一株防治稻瘟病的荧光假单胞菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，尤其涉及一株防治稻瘟病的荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)及其应用。
背景技术：
：水稻是世界上重要的粮食作物之一，水稻是全世界一半以上的人口所依赖的主食，水稻产量占据世界粮食总产量的1/4以上，中国粮食总产量一半以上。稻瘟病是水稻上最主要的病害，全球85个国家均有发生，也是我国南北稻区危害最严重的水稻病害之一。稻瘟病每年造成20-30％的水稻产量损失，严重的年份达到50％以上，每年的产量损失可以养活6千万人口。稻瘟病(riceblast)是由子囊菌magnaportheoryzae(t.t.hebert)yaegashi&udagawa(无性态：pyriculariaoryzae)引起的一种突发性强、易于流行的世界性真菌病害。该病一年四季均可对水稻造成危害，其危害遍及水稻的各个部位，有苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等。水稻抗病品种选育、农艺措施和化学农药防治是目前生产上最常用的措施，由于稻瘟病菌生理小种易变异，抗病品种选育一般时间较长；化学农药的残留容易污染生态环境、威胁人类健康，病原菌容易产生抗药性。因此，寻找一种对人类和环境友好并具有良好防治效果的新型生防菌对水稻产业可持续发展至关重要。荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)能够有效控制植物病害，具有植物病原菌不易产生抗性和促进植物生长等优点，是稻瘟病防治上的重要生防菌。许煜泉等从稻草茬中分离的荧光假单胞菌jkd-2分泌一种胞外蛋白，可以溶解稻瘟病菌菌丝体和抑制孢子萌发，温室条件下的防效达到60％。廖晓兰等分离的铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)sub8对稻瘟病菌的抑菌带宽度达到4.53cm，产生吩嗪类物质抗菌活性物质，对稻瘟病菌有明显拮抗作用。利用分子生物学技术，开展新型荧光假单胞菌生防制剂的研究与应用，提高水稻米质和丰产增效。荧光假单胞菌防治稻瘟病的研究与应用是水稻生产可持续发展的需要，可以满足联合国世界粮食组织关于粮食安全发展的要求，但是本领域中还缺少对水稻稻瘟病具有广谱且高效防效、抗菌活性物质产量高的荧光假单胞菌菌株。技术实现要素：为了解决上述农业生产存在的技术问题及现有技术的不足，本发明提供了一株对水稻稻瘟病有良好防效、并且对多种植物病原菌有显著抑菌作用的荧光假单胞菌菌株。为达此目的，本发明采用以下技术方案。在第一方面，本发明提供一株荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)s149，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期为2019年3月1日，保藏编号为cgmccno.17278。在第二方面，本发明提供一种菌剂，其包含如第一方面所述的荧光假单胞菌s149。在第三方面，本发明提供一种防治稻瘟病的方法，其包括将如第一方面所述的荧光假单胞菌s149或如第二方面所述的菌剂施用于水稻作物。在本发明的防治稻瘟病方法中，所述菌剂为所述荧光假单胞菌s149的培养液。在本发明的防治稻瘟病方法中，稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟中的一种或几种。在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的荧光假单胞菌s149或如第二方面所述的菌剂在防治稻瘟病中的用途。在本发明的防治稻瘟病的用途中，稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟中的一种或几种。本发明的有益效果如下：本发明提供的荧光假单胞菌s149对水稻稻瘟病有良好防效、并且对多种植物病原菌有显著抑菌作用、防治效率高。本发明提供的荧光假单胞菌s149对水稻稻瘟病具有广谱且高效防菌、抗菌能力，其对我国不同品系的水稻均有很好的稻瘟病防治效果，能够更大限度的降低水稻产业在近采收期因为突发病害造成的产量损失。