一种红树林杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物及其应用领域，特别涉及一种红树林杆菌及其应用。

背景技术：

石油及其产品在开采、炼制、贮运和使用过程中进入海洋环境会造成严重污染；其中溢油污染危害最大，石油泄漏被称为海洋污染的超级杀手。石油污染物与常规污染物有所不同，一旦污染水域或食物链，进入人体后不易遭到破坏，并且仍保持它的持久性、累积性、迁移性和高毒性时，必然危及机体，表现出致癌性、致变性和致畸性，严重威胁人类健康。对溢油污染进行治理，改善、恢复污染区域的生态环境，保护海洋环境和海洋资源，促进可持续发展是世界各国义不容辞的责任。因此，除了采取有效措施避免海上溢油事故发生，还要不遗余力地探索海上溢油的治理措施，用人类的智慧保护大自然。^[1-3]

目前，世界上对油污染的处理方法主要有3种：一是物理法，二是化学法，三是利用生物技术处理。因为物理法和化学法都存在其自身难以克服的缺点，如采用物理法很难去除海水表面的油膜和溶解油、采用化学法很可能造成二次污染，所以有关生物法的研究逐渐备受关注。所谓生物法就是通过微生物用油类作为其新陈代谢的营养物质，从而达到去除溢油污染。这类方法的优点是高效、经济、安全、无二次污染，特别是在已经渗透到海水中的溶解油或机械装置无法清除的薄油层的情况下，更是显现出其优越性。^[4-6]

与此同时，煤油污染的问题仍缺少高效环境友好的解决方法。微生物的生长周期一般为1-3天，反应条件温和，需要成本低，对环境友好，利用微生物可以很好地解决煤油污染问题问题。

李平等以石化厂附近长期被石油污染的土壤微生物为菌源，煤油作为唯一碳源，经过驯化筛选、分离出对煤油降解效果较好的菌种，经检验降解煤油效率为42.6％。^[7]

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种红树林杆菌及其应用，以克服现有技术中煤油污染问题不能高效且环境友好解决的缺陷。

本发明提供一种红树林杆菌，所述红树林杆菌为红树林杆菌(mangroveibactersp.)5092-2，保藏号为cgmccno.17705，其16srrna序列如seqidno.1所示。

所述红树林杆菌的特征如下：

红树林杆菌单个、成双、四联排列或呈立体包裹状不规则；菌落长度为5.0～10.0μm，菌落呈白色，圆形，突起，湿润，闪光，全缘，革兰氏染色呈阴性。

本发明的红树林杆菌(mangroveibactersp.)5092-2已于2019年05月05日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所)，保藏号为cgmccno.17705。

本发明根据blast聚类分析及形态学鉴定结果，确定微生物为mangroveibactersp.(5092-2)，经试验证明可降解煤油。

本发明测定菌株的16srrna部分序列，进行系统发育学分析。

本发明还提供一种红树林杆菌在降解处理煤油污染中的应用。

所述降解处理煤油污染的方法包括：

将红树林杆菌接种于ph为7.0-7.4的煤油液体培养基，30-35℃，160-180rpm培养120-168h，将菌液萃取(例如用30-50ml二氯甲烷进行萃取)，待萃取溶剂挥发后称量剩余煤油质量，煤油降解率达到百分之五十以上。

所述煤油液体培养基的组成为：nh4cl5-10g/l、kh2po45-10g/l、kcl0.1-0.2g/l、mgso45-10g/l、cacl20.02-0.05g/l、feso40.1-0.2g/l、nacl15-20g/l、k2hpo41.0-2.0g/l、煤油30-50g/l。

所述降解处理煤油污染的方法包括：

将红树林杆菌接种于ph为7.2的煤油液体培养基，35℃，160rpm培养168h。

所述煤油液体培养基的组成为：nh4cl5g/l、kh2po45g/l、kcl0.1g/l、mgso45g/l、cacl20.02g/l、feso40.1g/l、nacl15g/l、k2hpo41.0g/l、煤油30g/l。

本发明培养并研究能降解煤油的菌种，通过改变实验条件，摸索其最佳降解条件，并进行试验。

有益效果

本发明利用红树林杆菌发酵降解煤油，反应条件温和，需要成本低，对环境友好。

附图说明

图1为实施例1中菌株16srrna序列系统发育树；

图2为实施例1中菌株形态图(左图为菌落形态，右图为细胞形态)；

图3为实施例1中dna凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

新菌株红树林杆菌(mangroveibactersp.)5092-2，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是：cgmccno.17705。

菌种来源：上海污染土壤分离，具体分离方法如下：

将称取的10g油污染土样加到装有100ml无菌水的250ml的锥形瓶中，于28℃、160r·min^-1恒温震荡培养箱中培养24h。制成土壤悬浊液后静置。配置500、1000、1500、2000mg/l的石油浓度梯度，以此方法对菌株进行驯化。移取1ml土壤悬浊液接种于石油浓度为500mg/l的100ml富集培养基中，在28℃、160r·min^-1恒温震荡培养箱中培养7天。然后取出10ml加入石油浓度为1000mg/l的培养基中，以此转接3次。以此得到在高浓度石油污染的环境中生长的菌株，从中再选取具有良好降解性能的菌种。

