肉制品中鸡、鸭和鹅源性同步检测的引物和探针及试剂盒的制作方法

本发明属于食品检测
技术领域：
，尤其涉及肉制品中动物源性检测领域。
背景技术：
：肉制品除了含有丰富的常规营养成分之外，色、香、味俱佳的感官体验更是赋予其全球美食的内核。然而，伴随着日益增长的生产量和消费量和肉类之间的成本差异而产生的利润诱惑，肉制品成为在食品生产、加工、流通以及餐饮领域中造假掺假的主要目标。一些不法企业和商贩用低价肉冒充高价肉，在羊、牛、鹿等高价肉制品中掺杂鸡、鸭和鹅等低价肉。我国对于肉制品真伪鉴别技术方面的研究起步晚，这一领域的研究还处于初步阶段。由此可见，当前在肉制品真伪鉴别技术方面的研究领域，实现具有我国自主产权的、安全高效的检测技术是一个充满机遇同时极具挑战的研究课题。作为羊、牛、马、驼产品基地的锡林郭勒盟迫切需要研发具有自主知识产权的鸡、鸭和鹅相关肉制品真伪鉴别技术及检测标准，以此保护地方特色羊肉产品和维护消费者的合法权益。目前，肉制品真伪鉴别相关的技术研究、检测标准、发明专利以及商业试剂盒主要集中在单一通道单一源性检测和异管检测，同时多通道多源性检测和同管检测报道较少。多通道通管检测不仅可以节省时间，同时可以减少成本。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的肉制品中鸡源性、鸭源性以及鹅源性同管检测的引物、探针及试剂盒和方法，解决肉制品中鸡、鸭和鹅源性成分定性和定量检测问题。本发明的技术方案为：肉制品中鸡源性、鸭源性以及鹅源性同管检测的引物和探针，引物和探针序列如下：三源性检测正向引物：5'caaaaggcttaagcccttt3'(seqidno.1)，鸡源性检测反向引物：5'cacggcgattaggatgg3'(seqidno.2)，鸭源性检测反向引物：5'acggcaattaagattggga3'(seqidno.3)，鹅源性检测反向引物：5'tacggcaatcaggattgg3'(seqidno.4)，鸡探针：5'accccggacatgaccctgc3'(seqidno.5)，鸭探针：5'tagctacacatgccacaaacaacaatag3'(seqidno.6)，鹅探针：5'cttc(a/t)cccatgattcaaataacaacac3'(seqidno.7)。进一步地，鸡探针、鸭探针和鹅探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为fam、hex、rox或cy5中的任意一种，淬灭基团为tamra、bhq1、bhq2或mgb中任意一种。作为本发明的另一目的，提供了一种肉制品中鸡源性、鸭源性以及鹅同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：seqidno.1所示的三源性检测正向引物，seqidno.2所示的鸡源性检测反向引物，seqidno.3所示的鸭源性检测反向引物，seqidno.4所示的鹅源性检测反向引物，seqidno.5所示的鸡探针，seqidno.6所示的鸭探针，seqidno.7所示的鹅探针，probeqpcr预混液，鸡阳性标准品，鸭阳性标准品，鹅阳性标准品。当然，也可以通过检测鸡源性以及鸭源性，为了节省成本，只需要去除鹅源性相关的试剂即可(seqidno.4所示的鹅源性检测反向引物、seqidno.7所示的鹅探针和鹅阳性标准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了一种肉制品中鸡和鸭源性检测的试剂盒，该试剂盒中含有：seqidno.1所示的三源性检测正向引物，seqidno.2所示的鸡源性检测反向引物，seqidno.3所示的鸭源性检测反向引物，seqidno.5所示的鸡探针，seqidno.6所示的鸭探针，probeqpcr预混液，鸡阳性标准品，鸭阳性标准品。当然，也可以通过检测鸡源性以及鹅源性，为了节省成本，只需要去除鸭源性相关的试剂即可(seqidno.3所示的鸭源性检测反向引物、seqidno.6所示的鸭探针和鸭阳性标准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了一种肉制品中鸡和鹅源性检测的试剂盒，该试剂盒中含有：seqidno.1所示的三源性检测正向引物，seqidno.2所示的鸡源性检测反向引物，seqidno.4所示的鹅源性检测反向引物，seqidno.5所示的鸡探针，seqidno.7所示的鹅探针，probeqpcr预混液，鸡阳性标准品，鹅阳性标准品。当然，也可以通过检测鸭源性以及鹅源性，为了节省成本，只需要去除鸡源性相关的试剂即可(seqidno.2所示的鸡源性检测反向引物、seqidno.5所示的鸡探针和鸡阳性标准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了一种肉制品中鸭和鹅源性检测的试剂盒，该试剂盒中含有：seqidno.1所示的三源性检测正向引物，seqidno.3所示的鸭源性检测反向引物，seqidno.4所示的鹅源性检测反向引物，seqidno.6所示的鸭探针，seqidno.7所示的鹅探针，probeqpcr预混液，鸭阳性标准品，鹅阳性标准品。