本发明提供的荧光假单胞菌s149对水稻促生、促产效果较好。本发明提供的荧光假单胞菌s149对多种抗生素不敏感，施用抗生素药品或肥料后，依然能够保持其防治效果。本发明提供的荧光假单胞菌s149对水稻主要防御酶进行系统的诱导，使防御酶的活性显著提高。保藏信息本发明分离鉴定的荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)，命名为荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)s149，己于2019年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmccn0.17278。附图说明构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:图1是本发明的荧光假单胞菌s149菌株在kb培养基平板上的培养形态。图2是本发明的荧光假单胞菌s149菌株与稻瘟病菌p131的平板对峙图片。图3是本发明的荧光假单胞菌s149发酵培养液和胞外代谢粗提物对稻瘟病菌p131的平板对峙图片。图4是本发明的荧光假单胞菌s149发酵培养液和胞外代谢粗提物对稻瘟病菌侵染结构抑制的图片。图5是本发明的荧光假单胞菌s149对水稻幼苗防御酶pod的影响。图6是本发明的荧光假单胞菌s149对水稻幼苗防御酶ppo的影响。图7是本发明的荧光假单胞菌s149对水稻幼苗防御酶sod的影响。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。实施例1荧光假单胞菌s149菌株的分离及筛选方法如下：(1)样品采集：采集样品为水稻品种宁粳48号根围土壤，地点为宁夏回族自治区平罗县姚伏镇沙渠村，连同水稻的根系一起拔出，用采集袋装好，放在冰盒中带回实验室分离。(2)分离方法：称取1g根围土壤，放入100ml无菌水中常温下振荡混匀1h，用无菌水按照10、102和103梯度稀释，吸取梯度稀释液涂布于kb琼脂培养基平板上，待吹干后，在30℃的恒温培养箱中倒置培养48h。挑取单菌落，在kb琼脂培养基平板上梯度划线再次获得单菌落，将获得的单菌落保存于40％甘油中，于﹣80℃超低温冰箱中保存备用。(3)荧光假单胞菌的筛选：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌p131菌饼，1d后在菌饼两侧相距2cm处接种荧光假单胞菌(划线2cm)作对峙培养，设置空白对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图2。king’sb琼脂培养基(kb)：蛋白胨20g，甘油10ml，k2hpo41.5g，mgso4·7h2o1.5g，琼脂20.0g，ph7.2±0.1，121℃灭菌20min。番茄燕麦培养基：燕麦片30g，加水1000ml，在沸水浴上加热1h，纱布过滤后加入0.4g无水碳酸钙和150ml番茄汁，加水补足1000ml，加琼脂粉17-20g后分装灭菌(121℃，20min)。经鉴定，该荧光假单胞菌菌株特征如下：白色，不透明，细胞为革兰氏阴性菌，杆状，(0.7～0.8)μm×(2.3～2.8)μm，有数根极生鞭毛，不产生芽胞，能分泌黄绿色荧光色素而发出荧光。发明人已将本菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc),保藏日期为2019年3月1日，保藏编号为cgmccno.17278。实施例2荧光假单胞菌s149菌株的生物活性测定：(1)荧光假单胞菌s149发酵培养液对稻瘟病菌的抑菌测定：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌p131菌饼，菌饼两侧相距2cm处放置无菌牛津杯，杯中分别加入荧光假单胞菌s149的发酵液作对峙培养，以无菌kb液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图3。