本公开涉及生物
技术领域：
，具体地，涉及一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂与试剂盒及方法。
背景技术：
：侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection,ifi)，是指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖导致组织损害、器官功能障碍和炎症反应的病理改变及病理生理过程。近30年来，随着实体器官及造血干细胞移植技术和导管介入及留置技术的开发和利用，以及免疫抑制剂和放疗化疗的大量应用，侵袭性真菌感染的发病率及致死率在全球范围内显著升高。流行病学研究显示，院内侵袭性真菌感染率为7.5％，肿瘤病人侵袭性真菌感染率为8％，严重烧伤及创伤病人的侵袭性真菌感染率高达16％，而侵袭性真菌感染的致死率高达55％-70％，侵袭性真菌感染已成为严重威胁人类生命健康的疾病。通常情况下，人体内皆定植有大量侵袭性真菌，当人体处于健康状况时侵袭性真菌不会对人体功能造成损伤，当人体免疫机制紊乱或者受到严重损害时，人体内定植的侵袭性真菌会损害血管、消化道等器官的功能，危及患者生命，因此侵袭性真菌的诊断对于免疫功能受损患者的临床治疗及指导合理用药具有较大的临床价值。目前常用的侵袭性检测方法包括镜检、组织病理学检查、培养法和血清学检测。其中，镜检和组织病理学检查的检测结果中阳性率较低，无法排除假阴性的干扰；培养法检测周期长，敏感度低，对技术条件以及操作人员的专业水平要求较高，而且仅能实现单一目标检测；血清学检测仅能判断患者是否存在真菌感染，无法实现侵袭性真菌种水平的区分。聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)技术和多重实时荧光pcr技术(real-timepcr，rt-pcr)是近几年侵袭性真菌检测普遍采用的方法。pcr检测需要前期复杂的样本处理过程、繁琐的试验程序及复杂的结果判断。此外，rt-pcr所能覆盖的检测目标有限，需要通过多体系的设置才能实现多目标的检测，增加了操作的复杂性。技术实现要素：本公开的目的是提供一种快速、准确、一体化且灵敏度高的检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。为了实现上述目的，本公开提供一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的seqidno.1-14所示的引物和seqidno.17-26所示的探针。可选地，相对于1μmol的seqidno.1所示的引物，分别由seqidno.2-14所示的引物的含量各自为1～3μmol，分别由seqidno.17-26所示的探针的含量各自为0.5～1μmol。可选地，所述核酸试剂还包括阳性内质控；所述阳性内质控含有seqidno.15-16所示的引物和seqidno.27所示的探针。可选地，所述核酸试剂包括a管、b管和c管；a管含有seqidno.1-2所示的引物和seqidno.17-20所示的探针；b管含有seqidno.3-4、7-12所示的引物和seqidno.21、23-25所示的探针；c管含有seqidno.5-6、13-16所示的引物和seqidno.22、26-27所示的探针。可选地，seqidno.17、21、22所示的探针具有第一荧光标记；seqidno.18、23、26所示的探针具有第二荧光标记；seqidno.19、24所示的探针具有第三荧光标记；seqidno.20、25、27所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自fam荧光标记、vic荧光标记、cy5荧光标记和rox荧光标记中的一种。可选地，所述侵袭性真菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌、耳念珠菌中的至少一种。本公开还提供了一种用于检测侵袭性真菌的试剂盒，该试剂盒含有上述任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、模板dna和水中的至少一种。本公开还提供了上述任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测侵袭性真菌的试剂盒中的用途。本公开还提供了一种用于检测侵袭性真菌的系统，该系统包括具有a管检测器、b管检测器和c管检测器的pcr仪、计算装置和输出装置；所述a管检测器、b管检测器和c管检测器分别为装载有上述任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器；所述pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自fam荧光通道、vic荧光通道、cy5荧光通道和rox荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效；若荧光通道检测到的扩增曲线呈s型，且ct值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈s型，且35≤ct值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈s型，且ct值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；若a管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有白色念珠菌；若a管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有热带念珠菌；若a管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有光滑念珠菌；若a管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有近平滑念珠菌；若b管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有曲霉菌；若b管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有新型隐球菌；若b管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有耶氏肺孢子菌；若b管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有耳念珠菌；若c管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有毛霉菌；若c管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有真菌；若c管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品提取及检测过程正常。