肉制品中鸡源性、鸭源性以及鹅源性同管检测的方法，步骤如下：(1)提取肉制品的dna；(2)检测dna的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μl；(3)利用seqidno.1～seqidno.7的引物和探针对稀释dna进行多重荧光定量pcr扩增，利用鸡、鸭和鹅阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用dna提取的空白对照做提取方法的对照组；(4)real-timepcr反应结束后，设置threshold为自动，读取鸡、鸭和鹅相应探针的ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的ct；只有当阳性对照ct≤40，阴性对照和空白对照ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的ct≤40，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的ct≤40，结果判定为具有相应三源性；(5)利用鸡、鸭和鹅阳性标准品做dna定量的标准曲线；(6)利用检测肉制品的相应源性的ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。进一步地，real-timepcr扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，34s，40循环。进一步地，real-timepcr反应体系为：probeqpcr预混液10μl、seqidno.1所示的三源性检测正向引物1μl，浓度为10μm；seqidno.2所示的鸡源性检测反向引物0.33μl，浓度为10μm；seqidno.3所示的鸭源性检测反向引物0.33μl，浓度为10μm；seqidno.4所示的鹅源性检测反向引物0.34μl，浓度为10μm；seqidno.5所示的鸡探针0.5μl，浓度为10μm；、seqidno.6所示的鸭探针0.5μl，浓度为10μm和seqidno.7所示的鹅探针0.5μl，浓度为10μm；dna模板2μl，灭菌的去离子水4.5μl，总体积20μl。本发明通过比对鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、黄牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、骆驼及兔子等15种动物的线粒体基因组，每种动物选取5个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述75条序列，筛选出鸡、鸭和鹅保守和特异的序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个pcr反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量pcr反应的进行。多重实时荧光定量pcr反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的定性和定量检测。本发明研发了鸡、鸭及鹅等3通道检测引物和探针，优化多通道多源性检测和同管检测的引物和探针组合。在此过程中克服了同一pcr反应体系中多种引物和探针之间的影响以及对模板以及pcr反应资源的竞争的问题，达到pcr反应体系可以同时进行多重实时荧光pcr的效果。鸡源性探针可以检测到样品中0.25pg的鸡源性dna，鸭源性探针可以检测到样品中2.5pg的鸭源性dna，鹅源性探针可以检测到样品中1pg的鹅源性dna。说明本发明的鸡、鸭和鹅引物和探针的检测限度达到pg水平，检测的灵敏度较高。鸡探针和鸭探针都可以检测到0.1％水平混合样品。说明混合探针(鸡、鸭以及鹅)具有鸡源性、鸭源性以及鹅源性同管检测能力。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的引物、探针及试剂盒的特异性强、灵敏度高，可以实现肉制品中鸡、鸭和鹅源性的定性和定量检测，并且可以进行鸡、鸭和鹅的同时检测，节省了工序，降低了成本。附图说明图1利用fam和tamra修饰探针标记鸡源性、hex和tamra修饰探针标记鸭源性及rox和mgb修饰探针标记鹅源性对照对鸡、鹌鹑、鸽子、黄牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、骆驼及兔子等13种动物肌肉组织(其它肉)进行的实时荧光定量pcr的检测，鸡肉中出现扩增曲线，其它肉都没有出现扩增曲线，说明鸡源性引物和探针具有特异性。图2利用fam和tamra修饰探针标记鸡源性、hex和tamra修饰探针标记鹅源性及rox和mgb修饰探针标记鹅源性对鸭、鹌鹑、鸽子、黄牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、骆驼及兔子等13种动物肌肉组织(其它肉)进行的实时荧光定量pcr的检测，鸭肉中出现扩增曲线，其它肉都没有出现扩增曲线，说明鸭源性引物和探针具有特异性。