泛素连接酶CHAF1B作为靶位点在制备肺腺癌顺铂增敏药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及泛素连接酶chaf1b作为靶位点在制备肺腺癌顺铂增敏药物中的应用。

背景技术：

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率均位居全球第一，在中国的发病率及死亡率亦高。据2015年who肺癌组织学分型标准，肺癌病理类型主要包括腺癌、鳞癌、大细胞癌、腺鳞癌、小细胞癌及其他少见类型的肺癌，除小细胞癌外其他类型统称为非小细胞肺癌，在肺癌患者中占比约90%，其中腺癌比例最高约40%～55%。目前非小细胞肺癌的治疗是包括手术、化疗、放疗、分子靶向治疗及免疫治疗等多种治疗手段结合的综合治疗。因为非小细胞肺癌患者早期症状不明显，诊断时多为中晚期，失去了手术机会、需要术前新辅助化疗或术后需要行化疗抗肿瘤治疗等，所以化疗是非小细胞肺癌的重要治疗手段。肺癌的一线化疗方案以铂类为基础联合其他化疗药物为主，其中顺铂为最常用的铂类化疗药物。但是一般情况下肺癌患者对顺铂初治便耐药或是在后续治疗中逐渐出现耐药，从而导致治疗的失败。肺腺癌在非小细胞肺癌中占比最高，因此进一步探讨肺腺癌顺铂耐药的具体分子机制，为肺腺癌患者顺铂耐药逆转提供新依据迫在眉睫。

迄今为止，肺腺癌患者缺乏预测个体患者顺铂药物敏感性的信息。所以，有些患者并没有获得预期的治疗效果反而受到高毒性药物的副作用。更重要的是，由于他们的身体状况恶化，一些不必要治疗的患者可能失去额外的治疗机会。通常认为传统的病理组织学参数例如肿瘤分期或分级是肺腺癌患者的预后因素。然而即使肿瘤有相似的病理组织学特点，同样也可能有广泛不同的分子特征，属于独特的分子亚组，具有不同疾病的侵袭性和药物的敏感性。为了针对肺腺癌施行有效的精准药物治疗，需要探索肺腺癌顺铂药物增敏的新靶点。同时也需要改善分子标志物预测患者对特定的治疗反应性的能力，或者对治疗效果的评估。从基因表达分析中鉴定的多基因分类方法可以预测肺腺癌患者的顺铂药物敏感性、复发和生存。因此迫切需要能预测肺腺癌患者的顺铂药物敏感性、复发和预后的可靠标志物，以优化治疗策略和改善临床结局。

肺癌顺铂化疗耐药机制复杂，迄今顺铂耐药机制主要与铂类药物在恶性肿瘤细胞内积聚少、dna损伤修复增加、凋亡失活、上皮-间质转变激活、肿瘤干细胞特性等密切相关。而与之相关的蛋白及其信号通路中的重要分子通常受基因组、表观遗传学和蛋白翻译后修饰等多种因素的调控。蛋白质是生命活动的主要执行者和承担者，其功能正常与否决定着生命活动能否有序、高效的进行。基因组学和表观遗传学在基因层面上共同指导各种细胞独特的基因表达。而蛋白翻译后修饰是在蛋白水平直接影响蛋白的空间构象、活性及稳定性等，进而调控蛋白质多种功能来调节机体生命活动。蛋白翻译后修饰是指生物将mrna翻译成蛋白质后对蛋白质进行化学修饰，此过程可形成成熟的蛋白质产物或者调控蛋白质表达水平。翻译后修饰种类高达400多种，主要类型包括磷酸化、乙酰化、泛素化、类泛素化、甲基化、糖基化等。

蛋白泛素化是指泛素分子（一类在真核生物中广泛表达，由76个氨基酸构成的高度保守的短肽）在一系列酶作用下，连接到某一靶蛋白分子上，对靶蛋白进行特异性修饰的过程。该过程由三类酶催化：泛素活化酶（e1）、泛素结合酶（e2）和泛素连接酶（e3）。e1激活泛素并将其转移到e2上，e3招募被泛素化的e2，识别底物并且协助或直接帮助e2上的泛素转移到蛋白底物。在泛素化过程中e3具有识别底物的重要作用，人类基因组编码超过600个泛素连接酶，其中诸多泛素连接酶被证实与肿瘤的发生发展及恶性表型密切相关，并且有研究证实泛素连接酶通过调控底物来影响肺癌的顺铂耐药。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种可以用于制备肺腺癌顺铂增敏药物的新靶点。