(2)荧光假单胞菌s149胞外代谢产物粗提物对稻瘟病菌的抑菌测定：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌p131菌饼，菌饼两侧相距2cm处放置无菌牛津杯，杯中分别加入胞外代谢产物粗提物作对峙培养，以无菌kb液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图3。king’sb液体琼脂培养基(kb)：蛋白胨20g，甘油10ml，k2hpo41.5g，mgso4·7h2o1.5g，ph7.2±0.1，121℃灭菌20min。胞外代谢产物粗提物的制备：将已活化24h的供试菌株s149单菌落分别接种至装有100mlking’sb培养液的500ml三角瓶中，28℃、180rpm/min震荡培养24h后，作为二级种子液备用。再将二级种子液按1％的接种量接种到装有100mlking’sb培养液的500ml三角瓶中，28℃、180rpm/min震荡培养72h，得到细菌菌株的带菌培养液。最后将所得带菌培养液在4℃、12000rpm/min离心15min去除菌体，上清液经过滤(0.22μm)除菌，获得胞外代谢产物粗提液。表1荧光假单胞菌s149菌株与稻瘟病菌的对峙培养注:表中的实验数据为三次重复的平均值±标准误。(3)荧光假单胞菌s149菌株在温室盆栽条件下的生防效果：挑选健康水稻品种g19，1％次氯酸钠溶液消毒10min，70％酒精浸泡1cm，无菌水冲洗5次，28℃人工气候箱催芽，待芽长到1cm时播种于塑料小水桶里(水桶底部直径18cm×高21cm×水桶上部直径24.5cm)。种植28d后喷施待测荧光假单胞菌s149发酵液，菌体浓度为1×108cfu/ml，每个水桶喷施20ml，每个处理4个重复。24h后接种稻瘟病菌孢子悬浮液，孢子浓度为1×106cfu/ml。7d后调查叶瘟发生情况，计算病情指数和防效大小，结果见表2。调查方法按《农药田间药效试验准则(一)》，稻瘟病叶瘟调查分级标准，0级：无病；1级：仅有的针尖大小的褐点；3级：小而圆以致稍长的褐色坏死灰斑，直径1～2mm；5级：典型的稻瘟病斑，受害面积小于10％；7级：典型的稻瘟病斑，受害面积为26％～50％；9级：全面叶片死亡。稻瘟病穗颈瘟调查分级标准，0级：无穗颈瘟、粒瘟和枝梗瘟；1级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数＜5％；2级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为6％～10％；3级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为11％～20％；4级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为21％～30％；5级：有穗颈瘟、粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为21％～30％；6级：穗颈瘟造成瘪粒数＞80％。生防效果计算公式：表2荧光假单胞菌s149在温室条件下对叶瘟的防治效果测定处理病情指数防治效果(％)s1496.67±0.56b79.98±0.42稻瘟病菌p131对照33.61±2.46a/注：显著性分析采用最小极差法(lsd)(p≤0.05±标准误)。(4)荧光假单胞菌s149菌株在田间试验条件下的生防效果：供试菌株活化48h，接种于1000ml的种子培养基中，37℃，200r/min振荡培养12h制备种子液，按6％的接种量接种到发酵罐中，37℃、200r/min震荡培养48h后，制备供试菌株发酵液。在平罗县姚伏镇进行荧光假单胞菌s149的田间药效试验，分别在水稻播种10、35、60、75和95d喷雾供试菌剂的发酵培养液，在种植60d调查水稻叶瘟的发生情况，在种植110d调查穗瘟的发生情况。叶瘟调查：每试验小区随机取3点，每点调查20穴，每株调查水稻倒4叶。穗颈瘟调查：每小区取5点，每点调查20株，共100株。每个试验小区面积是50m2，小区随机排列，每个处理4个重复。结果见表3。表3荧光假单胞菌s149菌株对稻瘟病的大田防治效果注：显著性分析采用最小极差法(lsd)(p≤0.05±标准误)。水稻品种是宁粳47号。(5)荧光假单胞菌s149菌株对水稻秧苗的促生能力：选取健康且长势一致的水稻种子g19放入荧光假单胞菌s149的发酵培养液中浸种0.5h后取出放在铺有滤纸的培养皿内，在28℃，rh为70％的人工气候箱培养，48h后调查种子露白数量。