化。

(b)取连接产物10μl加入100μl的dh5α感受态细胞中，冰浴30分钟。

(c)42℃热激90s，置冰上2min。

(d)加入不含抗生素的lb液体培养基1ml，37℃150转，培养90min。

(e)取100μl涂布于氨苄抗性的lb平皿上，37℃倒置培养过夜。

(f)从平板上挑取单克隆菌落于500μl氨苄抗性的lb液体培养基的1.5mlep管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时。

(g)取1μl作为模板进行菌液pcr鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到5ml的lb液体培养基中进行扩摇。

(4)鉴定为阳性的克隆提取质粒，使用nanodrop2000/2000c(thermoscientific，america)超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μl，以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，系列稀释为终浓度为1.0×10⁷-1.0×10¹拷贝/μl，以便进行敏感性测试。

3.灵敏度测试

将上述稀释好的标准质粒为模板，以建立的taqman荧光定量pcr反应条件进行最小检测限度的实验。

反应体系：

将上述反应管置于荧光定量pcr仪中，反应程序如下：taq酶激活与预变性95℃2min；变性95℃5s，55℃30s，40个循环；55℃采集荧光信号。

3.检测结果判定

以ct值应小于35的最低质粒浓度为该试剂盒的检测下限。

实验结果见图3，结果表明，本发明所使用的扩增引物和检测探针的检测灵敏度为10个拷贝每个反应，即该试剂盒可以检测每微升浓度大于10个拷贝的样品。

实例4：taqman实时荧光定量pcr检测试剂盒的应用评价

(1)临床样品

200份抗凝血采集自兰州大学第二医院就医的经蜱叮咬患者，样品的采集征得患者或家属的同意，并通过兰州大学第二医院伦理委员会的批准。用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行血液dna的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

(2)样品的比对检测

200份基因组dna样品首先利用巢式pcr结合dna测序技术进行梨形虫的检测,结果表明，200份样品均为邓肯氏巴贝斯虫阴性。接着，以邓肯氏巴贝斯虫taqman荧光定量pcr试剂盒进行检测，同时设立阳性和阴性对照，结果表明(图4)，荧光定量pcr检测结果与巢式pcr结合基因测序结果完全一致。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种邓肯氏巴贝斯虫鉴别检测试剂盒及检测方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(上游引物bwa-f)

<400>1

gcagttaaaaagctcgta18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(下游引物bwa-r)

<400>2

aaacactctaattttctc18

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(探针bwa-p)

<400>3

ctctggcggtggttctcc18

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(上游引物piro-f140)

<400>4

ccatggataaccgtgctaattg22

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(下游引物r1380)

<400>5

catctaagggcatcacagacc21