为探索肺腺癌患者顺铂耐药的原因，本发明行肺腺癌细胞株a549及肺腺癌顺铂耐药株a549/ddp的蛋白组芯片筛查，识别系列显著变化蛋白，对显著上调蛋白进行生信分析，发现相比a549，a549/ddp中泛素依赖性蛋白分解代谢过程活跃。本发明表明肺腺癌顺铂耐药细胞株中泛素连接酶cahf1b高表达，提示其高表达与肺腺癌顺铂药物敏感性相关。本发明研究表明，肺腺癌顺铂耐药细胞株中泛素连接酶cahf1b高表达，敲除cahf1b后可增加肺腺癌细胞的顺铂药物敏感性。机制研究表明，高表达的cahf1b可通过促进ncor2泛素化降解导致肺腺癌细胞顺铂耐药。总的来说，数据表明高水平的cahf1b和低表达的ncor2与肺腺癌顺铂耐药有关。此外，cahf1b和ncor2在制备肺腺癌顺铂增敏药中作为靶位点，也是临床上预测肺腺癌患者顺铂药物敏感性的的分子标志物，可能是一种新的改善肺腺癌患者治疗和生存的策略。

肺腺癌患者顺铂耐药是肿瘤进展与预后不佳的主要原因之一，为探索肺腺癌顺铂耐药的机制，本课题对a549/ddp及a549细胞株行全蛋白质组芯片筛查，量化、识别a549a549/ddp细胞系差异蛋白质共7475个，可定量蛋白5758个。定义p值＜0.05，a549/ddp较a549上调2倍或下调2倍及以上的蛋白为显著变化蛋白共657个，其中显著上调蛋白共312个，显著下调蛋白共345个，通过公共数据库david对显著上调蛋白进行go分析，发现相比a549而言a549/ddp中泛素依赖性蛋白分解代谢过程活跃。由此可见泛素化过程与肺腺癌顺铂药物敏感性相关。

显著上调的蛋白中泛素化酶较多，共46个：1个泛素活化酶、3个泛素结合酶和42个泛素连接酶。蛋白泛素化过程为e1激活泛素并将其转移到e2上，e3招募被泛素化的e2，识别底物并且协助或直接帮助e2上的泛素转移到蛋白底物。e3在泛素化过程中具有识别底物的重要作用，42个e3中，公共数据库gepia分析示泛素连接酶wdhd1、arpc1a、cdc20、chaf1b、ppp1r13l、trip12、aurka、cdca3、fbxo22高表达与肺腺癌患者总生存期呈负相关；行pcr法验证前6者的mrna表达水平，结果提示a549/ddp细胞株中wdhd1、chaf1b、ppp1r13l及cdc20表达量较a549细胞株上调。mtt法结果示，分别敲除上述4个基因后，均可增加a549/ddp细胞顺铂药物敏感性，选择增敏效果显著的chaf1b进行下一步研究。这些发现提示了chaf1b在肺腺癌细胞潜在的顺铂耐药机制中起重要作用。

ualcan数据库分析示，chaf1b的mrna表达水平在肺腺癌组织中较癌旁组织高，wb表明a549/ddp中chaf1b的蛋白表达量高于a549细胞，与芯片结果一致，证实芯片结果真实可靠，且提示两者与肺腺癌顺铂耐药密切相关。成功敲除chaf1b后wb结果示chaf1b表达下降，ncor2表达上调，ppp5c表达无明显改变。上述结果提示chaf1b变化分别能调控底物ncor2的变化。行mtt、流式细胞术结果表明，a549细胞株敲除ncor2后，在顺铂作用下细胞活力增加、凋亡率减少。这些数据支持了泛素连接酶chaf1b和底物ncor2影响肺腺癌细胞顺铂耐药重要参与者的假说。

进一步co-ip结果证实chaf1b与ncor2分别为互作蛋白；免疫荧光双色检测示chaf1b与ncor2的相互作用位置主要在细胞核内，行蛋白稳定性实验证实chaf1b促进ncor2泛素化降解；功能回复实验结果显示：在顺铂作用下，a549/ddp中敲除chaf1b+敲除ncor2组较单独敲除chaf1b组在细胞实验中细胞增殖、迁移能力增加，凋亡率减少，在动物实验中瘤体生长速度增快及大小明显增加，免疫组化提示ki-67增加，而凋亡相关指标明显下降。因此，本发明提示chaf1b表达及其下游靶蛋白ncor2的检测可作为预测肺腺癌患者顺铂药物敏感性的有效方法，以指导临床决策。

