表皮葡萄球菌MLST分型在法医微生物鉴定中的应用的制作方法

本发明属于法医微生物鉴定领域，涉及表皮葡萄球菌mlst分型在法医微生物鉴定中的应用。
背景技术：
：近年来，法庭科学研究领域中对人体生物物证的研究已取了巨大的成就，其中dna证据已经成为各类案件物证中最有力的证据之一。但是随着犯罪人员反侦查能力的提高，在案事件中能够提取到有价值的dna的难度越来越大，再加上一些疑难案件遗留在现场的生物物证含量及其微小，检出成功率低，迫使必须开发寻找新的技术方法应用到法庭科学领域。其中非人源生物物证的研究已成为当下法庭科学研究的热点和亟待加强的领域。而微生物生物物证，因其存在的普遍性、灵敏性和特异性，近年来逐渐成为法庭科学研究的新热点领域。最新的研究表明人体皮肤表面分布的细菌的数量和多样性远远超过以前人们的估计，并且人体体表的细菌群落分布有极高的个体差异，犹如每个个体都拥有一套独特的“微生物指纹”(microbialfingerprint)。这些人体体表附着的细菌可以在接触过程中转移到客体表面，并且经过转移的细菌由于对环境压力的高抵抗性，可以在接触客体上保存相当长的时间。而在人体体表附着的细菌群落(“微生物指纹”)跟一个人的皮肤上微环境和生活习惯息息相关，加之细菌繁殖力非常强大，即使在洗手之后也可以很快恢复。也就是说人体体表的微生物群落与该个体所接触过的客体表面的微生物群落有一定的相关性。noah等人预测,可以利用人体皮肤微生物作为法医学个体识别的依据。目前法医微生物的研究已不仅仅停留在微生物生理生化表型分析上，而是快速进入了“基因组时代”，这些技术的发展可以使人们在分子水平甚至是基因组水平研究微生物的多样性和复杂性，为法医微生物学的鉴定溯源提供有力的技术支持。但是对于应用快速检验鉴定的基层办案单位来说，基于高通量测序技术的微生物基因组学分析必然面临海量微生物测序和数据统计分析,工作量巨大,成本很高。这不论在财力上还是时间上对于在公安上的推广应用都是巨大的障碍。不能满足法庭科学对于鉴定结果快速准确的实际需求。多位点序列分析技术(multilocussequencetyping，mlst)，是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，通过pcr扩增多个管家基因内部片段，测定其序列，分析菌株的变异，从而进行分型。mlst是由多位点酶电泳(mlee)衍生出来的一种分型方法，由maiden等研究设计，于1998年首先应用于自然变异的脑膜炎奈色球菌(neisseriameningitides)，后来被广泛应用于其它病原菌、环境菌和真核生物中。mlst分型的原理：通过测定6-10个管家基因内部400-600bp的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱，也就是这株菌的序列型(sequencetype，st)。这样得到的每个st值均代表一组单独的核苷酸序列信息。通过比较st值可以发现菌株的差异性mlst分析方法：mlst技术针对看家基因设计引物对其进行pcr扩增和测序，得出每个菌株各个位点的等位基因数值，然后进行等位基因图谱(allelicprofile)或序列类型(sequencetypes，sts)鉴定，再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵(matrixpair-wisedifferences)等方法构建系统树图进行聚类分析。mlst分析方案设计要素：(1)选择经过初步筛选的菌株；(2)选择具有独特特征的基因位点；(3)设计用于基因扩增和序列测定的引物。实际运用中，对于已有的成熟mlst方案的细菌，可直接从mlst数据库(http://pubmlst.org/)中获取分型方案。与传统分子生物学分型方法相比，mlst具有更高的分辨力，能将同种细菌分为更多的亚型，并确定不同st型之间的系统发育关系以及与疾病的联系。mlst操作简单，结果能快速得到并且便于不同实验室的比较，已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究。随着测序速度的加快和成本的降低，以及分析软件的发展，mlst逐渐成为细菌的常规分型方法。mlst越来越多的被作为能进行国际间菌株比较的常用工具。mlst目前已经成为了细菌分子流行病学研究的一种重要方法，可通过数据库与其它国家和地区的研究结果进行比对，从而更加全面的认识本地区细菌流行的特征。