本公开还提供了一种用于检测侵袭性真菌的方法，其中，该方法包括：采用上述任意一项所述的核酸试剂，对待测样本的核酸序列进行pcr扩增；进行所述pcr扩增的pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自fam荧光通道、vic荧光通道、cy5荧光通道或rox荧光通道中的一种；并且进行如下的判别：若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效；若荧光通道检测到的扩增曲线呈s型，且ct值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈s型，且35≤ct值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈s型，且ct值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；若a管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有白色念珠菌；若a管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有热带念珠菌；若a管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有光滑念珠菌；若a管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有近平滑念珠菌；若b管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有曲霉菌；若b管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有新型隐球菌；若b管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有耶氏肺孢子菌；若b管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有耳念珠菌；若c管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有毛霉菌；若c管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有真菌；若c管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品提取及检测过程正常。本公开的有益效果在于：本公开能够快速实现待测样本中9种侵袭性真菌的筛查与鉴别，并鉴定样品中是否含有其它真菌，能够对常见部位感染的侵袭性真菌进行快速、准确的检测，避免血清学、病原培养学等方法的繁琐操作，达到如下的检测效果：(一)较高的多重检测能力本公开所建立的检测方法，能够通过在3个反应体系中同时筛查与鉴别白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和耳念珠菌等9种侵袭性真菌，以及进行真菌通用感染的鉴定，快速简便地确认侵袭性真菌的病原种类，克服了传统方法耗时长、操作繁琐或者检测目标单一的缺陷，节省时间、人力和试剂成本的同时对下游真菌耐药性分析也有关键的提示作用。(二)灵敏度高本公开所建立的检测方法能够实现超过9种侵袭性真菌的同时检测，在血液、痰液、肺泡灌洗液等不同待测样品中每种待测目标真菌的种属基因的检测灵敏度均可达到5×10copies/ml，与单重实时荧光pcr检测敏感度相当。(三)特异性高本公开所建立的检测方法中，所有引物都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性，不仅能够将检测目标相互区分，而且还能与核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物区别开，这些微生物至少包括人冠状病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒、流行性腮腺炎病毒、鼻病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、无毒结核分枝杆菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄杆菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、唾液链球菌、棒状杆菌、大肠杆菌、乳杆菌、卡他莫拉菌、淋球菌、铜绿假单胞杆菌、表皮葡萄球菌等。(四)预防假阴性结果本公开所建立的检测方法中，利用阳性内对照(iac)，可以有效提示假阴性检测结果。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开的第一方面提供一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的seqidno.1-14所示的引物和seqidno.17-26所示的探针。本公开提供的核酸试剂，采用多重荧光pcr技术，能够快速、准确、简便地筛查和鉴别白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和耳念珠菌等9种侵袭性真菌，同时还能进行真菌通用感染的鉴定。快速、准确地筛查待测样本所携带的多种侵袭性真菌的种类，对于免疫功能受损患者的临床治疗及指导用药具有重要意义，有利于提高感染患者的生存率，指导易感染患者的防治工作。多重荧光pcr技术中，探针与引物的组合效果对扩增效果有重要影响，上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针在一个反应体系内共扩增的问题，即评估tm值一致性、gc含量均一化、避免出现发夹结构及引物二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖上述至少9种侵袭性真菌，特异性良好、覆盖度高并且灵敏度高。根据本公开，上述核酸试剂中，各引物和/或探针的相对含量可以在较大的范围内变化。例如，相对于1μmol的seqidno.1所示的引物，分别由seqidno.2-14所示的引物的含量各自为1～3μmol，分别由seqidno.17-26所示的探针的含量各自为0.5～1μmol。根据本公开，为控制反应体系的内部质量，更好地判断反应是否受到干扰，所述核酸试剂还可以包括阳性内质控(internalamplificationcontrol，iac)。进一步地，所述阳性内质控可以含有seqidno.15-16所示的引物和seqidno.27所示的探针。这时，相对于1μmol的seqidno.1所示的引物，分别由seqidno.15-16所示的引物的含量各自可以为1～3μmol，由seqidno.27所示的探针的含量可以为0.5～1μmol。所述阳性内质控可以有效提示因为操作失误、pcr抑制物等原因造成的假阴性检测结果。其中，可以以人核糖核酸酶p(rnasep)基因为模板设计上述阳性内质控引物和探针。根据本公开，为了增强检测结果的准确性，所述核酸试剂可以分为三管，例如，所述核酸试剂可以包括a管、b管和c管；a管含有seqidno.1-2所示的引物和seqidno.17-20所示的探针；b管含有seqidno.3-4、7-12所示的引物和seqidno.21、23-25所示的探针；c管含有seqidno.5-6、13-16所示的引物和seqidno.22、26-27所示的探针。