总之，本发明描述了肺腺癌中改变的表达模型，并证明了其在肺腺癌顺铂药物敏感性中的潜在作用。此外，进一步研究证实泛素连接酶cahf1b可通过促进ncor2泛素化降解导致肺腺癌细胞顺铂耐药。我们的研究结果支持这样的概念：高水平的chaf1b可能是肺腺癌顺铂耐药的新型预测因子，使临床医生能够确定需要更强化治疗的高危患者。因此，靶向chaf1b途径可能成为改善肺腺癌或其他癌症患者的治疗和存活的新的治疗策略。

附图说明

图1：蛋白芯片筛查芯片中a549/ddp较a549显著变化蛋白。a：行a549/ddp及a549全蛋白质组芯片，识别可定量差异蛋白蛋白5758个。定义p值＜0.05，a549/ddp较a549上调2倍或下调2倍及以上的蛋白为显著变化蛋白。b：蛋白翻译后修饰相关蛋白显著上调。c：对显著变化蛋白进行go富集分析，发现泛素依赖性蛋白分解代谢过程活跃。d：a549/ddp和a549蛋白质芯片中显著变化蛋白共657个，显著上调蛋白312个，显著下调蛋白345个，显著上调的泛素化酶共46个。e：46个上调显著泛素化酶中，共1个e1、3个e2和42个e3；

图2：蛋白质芯片中显著上调的e3及预后呈负相关的e3。a：a549/ddp及a549中46个显著上调泛素相关酶的蛋白丰度及相对表达量，*所标蛋白为数据库提示与预后呈负相关的蛋白。b：根据公共数据库，9个e3高表达（包括：wdhd1、arpc1a、aurka、cdc20、cdca3、chaf1b、fbxo22、ppp1r13l、trip12）与肺腺癌患者预后呈负相关；

图3：预后呈负相关显著上调的e3表达水平及其剂量反应线。a：pcr法结果提示a549/ddp中wdhd1、chaf1b、ppp1r13l及cdc20的mrna表达明显高于a549。b：敲除wdhd1、chaf1b、ppp1r13l及cdc20后a549/ddp细胞增殖能力明显下降，ic50明显下调。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；

图4：chaf1b在肺腺癌中的表达水平及其底物探索。a：公共数据库ualcan提示肺癌组织中chaf1b表达高于癌旁组织。b：敲除chaf1b后ncor2上调，而ncor2无明显改变。c：ncor2和ppp5c的泛素化位点；

图5：下调a549细胞中ncor2表达可降低顺铂药物敏感性。a-b：mtt法及流式细胞术结果示a549细胞敲除ncor2后，肺腺癌细胞对顺铂的药物敏感性下降，细胞增殖加快、凋亡减少。ddp：顺铂对a549/ddp的ic25浓度。*p＜0.05；

图6：a549/ddp中chaf1b与ncor2形成复合物并促进ncor2泛素化降解。a：免疫共沉淀法显示chaf1b与ncor2为相互作用蛋白。b：免疫荧光检测结果表明ncor2（绿色）主要存在于细胞核内，chaf1b（红色）在细胞核及细胞浆内均存在，两者共定位于细胞核。c：蛋白稳定性实验证实敲除chaf1b后ncor2降解速度减慢。*p＜0.05；

图7：a549/ddp中chaf1b通过增加ncor2降解导致顺铂耐药。a-d：分别行mtt法、流式细胞术、划痕实验及细胞克隆形成实验进行功能回复实验证实chaf1b通过增加ncor2的降解导致顺铂耐药；

图8：体内实验进一步验证chaf1b的功能。a：移植瘤实验发现a549/ddp敲除chaf1b后顺铂对瘤体体积的抑制作用明显大于对照组。b：wb证实a549/ddp的瘤体组织中chaf1b表达上调，敲除chaf1b组瘤体组织中ncor2上调。c-d：a549/ddp敲除chaf1b后ki-67表达明显少于对照组，凋亡指标则明显高于对照组。bars表示标准差，*p＜0.05，ddp处理浓度为a549/ddp细胞ic25浓度。