表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)是滋生于人体表皮肤上的大量存在的一种革兰氏阳性细菌。在人体的皮肤，鼻腔,阴道等部位寄生，属正常菌群类型。对抗生素不敏感。在皮损或创口处最为常见。同时，也可以通过人体的活动转移到环境和空气中。也就是说，它具有在很正常人群中分布的广泛性，可转移性，这些特点使得我们认为它可能会是一个良好的法医微生物个体识别标签。目前对于表皮葡萄球菌的研究主要是集中于其作为医院的一种重要感染菌而进行的流行病学调查。表皮葡萄球菌是否具备在健康人群中个体间的高度差异性，是否存在地域差异性，表皮葡萄球菌是否会随着同一个体的区域移动和时间推移发生变异，这些问题是决定表皮葡萄球菌能否真正成为法医鉴定的个体识别微生物标签的关键。技术实现要素：为了在法医领域进行个体鉴定，寻找个体识别微生物标签，本发明提供如下技术方案：本发明的一个目的是提供如下用途。本发明提供了如下1)-5)中任一中的应用：1)表皮葡萄球菌在作为法医个体识别的微生物标签中的应用；2)表皮葡萄球菌作为微生物标签在法医个体识别中的应用；3)表皮葡萄球菌作为微生物标签在法医鉴定追溯个体来源中的应用；4)对表皮葡萄球菌进行mlst分型的物质在制备法医鉴定个体产品中的应用；5)对表皮葡萄球菌进行mlst分型的物质在制备法医鉴定追溯个体来源产品中的应用。上述表皮葡萄球菌来源于健康人体表。本发明另一个目的是提供一种获得法医个体识别的微生物标签的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：对多个待测个体的体表微生物分别进行mlst分型，得到多个个体的体表微生物的st值，若所述体表微生物的st值在所述多个待测个体中有差异，则所述体表微生物为或候选为法医个体识别的微生物标签。上述方法中，所述对多个待测个体的体表微生物分别进行mlst分型的方法包括如下步骤：1)分离鉴定多个待测个体的体表微生物；2)用所述体表微生物的管家基因对应的mlst引物分别扩增所述体表微生物，得到管家基因的扩增产物；3)将所述管家基因的扩增产物测序，再将测序结果提交mlst数据库比对后确定管家基因的等位基因谱；再根据所述管家基因的等位基因谱确定每个待测个体的体表微生物的st值，实现mlst分型。上述方法中，所述体表微生物为1种或多种；或，所述管家基因为1个或多个。在本方面的实施例中，所述体表微生物为体表的表皮葡萄球菌；所述管家基因为如下7个基因：氨基甲酸酯激酶编码基因arcc、苯卓酸脱氢酶编码基因aroe、abc转运体编码基因gtre、dna错配修复蛋白编码基因muts、嘧啶操纵子调控蛋白编码基因pyrr、磷酸丙糖异构酶编码基因tpia和乙酰辅酶a乙酰转移酶编码基因yqil。其对应的mlst引物如表1所示。由上述方法制备的法医个体识别的微生物标签也是本发明保护的范围。如下应用均是本发明保护的范围：上述获得法医个体识别的微生物标签的方法在法医区别不同待测个体中的应用；上述方法获得法医个体识别的微生物标签在法医区别不同待测个体中的应用；上述方法获得法医个体识别的微生物标签在法医鉴定追溯个体来源中的应用；上述方法获得法医个体识别的微生物标签在制备法医区别不同待测个体产品中的应用；上述方法获得法医个体识别的微生物标签在制备法医鉴定追溯个体来源产品中的应用。上述应用为：对所述微生物标签进行mlst分型，获得不同待测个体的微生物标签的st值，实现区别不同待测个体。本发明另一个目的是提供一种法医区别不同待测个体的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)用上述鉴定个体的微生物标签的方法获得法医个体识别的微生物标签；2)对所述微生物标签进行mlst分型，获得不同待测个体的微生物标签的st值，实现区别不同待测个体。本发明第3个目的提供一种法医区别不同待测个体的方法。本发明提供的法医区别不同待测个体的方法，包括如下步骤：对待测人体体表皮葡萄球菌进行mlst分型，获得不同待测个体的表皮葡萄球菌的st值，实现法医区别不同待测个体。本发明第3个目的是提供一种鉴定或区别个体识别的产品。本发明提供的鉴定或区别个体产品，包括对法医个体识别的微生物标签进行mlst分型的物质。上述产品还包括获得法医个体识别的微生物标签的物质。上述物质为对个体的微生物进行mlst分型的物质和检测微生物管家基因的mlst引物。上述涉及的方法和应用均为非疾病诊断治疗用途。本发明涉及到人体表皮葡萄球菌的分离鉴定、mlst分型基因的确定及其扩增，确定不同人体其皮肤表面表皮葡萄球菌的mlst具体分型,最终证明表皮葡萄球菌可以作为法医微生物个体识别的标签之一，而mlst分型方法是适用于法医微生物个体识别的鉴定方法。