进一步地，为使同一体系中的不同探针的扩增被分别识别，可以对探针分别进行荧光标记。例如，作为一种实施方式，seqidno.17、21、22所示的探针具有第一荧光标记；seqidno.18、23、26所示的探针具有第二荧光标记；seqidno.19、24所示的探针具有第三荧光标记；seqidno.20、25、27所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自fam荧光标记、vic荧光标记、cy5荧光标记和rox荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，seqidno.17、21、22所示的探针具有fam荧光标记；seqidno.18、23、26所示的探针具有vic荧光标记；seqidno.19、24所示的探针具有cy5荧光标记；seqidno.20、25、27所示的探针具有rox荧光标记。探针中fam为6-羧基荧光素，vic为购自abi公司的染料，cy5为5h-吲哚菁，rox为6-羧基-x-罗丹明。根据本公开，所述侵袭性真菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌、耳念珠菌中的至少一种。优选地，所述白色念珠菌的靶基因为18srrna+its1+5.8s+its2基因，所述热带念珠菌的靶基因为18srrna+its1+5.8s+its2基因，所述光滑念珠菌的靶基因为18srrna+its1+5.8s+its2基因，所述近平滑念珠菌的靶基因为18srrna+its1+5.8s+its2基因，所述毛霉菌的靶基因为18srrna+its1+5.8s+its2基因，所述曲霉菌的靶基因为18srrna+its1+5.8s基因，所述新型隐球菌的靶基因为its2基因，所述耶氏肺孢子菌的靶基因为lsu基因，所述耳念珠菌的靶基因为18srrna+its1+5.8s+its2基因。上述各检测目标菌的靶基因均为本领域公知的，在此不再赘述。本公开的第二方面提供了一种用于检测侵袭性真菌的试剂盒，该试剂盒含有上述任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、模板dna和水中的至少一种。进一步地，所述试剂盒的配置可以为：总计25μl，其中，2×pcr缓冲液(含iac模板)11～13μl；10×引物探针混合物2～3μl(每条引物的浓度为200～400nm，每条探针的浓度为100～200nm)，dna模板3～6μl，其余为超纯水。作为一种特别优选的实施例，所述试剂盒为：2×pcr缓冲液12.5μl(含iac模板)；10×引物探针混合物2.5μl(每条引物的浓度为200～400nm，每条探针的浓度为100～200nm)，dna模板5μl，超纯水补至25μl。本公开的试剂盒能够实现快速、全面、准确、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌、耳念珠菌等至少9种侵袭性真菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。本公开的第三方面本公开提供了上述任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测侵袭性真菌的试剂盒中的用途。本公开的第四方面提供了一种用于检测侵袭性真菌的系统，该系统包括具有a管检测器、b管检测器和c管检测器的pcr仪、计算装置和输出装置；所述a管检测器、b管检测器和c管检测器分别为装载有上述任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器；所述pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自fam荧光通道、vic荧光通道、cy5荧光通道和rox荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效；若荧光通道检测到的扩增曲线呈s型，且ct值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈s型，且35≤ct值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈s型，且ct值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；若a管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有白色念珠菌；若a管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有热带念珠菌；若a管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有光滑念珠菌；若a管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有近平滑念珠菌；若b管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有曲霉菌；若b管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有新型隐球菌；若b管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有耶氏肺孢子菌；若b管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有耳念珠菌；若c管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有毛霉菌；若c管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有真菌；若c管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品提取及检测过程正常。本公开的第五方面提供了一种用于检测侵袭性真菌的方法，其中，该方法包括：采用上述任意一项所述的核酸试剂，对待测样本的核酸序列进行pcr扩增；进行所述pcr扩增的pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自fam荧光通道、vic荧光通道、cy5荧光通道或rox荧光通道中的一种；并且进行如下的判别：若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效；若荧光通道检测到的扩增曲线呈s型，且ct值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈s型，且35≤ct值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈s型，且ct值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；若a管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有白色念珠菌；若a管