具体实施方式

下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明

1、材料及方法

细胞培养及转染，qrt-pcr分析，蛋白质印迹分析，免疫组化测定，mtt测定，流式细胞术，免疫沉淀，免疫荧光，细胞划痕修复实验，集落形成测定，以上方法均是现有方法，在此不再累述。

、结果

2.1全蛋白质组芯片分析及验证

2.1.1a549/ddp细胞株全蛋白质组芯片中泛素依赖性蛋白分解代谢活跃，提示蛋白泛素化与顺铂耐药相关

肺腺癌患者顺铂耐药是肿瘤进展与预后不佳的主要原因之一，为探索肺腺癌顺铂耐药的机制，本课题对a549/ddp及a549细胞株行全蛋白质组芯片筛查。利用稳定同位素标记与液相色谱质谱或质谱分析整合联用的方法来量化a549及a549/ddp细胞系蛋白质，分析a549/ddp和a549的差异蛋白质，共识别差异蛋白共7475个，可定量蛋白5758个。我们定义p值＜0.05，a549/ddp较a549上调2倍或下调2倍及以上的蛋白为显著变化蛋白，发现显著变化蛋白共657个，其中显著上调蛋白共312个，显著下调蛋白共345个(如图1a)。分析显著上调蛋白发现翻译后修饰相关蛋白上调（如图1b）。使用公共数据库https://david.ncifcrf.gov/对显著上调蛋白进行go分析，发现相比a549而言a549/ddp中泛素依赖性蛋白分解代谢过程活跃，差异具有统计学意义（p<0.05）（如图1c）。泛素化酶相关网站uniprot及ubibrowser提示显著上调的蛋白中泛素化酶较多，共46个（如图1d）：1个泛素活化酶（e1）、3个泛素结合酶（e2）和42个泛素连接酶（e3）（如图1e）。

多种泛素连接酶可增加肺腺癌细胞顺铂药物敏感性

本课题蛋白质芯片中显著上调的泛素化酶共46个，包括1个泛素活化酶、3个泛素结合酶和42个泛素连接酶，其蛋白丰度如热图所示（如图2a）。蛋白泛素化过程为e1激活泛素并将其转移到e2上，e3招募被泛素化的e2，识别底物并且协助或直接帮助e2上的泛素转移到蛋白底物。由此可见，e3在泛素化过程中具有识别底物的重要作用，且文献提示e3与恶性肿瘤顺铂耐药密切相关，因此课题组主要研究e3。42个e3中，为明确e3功能并探索其是否可影响肺腺癌顺铂耐药，查阅公共数据库http://gepia.cancer-pku.cn/发现上调e3中，与预后呈负相关的e3共9个（如图2b）：wdhd1、arpc1a、aurka、cdc20、cdca3、chaf1b、fbxo22、ppp1r13l、trip12。

上述9个显著上调且与预后负相关的e3中，已有研究报道部分泛素连接酶表达上调与顺铂耐药相关，证实了本课题所筛查芯片结果具有真实性和可靠性。本课题选择无文献报道与顺铂耐药相关的蛋白，及少数已有文献报道与顺铂耐药相关的蛋白进行探索，包括wdhd1、chaf1b、arpc1a、cdc20、ppp1r13l、trip12。行pcr法检测其表达水平，结果提示a549/ddp细胞株中wdhd1、chaf1b、ppp1r13l及cdc20表达量较a549细胞株上调，差异具有统计学意义（p<0.05），这与蛋白芯片结果趋势相符（如图3a）。因为arpc1a和trip12表达趋势与芯片不相符，后续不予研究这两个基因所对应蛋白。进一步探索wdhd1、chaf1b、ppp1r13l及cdc20对a549/ddp细胞顺铂药物敏感性的影响，构建相应的si-rna敲除a549/ddp中上述4个基因后，行mtt法检测肿瘤细胞增殖能力并计算其ic50及其ic25，发现敲除上述4个基因表达后a549/ddp细胞增殖能力明显下降（如图3b），ic50明显下调。由于已有文献报道ppp1r13l与顺铂耐药相关，cdc20的ic50下降相对小，后续不予研究这两个蛋白。因此本课题对chaf1b调控a549肺腺癌细胞顺铂药物敏感性的机制进行初步探索。