图3利用fam和tamra修饰探针标记鸡源性、hex和tamra修饰探针标记鹅源性及rox和mgb修饰探针标记鹅源性对鹅、鹌鹑、鸽子、黄牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、骆驼及兔子等13种动物肌肉组织(其它肉)进行的实时荧光定量pcr的检测，鹅肉中出现扩增曲线，其它肉都没有出现扩增曲线，说明鹅源性引物和探针具有特异性。图4利用fam和tamra修饰探针标记鸡源性对鸡dna(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0005ng、0.00025ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，鸡源性探针可以检测到0.25pg的鸡源性dna。以上结果说明鸡探针在肉制品的源性检测方面具有较高的灵敏度。图5利用hex和tamra修饰探针标记鸭源性对鸭dna(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.005ng、0.0025ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，鸭源性探针可以检测到2.5pg的鸭源性dna。以上结果说明鸭探针在肉制品的源性检测方面具有较高的灵敏度。图6利用rox和mgb修饰探针标记鹅源性对鹅dna(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.005ng、0.0025ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，鹅源性探针可以检测到1pg的鹅源性dna。以上结果说明鹅探针在肉制品的源性检测方面具有较高的灵敏度。图7鸡源性检测标准曲线：用于肉制品中鸡源性的定量检测。图8鸭源性检测标准曲线：用于肉制品中鸭源性的定量检测。图9鹅源性检测标准曲线：用于肉制品中鹅源性的定量检测。图10利用fam和tamra修饰探针标记鸡源性、hex和tamra修饰探针标记鸭源性及rox和mgb修饰探针标记鹅对鸡、鸭和鹅梯度混合样品(0.1％、1％、10％、30％、40％、80％、98％和99.8％)进行鸡、鸭和鹅的同时检测，结果显示鸡探针、鸭探针和鹅探针都可以检测到0.1％水平混合样品。以上结果说明混合探针(鸡、鸭以及鹅)具有鸡源性、鸭源性以及鹅源性同时同管检测能力。图11利用fam和tamra修饰探针标记鸡源性、hex和tamra修饰探针标记鸭源性及rox和mgb修饰探针标记鹅源性对混合样品(30％鸡肉、30％鸭肉和40％鹅肉)进行鸡、鸭和鹅的同时检测，鸡源性(鸡-fam)、鸭源性(鸭-hex)及鹅源性(鹅-rox)都出现扩增曲线。以上结果说明混合探针(鸡、鸭以及鹅)具有鸡源性、鸭源性以及鹅源性同时同管检测能力。具体实施方式1、检测方法：(1)提取肉制品的dna，设立提取空白对照(后续做提取方法的对照组)。(2)检测dna的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μl。(3)利用多重荧光定量pcr引物和探针对稀释dna进行扩增检测，利用鸡、鸭和鹅阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用dna提取的空白对照做提取方法的对照组，real-timepcr反应体系如表1所示，real-timepcr扩增参数如表5所示。表1real-timepcr反应体系(鸡、鸭和鹅的同时检测)成分体积(微升)probeqpcr预混液10三源性检测正向引物1鸡源性检测反向引物0.33鸭源性检测反向引物0.33鹅源性检测反向引物0.34鸡探针0.5鸭探针0.5鹅探针0.5dna2灭菌的去离子水4.5总体积20表2real-timepcr反应体系(鸡和鸭同时检测)成分体积(微升)probeqpcr预混液10三源性检测正向引物1鸡源性检测反向引物0.5鸭源性检测反向引物0.5鸡探针0.5鸭探针0.5dna2灭菌的去离子水5总体积20表3real-timepcr反应体系(鸡和鹅同时检测)成分体积(微升)probeqpcr预混液10三源性检测正向引物1鸡源性检测反向引物0.5鹅源性检测反向引物0.5鸡探针0.5鹅探针0.5dna2灭菌的去离子水5总体积20表4real-timepcr反应体系(鸭和鹅同时检测)表5real-timepcr扩增参数(4)real-timepcr反应结束后，设置threshold为自动，读取鸡、鸭和鹅相应探针的ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的ct；只有当阳性对照ct≤40，阴性对照和空白对照ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的ct≤40，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的ct≤40，结果判定为具有相应三源性。