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有热带念珠菌；若a管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有光滑念珠菌；若a管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有近平滑念珠菌；若b管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有曲霉菌；若b管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有新型隐球菌；若b管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有耶氏肺孢子菌；若b管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有耳念珠菌；若c管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有毛霉菌；若c管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有真菌；若c管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品提取及检测过程正常。其中，所述pcr扩增的条件可以为：a：95℃，5min；b：95℃，15s，c：60℃，45s；b-c循环45个反应，收集荧光。所述待测样本可以为临床患者的血液、痰液和肺泡灌洗液中的至少一种，可采用热裂解法对所述待测样本进行处理，以得到待测dna。优选地，本公开的用于检测侵袭性真菌的方法不用于诊断，或者说侵袭性真菌的定性与定量结果与疾病是否发生没有一一对应的相关性，不属于诊断结果，但是侵袭性真菌的定性与定量的检测结果能够作为中间信息，供临床医生参考。本公开的方法能快速敏感特异地实现白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌、耳念珠菌等至少9种侵袭性真菌的系统筛查，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和试剂成本。以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。实施例1检测方法及检测结果判定1、引物、探针合成按照表1所示的引物序列和表2所示的探针序列，进行序列合成。探针中fam为6-羧基荧光素，cy5为5h-吲哚菁，rox为6-羧基-x-罗丹明，vic为购自abi公司的染料，bhq1-3为淬灭基团。表1表2检测目标探针代码探针序列seqidnocaca-pfam-acgtggtggacgttaccgcc-bhq117ctct-pvic-tgtggtggccactagcaaaat-bhq118cgcg-pcy5-tctgtctrcccagcacgc-bhq319cpcp-prox-caaacccgagggtttgagggagaaa-bhq220aspasp-pfam-tcctcgagcgtatggggct-bhq121mucmuc-pfam-caacttgcgctcattggta-bhq122cncn-pvic-ctcgggttttaytacctgttggactt-bhq123pnjpnj-pcy5-cagacttcttgcgataagg-bhq324c-auc-au-prox-tgtcgttattgttactactgactctgacggttc-bhq225fungifungi-pvic-agaacggccawgcacca-bhq126iaciac-prox-gctcccgagcagccgcttgcgatatcaaaggg-bhq227注：ca-白色念珠菌；ct-热带念珠菌；cg-光滑念珠菌；cp-近平滑念珠菌；asp-曲霉菌；muc-毛霉菌；cn-新型隐球菌；pnj-耶氏肺孢子菌；c-au-耳念珠菌；fungi-真菌通用；iac-阳性内质控；序列中y代表简并碱基t/c，r代表简并碱基a/g。2、样本处理常规方法采集患者血液、痰液及肺泡灌洗液样本后，采用热裂解法进行真菌基因组提取。3、构建检测体系按照如下操作配制反应体系：总体系25μl，具体配置如下：2×pcr缓冲液(含iac模板)12.5μl；10×引物探针混合物2.5μl(每条引物的浓度为0.2-0.4μm，每条探针的浓度为0.1-0.2μm)，dna模板5μl，超纯水补至25μl。试剂盒分为a管、b管和c管3个反应管，a管含有上表1中seqidno.1-2所示的引物和上表2中seqidno.17-20所示的探针；b管含有上表1中seqidno.3-4、7-12所示的引物和上表2中seqidno.21、23-25所示的探针；c管含有上表1中seqidno.5-6、13-16所示的引物和上表2中seqidno.22、26-27所示的探针。将pcr管放入荧光定量pcr仪中，选择fam、vic、cy5、rox作为报告基团，反应程序如下：a：95℃，5min；b：95℃，15s，c：60℃，45s；b-c循环40个反应，该阶段收集荧光。检测结果判定：若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效，否则视为实验无效。若荧光通道检测到的扩增曲线呈s型，且ct值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈s型，且35≤ct值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈s型，且ct值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；若荧光通道检测到的扩增曲线为非s型，但是报告有ct值，则判定该次检测发生非特异性扩增，收集到的荧光可能为探针降解所释放的非特异性荧光信号。检测结果具体判定方式参照表3。表3若a管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有白色念珠菌；若a管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有热带念珠菌；若a管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有光滑念珠菌；若a管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有近平滑念珠菌；若b管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有曲霉菌；若b管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有新型隐球菌；若b管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有耶氏肺孢子菌；若b管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有耳念珠菌；若c管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有毛霉菌；若c管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有真菌；若c管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品提取及检测过程正常。