泛素连接酶通过促进底物泛素化降解导致a549肺腺癌细胞顺铂耐药

2.2.1chaf1b促进ncor2泛素化降解导致肺腺癌顺铂耐药

2.2.1.1a549/ddp中chaf1b可致ncor2表达下降

全蛋白质组芯片结果提示a549/ddp细胞株的chaf1b蛋白表达量较a549细胞株上调2.01倍，公共数据库ualcan结果提示chaf1b在肺癌组织表达高于癌旁组织（如图4a）。wb结果确证a549/ddp中chaf1b蛋白表达量较a549上调（如图4b）。结合全蛋白质组芯片及公共数据库biocuckoo、phosphosite和ualcan，仅ncor2和ppp5c（泛素化位点如图4c）与chaf1b具有互相作用关系、具有泛素化位点并且在肺腺癌中低表达。予以si-chaf1b敲除a549/ddp中chaf1b后，行wb法检测ncor2和ppp5c蛋白表达水平变化，ncor2上调，而ppp5c无明显改变（如图4b）。

中下调ncor2的表达可致细胞顺铂耐药

为明确ncor2的功能，a、b组以a549为研究对象，分别转染si-con和si-ncor2，c、d在a549/ddp中分别转染si-con和si-ncor2，行mtt法检测细胞活力（如图5a）、流式细胞术检测细胞凋亡（如图5b），结果显示a549细胞株敲除ncor2后细胞活力增加、凋亡减少，而a549/ddp中转染或不转染si-ncor2，细胞活力均高、凋亡均少，提示肺腺癌细胞中ncor2下调是顺铂耐药的原因之一。

综上所述，我们推测ncor2可能作为chaf1b的下游靶蛋白来调控顺铂药物敏感性。

与ncor2形成复合物并促进ncor2泛素化降解来导致顺铂耐药

免疫共沉淀探索chaf1b和ncor2的相互作用关系，结果表明chaf1b和ncor2为相互作用蛋白（如图6a）。行if双色检测明确chaf1b与ncor2共同作用位置，结果显示chaf1b（红色）存在于细胞核及细胞浆，ncor2（绿色）存在于细胞核，提示chaf1b和ncor2相互作用的主要位于细胞核内（如图6b）。蛋白稳定性实验结果提示敲除chaf1b后ncor2降解速度明显减慢（如图6c）。上述实验证实chaf1b和ncor2为互相作用蛋白，并且chaf1b促进ncor2泛素化降解。

行功能回复实验探索chaf1b通过调控ncor2影响顺铂耐药的功能。以a549/ddp为研究对象设置a-e共5组，a、b两组分别转染si-control和si-chaf1b，c、e两组分别转染si-chaf1b、si-ncor2，d组同时敲除chaf1b和ncor2，并且c-e三组转染后予以ddp处理，予以上述处理后分别行mtt法（如图7a）、流式细胞术（如图7b）、划痕实验（如图7c）及细胞克隆形成实验（如图7d）进行功能回复实验，实验结果表明予以ddp处理时敲除a549/ddp中chaf1b后，细胞增殖能力明显下降、凋亡明显增加。敲除chaf1b后再敲除ncor2，细胞增殖能力恢复、凋亡减少。

动物实验证实chaf1b促进ncor2降解增加肺腺癌顺铂抵抗性

为了进一步验证chaf1b和ncor2的相互作用后的功能，在动物实验中将分别转染（1）si-con，（2）si-chaf1b，（3）si-chaf1b+si-ncor2的a549/ddp细胞进行小鼠皮下植瘤，敲除chaf1b后顺铂处理后的瘤体生长速度及大小明显小于对照组（p<0.05，图8a-b）。wb证实a549/ddp的组织中chaf1b表达上调，敲除chaf1b后的瘤体组织中ncor2上调。通过免疫组化检测肿瘤增殖相关指标ki-67，可以发现chaf1b敲除组的ki67阳性率明显小于对照组（图8c），凋亡指标明显上调（图8d）。体内实验进一步证明敲除chaf1b能增加肺腺癌顺铂敏感性、使细胞增殖减少并且凋亡增加，同时敲除chaf1b和ncor2致肺腺癌的顺铂药物敏感性下降、细胞增殖增多并且凋亡减少。

综上所述，细胞实验和动物实验证实chaf1b促进ncor2泛素化降解可导致a549/ddp细胞顺铂耐药。结合肺腺癌患者标本中chaf1b表达上调而ncor2表达下调，两者的负性关系极可能为临床上肺腺癌患者顺铂化疗敏感性预判提供新证据，为顺铂耐药逆转提供重要的分子靶标。