(5)利用鸡、鸭和鹅阳性标准品(稀释101到107倍)做dna定量的标准曲线。(6)利用检测肉制品的相应源性的ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。2、引物和探针序列的设计由于线粒体在组织中的拷贝数高，而且在肉制品中相对稳定，所以选择线粒体基因设计鸡、鸭和鹅检测引物和探针。引物和探针的合成方法：委托北京睿博兴科生物公司按照发明的序列进行合成和纯化。三源性检测正向引物：5'caaaaggcttaagcccttt3'(seqidno.1)，鸡源性检测反向引物：5'cacggcgattaggatgg3'(seqidno.2)，鸭源性检测反向引物：5'acggcaattaagattggga3'(seqidno.3)，鹅源性检测反向引物：5'tacggcaatcaggattgg3'(seqidno.4)，鸡探针：5'accccggacatgaccctgc3'(seqidno.5)，鸭探针：5'tagctacacatgccacaaacaacaatag3'(seqidno.6)，鹅探针：5'cttc(a/t)cccatgattcaaataacaacac3'(seqidno.7)；鸡、鸭和鹅探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为fam、hex、rox或cy5中的任意一种，所述淬灭基团为tamra、bhq1、bhq2或mgb中任意一种。3、引物和探针的特异性检测单源性检测的real-timepcr反应体系如下表所示成分体积(微升)probeqpcr预混液10三源性检测正向引物1鸡或鸭或鹅源性检测反向引物1相应源性探针1dna2灭菌的去离子水5总体积20利用fam和tamra修饰探针标记鸡源性、hex和tamra修饰探针标记鸭源性及rox和mgb修饰探针标记鹅源性对鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、黄牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、骆驼及兔子进行qpcr的检测。检测结果如下：ct值：平均值(三组数据)±标准差；-:没有检测到信号结果说明：ct小于40(不为0)说明样品中有相应源性。检测结果符合样品动物来源。在鸡肉中检测出鸡源性，在鸭肉中检测出鸭源性，在鹅肉中检测到鹅源性，而在其他肉中没有检测到鸡、鸭和鹅源性。4、相应源性检测的引物和探针的检测限度实验将鸡的基因组dna分别稀释101到107倍以及0.0005和0.00025(共10个模板浓度梯度)，将鸭的基因组dna分别稀释101到107倍以及0.005和0.0025(共10个模板浓度梯度)，将鹅的基因组dna分别稀释101到107倍以及0.0005和0.00025(共10个模板浓度梯度)进行引物和探针的检测限度扩增实验。由以下结果可知，鸡源性探针可以检测到样品中0.25pg的鸡源性dna，鸭源性探针可以检测到样品中2.5pg的鸭源性dna，鹅源性探针可以检测到样品中1pg的鹅源性dna。以上结果说明自主研发的鸡、鸭和鹅引物和探针的检测限度达到fg水平，检测的灵敏度较高。检测结果如下：ct值：平均值(三组数据)±标准差；n/a:不适用于检测；-:没有检测到信号5、利用fam和tamra修饰探针标记鸡源性、hex和tamra修饰探针标记鸭源性及rox和mgb修饰探针标记鹅源性对鸡肉、鸭肉和鹅肉梯度混合样品(0.1％、1％、10％、30％、40％、80％、98％和99.8％)进行鸡、鸭和鹅的同时检测。检测结果如下：ct值：平均值(三组数据)±标准差结果说明：ct小于40(不为0)说明样品中有相应荧光对应源性。结果显示鸡探针和鸭探针都可以检测到0.1％水平混合样品。以上结果说明混合探针(鸡、鸭以及鹅)具有鸡源性、鸭源性以及鹅源性同管检测能力。6、试剂盒制作(1)鸡源性、鸭源性和鹅源性同步检测试剂盒试剂如下表所示：(2)鸡源性和鸭源性同步检测试剂盒试剂如下表所示：试剂说明probeqpcr预混液反应体系(酶、dntp、mg2+)三源性检测正向引物浓度为10μm鸡源性检测反向引物浓度为10μm鸭源性检测反向引物浓度为10μm鸡探针浓度为10μm鸭探针浓度为10μm鸡阳性标准品浓度为100ng/μl，用于鸡阳性对照及标准曲线鸭阳性标准品浓度为100ng/μl，用于鸭阳性对照及标准曲线灭菌的去离子水补充反应体系(3)鸡源性和鹅源性同步检测试剂盒试剂如下表所示：(4)鸭源性和鹅源性同步检测试剂盒试剂如下表所示：试剂说明probeqpcr预混液反应体系(酶、dntp、mg2+)三源性检测正向引物浓度为10μm鸭源性检测反向引物浓度为10μm鹅源性检测反向引物浓度为10μm鸭探针浓度为10μm鹅探针浓度为10μm鸭阳性标准品浓度为100ng/μl，用于鸡阳性对照及标准曲线鹅阳性标准品浓度为100ng/μl，用于鸭阳性对照及标准曲线灭菌的去离子水补充反应体系。当前第1页12