实施例2最低检出限验证评估用检测样本：分别选择血液、痰液或肺泡灌洗液中的白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和耳念珠菌，采用热裂解法分别提取各自的基因组，并定量浓度为5×104copies/ml，然后分别进行梯度稀释得到浓度为5×103copies/ml、5×102copies/ml、5×10copies/ml的评估用模板。按照实施例1的检测方法分别对各浓度的评估用模板进行检测，每个浓度梯度重复检测20次，取均值作为最后的检测结果，如表4所示。表4由表4可以看出，本公开试剂盒检测血液、痰液和肺泡灌洗液中的检测目标侵袭性真菌的基因组的最低检出限均达到5×10copies/ml，本公开试剂盒检测灵敏度较高。实施例3特异性验证选择人冠状病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为2233)、巨细胞病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为303)、肠道病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为977)、麻疹病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为1513)、人偏肺病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为1768)、流行性腮腺炎病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为3145)、鼻病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为2343)、百日咳杆菌(购自中国科学院武汉病毒所，编号为23524)、肺炎衣原体(购自中国科学院武汉病毒所，编号为14127)、肺炎支原体(购自中国科学院武汉病毒所，编号为14121)、流感嗜血杆菌(来自中国医学菌种保藏中心，编号为58532)、无毒结核分枝杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为93009)、脑膜炎奈瑟菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21123)、金黄色葡萄杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为31122)、肺炎链球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为31108)、化脓链球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为25341)、唾液链球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为25346)、棒状杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为32451)、大肠杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为32516)、乳杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为34106)、卡他莫拉菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为11256)、淋球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为13251)、铜绿假单胞杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为15204)、表皮葡萄球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为26069)等与检测目标侵袭性真菌核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状、采样部位正常寄生或易并发的微生物作为特异性评估样本。应用本公开提供的试剂盒，按照实施例1的检测方法检测上述特异性评估样本，在阴性对照、阳性对照和阳性内对照均成立的条件下，待检目标均未出现非特异性的荧光信号，表明本公开的试剂盒能有效区分非检测目标细菌，具有较好的特异性。实施例4试剂盒的保存期试验分别以5×10copies/ml的白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌、耳念珠菌、真菌通用人工合成基因作为评估用检测样本，在第0天时，分装成9份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为一年。对比例1、引物、探针合成按照表5和表6所示的引物、探针序列，进行序列合成。表5表62、检测方法(1)样本处理常规方法采集患者血液、痰液及肺泡灌洗液样本后，采用热裂解法进行真菌基因组提取。(2)构建检测体系按照如下操作配制反应体系：总体系25μl，具体配置如下：pcr缓冲液22.5μl，taqdnapolymerase0.3μl，uracil-dnaglycosylase0.2μl，dna模板2.0μl。将pcr管放入荧光定量pcr仪中，检测荧光通道为fam通道，内参照荧光通道为vic通道，反应程序如下：a：40℃，5min；b：95℃，5min；c：95℃，15s，d：60℃，50s；b-c循环40个反应，该阶段收集荧光。(3)结果判定真菌(fam)ct值>32或者“undet.”(abi7500)者“空白”(lightcycler480)，且内参照(vic)ct值<40为阴性；真菌(fam)ct值≤30，且有较好的对数增长曲线即为阳性；真菌(fam)30＜ct样本＜32为灰度区带，建议重复检验确认。3、最低检出限验证利用上述检测方法分别对实施例2中各浓度的最低检出限评估用模板进行检测，每个浓度梯度重复检测20次，取均值作为最后的检测结果。验证结果表明，对比试剂盒对各检测目标侵袭性真菌的基因组的最低检出限均为102copies/ml。说明对于样本中痕量的白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和耳念珠菌基因组，本公开试剂盒比对比试剂盒有更强的检测能力。4、特异性验证利用上述检测方法分别对实施例3中各特异性评估样本进行检测，结果显示，对比试剂盒对流感嗜血杆菌的检测结果为阳性。说明本公开试剂盒相较于对比试剂盒具有更好的检测特异性。由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以一次性检测出白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和耳念珠菌等至少9种侵袭性真菌，而且最低检出限更低，特异性高。