每个处理重复3皿。取健康且长势一致的水稻种子放入荧光假单胞菌s149的发酵培养液中浸种0.5h后播种于水稻育秧池中，生长10天后调查水稻秧苗的根长和株高，结果见表4。表4荧光假单胞菌s149对水稻秧苗的促生能力注：显著性分析采用最小极差法(lsd)(p≤0.05±标准误)。(6)荧光假单胞菌s149菌株对多种植物病原菌的拮抗作用：在pda培养基平板上中央放置尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓炭疽病菌、苹果叶枯病菌、海棠叶枯病菌、烟草黑胫病菌、草莓叶枯病菌、小麦立枯丝核菌的菌饼(1cm)，分别在菌落边缘两侧相距2cm处接种荧光假单胞菌s149(划线2cm)，置于培养箱28℃黑暗培养，5次重复。2-5天后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表5。表5荧光假单胞菌s149菌株对多种植物病原菌的拮抗作用病原菌相对菌丝生长抑制率(％)尖孢镰刀菌33.33±1.32茄病镰刀菌43.33±2.25串珠镰刀菌16.67±0.85西瓜枯萎病菌23.08±1.52番茄灰霉病菌22.22±1.40草莓炭疽病菌59.26±1.24苹果叶枯病菌55.26±1.15海棠叶枯病菌31.25±1.45烟草黑胫病菌46.43±2.53草莓叶枯病菌57.55±1.25(7)荧光假单胞菌s149菌株对稻瘟病菌侵染结构的抑制作用：菌株s149发酵培养液对稻瘟病菌分生孢子萌发、附着胞形成的抑制作用：培养72h的菌株s149发酵培养液与稻瘟病菌p131孢子悬浮液(1×106cfu/ml)以1∶1的比例混匀，混合液在2ml无菌离心管中28℃对峙培养24h时候，采用光学显微镜观察稻瘟病菌的菌丝、分生孢子以及附着胞的形态变化。结果见表6和图4。菌株s149无菌上清液对稻瘟病菌分生孢子萌发、附着胞形成的抑制作用：培养72h的菌株s149无菌上清液与稻瘟病菌p131孢子悬浮液(1×106cfu/ml)以1∶1的比例混匀，混合液在2ml无菌离心管中28℃对峙培养24h时候，采用光学显微镜观察稻瘟病菌的菌丝、分生孢子以及附着胞的形态变化。结果见表6和图4。表6荧光假单胞菌s149对稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成的抑菌作用(8)荧光假单胞菌s149对抗生素的敏感性：测试荧光假单胞菌s149对氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素、利福平、庆大霉素、新霉素、萘啶酮酸、硫酸链霉素、四环素和壮观霉素等11种常用抗生素的敏感性。将s149菌株在28℃、180r/min过夜震荡培养，分别涂布于含有15μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml和100μg/ml不同浓度抗生素的lb平板上，24h后观察菌株是否生长，每处理10个重复。结果见表7。表7荧光假单胞菌s149对抗生素的敏感性注：“+”表示菌株s149对该抗生素不敏感；“-”表示菌株s149对该抗生素敏感。(9)荧光假单胞菌s149水稻抗病防御酶的诱导：当温室盆栽水稻植株生长到分蘖期时(播种后14d)，按照实验设计分别将细胞浓度为1×108cfu/ml供试菌株培养液50ml/塑料盒(15个营养钵)对水稻植株进行喷雾接种处理，以后每天上午向水稻植株喷水(直至叶片有水膜和水珠)，并向空气中喷水，保持试验环境有较高的湿度。分别于接种后的1d、2d、3d、5d和7d取水稻叶片进行酶活性测定。取各处理的水稻叶片1.0g放入研钵中，加入5ml0.05m磷酸缓冲液(ph6.8)和0.1g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)及极少量石英砂，在液氮中研磨成匀浆，在冰上进行研磨，将混合液于4℃在7000rpm离心25min，离心后的上清液即为待测粗酶液，放置在﹣80℃的冰箱中贮存备用。pod活性测定时，反应混合液中含有2.65ml0.05m磷酸缓冲液(ph6.8)；0.1ml0.18m愈疮木酚，0.2ml0.03mh2o2(测试时再加入)，0.05ml酶液，20℃下反应5min，470nm处测定od值，酶活性以u/g/min为酶活性单位。