本发明就是在前期研究的基础上，在人体皮肤表面正常的微生物种群中筛选普遍和大量存在的具有代表性的一种或几种细菌，运用分子生物学的技术进行深入的研究，寻找到合适的细菌分子鉴定方法，验证不同的个体之间其皮肤表面的特定菌分型是否具有个体差异性，随时间变化是否具有稳定性。如果满足上述两个条件的特定细菌就视为一个有价值的微生物标签。一个微生物标签类似于人常染色体的一个等位基因座。最终通过若干个微生物标签的排列组合,组成一套可用于法医个体识别的微生物分子分型系统,最终实现通过微生物方法来进行个体识别。这种研究方法最大的优势就是针对单个或某几种细菌进行分子分型，结果可靠，分析方法简便、成熟，可以短时间内得出结果。省去了繁杂的，海量的生物信息学分析。非常适合于法庭科学的实际需求。本发明通过mlst分型研究人体皮肤表皮葡萄球菌的分子分型，不仅可以证明是否能否将表皮葡萄球菌作为可以个体识别的微生物标签，同时由于mlst还具有地域性，还可通过其分子分型揭示表皮葡萄球菌可能的地域来源，为今后法医微生物溯源提供很好的方法学储备。同时大量测序结果的获得可以为今后研究微生物标签的特异snp位点提供大量数据和参考，为今后用snp检测微生物标签，降低检验成本和使检测自动化提供技术支持。附图说明图1为作为法医鉴定微生物标签表皮葡萄球菌mlst分型流程步骤。图2为采集后样品微生物富集培养。图3为表皮葡萄球菌血平板分离纯化培养。图4为新生霉素敏感筛选表皮葡萄球菌。图5为表皮葡萄球菌16srrna的鉴定。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、表皮葡萄球菌作为法医鉴定中的微生物标签识别个体差异图1为作为法医鉴定微生物标签的表皮葡萄球菌mlst分型流程步骤。本发明的目的是这样实现的：首先对于人体皮肤表面的表皮葡萄球菌进行分离鉴定，然后是mlst分型基因的确定及其扩增，测序，最后根据测定的基因序列确定人体样品表皮葡萄球菌mlst具体分型，最终确定人体表皮葡萄球菌可作为法医鉴定中的微生物标签。一、表皮葡萄球菌的mlst分型1、表皮葡萄球菌的分离鉴定1)、采样采用棉签擦拭法，用灭菌后的无菌棉签蘸取少量无菌生理盐水对表1所示的多个犯罪嫌疑人待测个体手指指腹或者个体使用后的物品进行擦拭，然后将棉签放回配套试管中，做好标记。采集后应尽快进行第二步实验，若不能开展后续实验应放在4℃暂时保存。2)、培养将上述1)采集样品管中加入5ml7.5％氯化钠肉汤液体培养基(牛肉膏5g，氯化钠75g，胰蛋白粉10g,余量为水)，振荡混合均匀后，摇床37℃,200rpm培养24h(图2)。将培养好的液体培养物稀释法划线接种于血琼脂平板，37℃培养24h(图3)。将上述培养好的单克隆菌落，选取10-20个单克隆菌落转接扩培到7.5％氯化钠肉汤固体培养基，37℃培养24h。3)、新生霉素敏感筛选表皮葡萄球菌将第2)步获得的菌体分别接种在7.5％氯化钠肉汤固体培养基和添加了0.65μg/ml新生霉素的7.5％氯化钠肉汤固体培养基上，37℃培养24h。其中在未加新生霉素7.5％氯化钠肉汤固体培养基上生长而在含有新生霉素7.5％氯化钠肉汤固体培养基上不生长的菌落为疑似表皮葡萄球菌(图4)。4)利用16srna鉴定表皮葡萄球菌将第3)步疑似表皮葡萄球菌转接到20ml7.5％氯化钠肉汤液体培养基37℃,200rpm培养24h。提取基因组dna，以此为模板，pcr扩增16srna(primer1:agagtttgatcctggctcag,primer2:ggttaccttgttacgactt)，扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测(图5)，测序结果为序列1，在genbank上比对后确定为表皮葡萄球菌。2、pcr扩增表皮葡萄球菌mist分型的基因为以下7个基因：arcc(编码氨基甲酸酯激酶,geneid:1056966,updatedon30-jan-2018)、aroe(编码苯卓酸脱氢酶,geneid:1057358,updatedon6-sep-2017)、gtre(编码abc转运体,geneid:1056358,updatedon6-sep-2017)、muts(编码dna错配修复蛋白,geneid:1057646,updatedon30-jan-2018)、pyrr(编码嘧啶操纵子调控蛋白,geneid:1057548,updatedon20-aug-2016)、tpia(编码磷酸丙糖异构酶,geneid:1057780,updatedon30-jan-2018)、yqil(编码乙酰辅酶a乙酰转移酶,geneid:1057154,updatedon6-sep-2017)。