以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，例如a管检测目标和b管检测目标的可以互换。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。序列表<110>北京卓诚惠生生物科技股份有限公司<120>用于检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法<130>13930-k-abt<160>35<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gactaggatatagctggtt19<210>2<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttctgggctgtttc14<210>3<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctgtccgagcgtcatt16<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4acctgatccgaggtcacc18<210>5<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcgagtctttgaacgca17<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tgtgggttgttgttgatactg21<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctgtttgagagtcatgaaa19<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tcaccttcccactaacacattt22<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cggactaggatatagctggtt21<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ttctgggctgtttccct17<210>11<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tcgttactactgactctgacggttcatt28<210>12<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gtactgataccaacggcaacttgatca27<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ggraaactcaccaggtcca19<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gcyctatccccagcacga18<210>15<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cgaagggttgccgcttttcggtgg24<210>16<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16gaccgaacccttctggtcaggcacc25<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17acgtggtggacgttaccgcc20<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18tgtggtggccactagcaaaat21<210>19<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19tctgtctrcccagcacgc18<210>20<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20caaacccgagggtttgagggagaaa25<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21tcctcgagcgtatggggct19<210>22<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22caacttgcgctcattggta19<210>23<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23ctcgggttttaytacctgttggactt26<210>24<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24cagacttcttgcgataagg19<210>25<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25tgtcgttattgttactactgactctgacggttc33<210>26<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26agaacggccawgcacca17<210>27<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27gctcccgagcagccgcttgcgatatcaaaggg32<210>28<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28actttyaacaayggatctcttggytc26<210>29<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29tgacrctsrracaggcatg19<210>30<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30tgatactgaarcaggcgtrctc22<210>31<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31caagtcgaacggtaacaggaagaa24<210>32<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32tcttgcgacgttatgcggtat21<210>33<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33catcgatgaagaacgcagcgaaatgc26<210>34<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34catcgatgaagaacgyagcraartgc26<210>35<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35cttgcttctttgctgacgag20当前第1页12