菌种鉴定：

(1)菌落形态观察：菌落呈白色，圆形，突起，湿润，闪光，全缘，革兰氏染色呈阴性。

(2)菌体形态观察：呈杆状、长度约为5.0～10.0μm。

(3)菌株dna的提取方法：从平板上挑取单菌落，接种至5mllb液体培养基试管中，在35℃，160rpm恒温摇床中培养12h，吸取5μl，用无菌水稀释100倍后放入98℃水浴10min，破裂细胞，释放核酸。

(4)16srrna的基因扩增

在冰上建立pcr体系：forwardp2μl，reversep2μl，10*buffer5μl，mg²⁺3μl，ddh2o31.5μl，dntp1μl，模板dna5μl，taq0.5μl。pcr程序：94℃4min(预变性)；94℃30s(变性)，53℃30s(退火)，72℃90s(延伸)，循环32次；72℃7min(延伸)。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

引物序列分别为：

ssurrna

bsf8/205’-agagtttgatcctggctcag-3’(seqidno.2)61.0℃position8-27

bsr1541/205’-aaggaggtgatccagccgca-3’(seqidno.3)61.0℃position

1541-1522

pcr产物，120v恒压电泳，电泳结束后用eb染色20min，即可在紫外成像系统中观察拍照。

(5)所得序列的分析

dna凝胶电泳：

除1号孔以外，均有明显清晰条带，dna分子量约为15kb。

dna凝胶电泳图见图3。

将有条带的pcr产物进行基因测序，测序结果如seqidno.1所示。

将序列与blast网站中进行序列比对，查找到其菌属。

该菌为变形菌门(proteobacteria)，肠杆菌属，mangroveibactersp.，是革兰氏阴性菌。

菌株降解煤油工艺：将1ml种子液(nacl10g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，ph＝7.0，每毫升含2.0×10⁸个细菌)接种于ph为7.2的100ml煤油液体培养基中，于35℃，160rpm培养168h，煤油液体培养基组成为：nh4cl5g/l、kh2po45g/l、kcl0.1g/l、mgso45g/l、cacl20.02g/l、feso40.1g/l、nacl15g/l、k2hpo41.0g/l、轻油30g/l。培养完成后利用50ml二氯甲烷进行萃取，待二氯甲烷挥发后称量剩余煤油质量，计算菌种降解煤油效率为52.3％。

菌株的16srrna序列如seqidno.1所示。

对比例1

李平等以石化厂附近长期被石油污染的土壤微生物为菌源，煤油作为唯一碳源，经过驯化筛选、分离出对煤油降解效果较好的菌种，温度为30℃，ph为7，恒温摇床转速为190r/min，盐度为2.5％。在最佳培养条件：(nh4)2so41.0g/l、nacl30g/l、kh2po41.0g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、cac120.02g/l、k2hpo41.0g/l、fecl3痕量、煤油10g/l，煤油降解率达42.6％。

本发明筛选菌种的有效煤油降解率为52.3％，高于对比例，且对温度、ph值等要求较低。本发明涉及的参考文献如下：

[1]王晓伟,李纯厚,沈南南.石油污染对海洋生物的影响[j].南方水产科学,2006,2(2):76-80.

[2]王伟洁,吴长江.海洋石油污染对渔业的危害及其防治对策[j].山东环境,1995,(2):20-21.

[3]王家玲,李顺鹏.环境微生物学[j].微生物学杂志,1991,2:007.

[4]孙玮,夏文香.微生物在海洋石油污染中的生物修复作用[j].能源与环境,2007,(1):42-43.

[5]李言涛.海上溢油的处理与回收[j].海洋湖沼通报,1996,(1):73-83.

[6]闫季惠.海上溢油与治理[j].海洋技术,1996,15(1):29-34.

[7]李平等.烃类污染物降解菌的筛选及其生长条件研究,安徽农业科学,2012,40(21):11017-11019,11069.

sequencelisting

<110>东华大学

<120>一种红树林杆菌及其应用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1443

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgcaagtcgagcggcagcgggaagaagcttgcttctttgccggcgagcggcggacgggt60

gagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtggctaata120

ccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcc180

cagatgggattagcttgttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatccctagctggt240

ctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcag300

cagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaaga360

aggccttcgggttgtaaagtactttcagtcaggaggaaggtggtgagcttaatacgctca420

tcaattgacgttactgacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaat480

acggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtc540

aagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctgg600

agtctcgtagagggaggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggagg660

aataccggtggcgaaggcggcctcctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtgg720

ggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggc780

tgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacg840

gccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtgg900

tttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccagagaatcctgcaga960

gatgcgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtg1020

ttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgg1080

ttaggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgt1140

caagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaaga1200

gaagcgaacttgcgagagtaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtc1260

tgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtga1320

atacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaa1380

gtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaag1440

tcg1443

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agagtttgatcctggctcag20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aaggaggtgatccagccgca20