提取1得到的表皮葡萄球菌的dna分子，用如下引物分别扩增上述7个基因。表1为表皮葡萄球菌mlst管家基因及其对应的mlst引物上表中的引物序列为各自管家基因对应的mlst引物，源自mlst数据库(http://www.mlst.net/)。其中这7个基因扩增时所使用的退火温度分别为：arcc(65℃)、aroe(63℃)、gtre(63℃)、muts(53℃)、pyrr(53℃)、tpia(60℃)、yqil(58℃)。得到7个基因的扩增产物(得到目的条带)。3、mlst分型的确定将上述7个基因的扩增产物双向测序，得到7个基因的测序结果。将7个基因的测序结果提交mlst数据库(http://www.mlst.net/)比对后确定每个基因的等位基因谱(表2的第1-8列)。根据7个基因的等位基因谱确定样品中表皮葡萄球菌st型(表2的第9列)。表2为表皮葡萄球菌基因的等位基因谱及st分型的确定可以看出，8个待测人的表皮葡萄球菌mist分型结果完全不同，因此，表皮葡萄球菌mlst分型可以用于鉴别或区分不同待测人。表皮葡萄球菌可作为法医个体识别的微生物标签。表皮葡萄球菌mlst分型结果的st值可以用于法医鉴定中不同个体识别。二、表皮葡萄球菌mlst分型在法医鉴定微生物标签的个体稳定性研究1、表皮葡萄球菌mlst分型对生活在同一空间内的不同个体之间的检测采用一的方法，检测表2中同一空间(某高校大三同一宿舍；共同生活三年)不同个体表皮葡萄球菌mlst分型。结果如表3所示，表3为同一空间(某高校大三同一宿舍)不同个体表皮葡萄球菌mlst分型的等位基因谱及st分型姓名arccaroegtremutspyrrtpiayqilst任某某152621673孙某1219511421751王某某3016055458826徐某某211121159杨某2132417307戎某112624233540从上述结果可以看出，长期生活在同一空间内的不同个体之间互不影响，各自保持自己的st型不变。2、表皮葡萄球菌mist分型对同一个体不同时空的监测采用一的方法，检测表4中同一个体不同时空表皮葡萄球菌mlst分型。结果如表4所示，可以看出，同一个体不同时空表皮葡萄球菌mlst分型不变。表4为同一样品不同时间表皮葡萄球菌mlst分型研究基于这些研究结果可以确定表皮葡萄球菌可作为法医鉴定微生物标签。因此，从上述可以获得一种法医个体识别的微生物标签的确定方法，包括如下步骤：1)分离鉴定多个待测个体体表的微生物，2)mlst引物扩增所述微生物的相应管家基因，得到相应基因的扩增产物；3)将所述相应基因的扩增产物测序，再将测序结果提交mlst数据库比对后确定每个相应基因的等位基因谱；再根据所述相应基因的等位基因谱确定样品中所述微生物的st值，若多个待测个体对应的所述微生物的st值不同，则该微生物为法医个体识别的微生物标签。可以用该法医个体识别的微生物标签去鉴定不同个体，也可以用该法医个体识别的微生物标签去追溯个体地域来源，具体用该微生物标签的mlst分型的st值去区分不同个体，或者与不同地域个体进行比较。sequencelisting<110>公安部物证鉴定中心中国石油大学（北京）保定市公安局<120>表皮葡萄球菌mlst分型在法医微生物鉴定中的应用<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>997<212>dna<213>artificialsequence<400>1gggccgtgcggcatgctatacatgcaagtcgagcgaacagacgaggagcttgctcctctg60acgttagcggcggacgggtgagtaacacgtggataacctacctataagactgggataact120tcgggaaaccggagctaataccggataatatattgaaccgcatggttcaatagtgaaaga180cggttttgctgtcacttatagatggatccgcgccgcattagctagttggtaaggtaacgg240cttaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactggaactgag300acacggtccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatgggcgaaagcc360tgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggtcttcggatcgtaaaactctgttattagg420gaagaacaaatgtgtaagtaactatgcacgtcttgacggtacctaatcagaaagccacgg480ctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattg540ggcgtaaagcgcgcgtaggcggttttttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgt600ggagggtcattggaaactggaaaacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgt660agcggtgaaatgcgcagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctg720taactgacgctgatgtgcgaaagcgtggggatcaaacaggattagataccctggtagtcc780acgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaa840cgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacg900gggacccgcacaagcggtggagcatgtgggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttac960caaatcttgacatcctctgacccctctagagatagag997<210>2<211>23<212>dna<213>artificialsequence<400>2tgtgatgagcacgctaccgttag23<210>3<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>3tccaagtaaacccatcggtctg22<210>4<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>4cattggattacctctttgttcagc24<210>5<211>19<212>dna<213>artificialsequence<400>5caagcgaaatctgttgggg19<210>6<211>23<212>dna<213>artificialsequence<400>6cagccaattcttttatgactttt23<210>7<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>7gtgattaaaggtattgatttgaat24<210>8<211>23<212>dna<213>artificialsequence<400>8gatataagaataagggttgtgaa23<210>9<211>23<212>dna<213>artificialsequence<400>9gtaatcgtctcagttatcatgtt23<210>10<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>10gttactaatacttttgctgtgttt24<210>11<211>26<212>dna<213>artificialsequence<400>11gtagaatgtaaagagactaaaatgaa26<210>12<211>23<212>dna<213>artificialsequence<400>12atccaattagacgctttagtaac23<210>13<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>13ttaatgatgcgccacctaca20<210>14<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>14cacgcatagtattagctgaag21<210>15<211>25<212>dna<213>artificialsequence<400>15ctaatgccttcatcttgagaaataa25当前第1页12