这些过程全部在冰上进行，防止酶失活。测定时用紫外分光亮度计，最后加入h2o2马上测量，每30s测一次，共3min，结果见图5。ppo活性测定时，反应体系中加入4.4ml0.05m磷酸缓冲液(ph6.8)，0.5ml150μm邻苯三酚，0.1ml酶液，20℃反应10min加入0.5ml15％h2so4中止反应，测定420nm处od值，整个操作过程都在0～4℃进行，以u/g/min为酶活性单位，结果见图6。其中，δod470:470nm处光照对照管与样品管的光密度差值；△od420:420nm处光照对照管与样品管的光密度差值；t：酶作用的时间(min)；vt：样液总体积(ml)；v1：测定时样品用量(ml)；fw:样品鲜重(g)。超氧物歧化物氧化酶(sod)测定：取各处理的水稻叶片1.0g放入研钵中，加入5ml0.05m磷酸缓冲液(ph7.8)和0.1gpvp及少量的石英砂，在液氮中研磨成匀浆，于4℃，13000rpm离心20min，上清液即为待测粗酶液。测定时先吸取2.2ml0.05m磷酸缓冲液，然后加入0.1ml6×10-5m核黄素，0.3ml0.13m甲硫氨酸，0.1ml3×10-6medta，0.2ml1.25×10-3mnbt，最后加入0.1ml酶液(对照加入0.1ml磷酸缓冲液代替)。然后立即在4000lux光照下(荧光灯即可)25℃反应25min，黑暗下中止反应，在560nm处测定od值，以抑制nbt光化反应还原50％为一个酶活性单位，结果见图7。其中，ck对照od值：光照对照管的光密度值；处理od值：样品管的光密度值。(10)荧光假单胞菌s149菌株生防活性物质检测：淀粉酶的检测：取新活化的单菌落接种于含有0.2％可溶性淀粉的lb平板上，培养48h，形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥式碘液染色10min，用70％乙醇洗板，能产生淀粉酶的菌株，在黑色的背景下，其菌落生长处周围可形成无色的透明圈，如果有透明圈表明菌株可以产生淀粉酶，每个处理3个重复，结果见表8。蛋白酶的检测：将活化的待测菌株穿刺接种于1％脱脂牛奶琼脂平板上，30℃培养24、48、72h后观察外围透明圈的产生，出现透明圈表明有蛋白酶的产生，每个处理3个重复，结果见表8。葡聚糖酶检测：待测菌接种于含有abp培养基的平板上，30℃培养48、72h后，观察平板中是否出现消解圈，若有消解圈产生则表明有葡聚糖酶的产生，每个处理3个重复，结果见表8。嗜铁素检测：嗜铁素用cas培养基检测，将活化的待测菌接种于cas检测培养基平板上，30℃培养72h后，观察平板中是否产生橘黄色晕圈，若出现橘黄色则表明有嗜铁素的产生，每个处理重复3次，结果见表8。纤维素酶的检测：将分离到的菌株活化后接种于纤维素筛选培养基平板上，28℃恒温倒置培养2d，用0.1％的刚果红染色液浸染10min，再用1mol/l的nacl溶液脱色5min。若菌株产纤维素酶，则会在菌落周围出现清晰的透明圈，每个处理重复3次，结果见表8。abp培养基的制作：用研钵将块状茯苓研碎成粉末，使其可通过120目的筛子，kh2po46.8g，k2pho4·12h2o17.9g，酵母提取物6.7g，茯苓粉(或β-1.3-葡聚糖)5.0g，苯胺蓝120mg，琼脂粉12g，ph值为6.8，水1l。cas培养基的制备：酪胨9g，酵母浸膏5g，枸橼酸三钠10g，磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钠1g，葡萄糖10g，琼脂20g，溶于1l水中。纤维素富集培养基(1l):nacl6g，mgso40.1g，kh2po40.5g，cacl20.1g,(nh4)so42.0g，k2hpo42.0g，琼脂15g,cmc-na5g，ph调至7.0；纤维素筛选培养基(1l):在上述纤维素酶富集培养基中加入酵母粉1g。刚果红染色液:用蒸馏水溶解刚果红，终浓度为0.1％(w/v)。刚果红脱色液:终浓度为1mol/l的naci溶液。表8荧光假单胞菌s149菌株生防活性物质检测注：数据为三次重复的检测结果；“+”是检测出结果，“-”是未检测出。需要说明的是：在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12