专利名称：Lgg在制造用于预防或治疗呼吸变态反应的药物中的用途的制作方法
LGG在制造用于预防或治疗呼吸变态反应的药物中的用途相关专利及专利申请的交叉引用
本申请为继续申请且要求保护2005年4月15日申请的 美国专利申请系列号11/106，792的优先权，其全部内容通过引用而 结合于本文中。发明背景n)发明领域
本发明大体上涉及LGG在制造用于预防或治疗呼吸变态 反应的药物中的用途。 (2)相关技术描述
变态反应定义为"对正常情况下耐受的及通常认为无害 的物质的异常的超敏反应。，，变态反应的症状范围可从鼻流粘液 (runny nose)到过敏性休克。近5千万美国人患有变应性疾病，且这 些疾病的患病率正在上升。
变应性反应有两个基本阶段。第一个阶段包括对变应原 的速发型超敏反应的早期阶段的发展。在变应原第 一 次接触免疫系 统的时候，没有发生变应性反应。而是免疫系统为以后再次接触变 应原作自我准备。作为清除细胞的巨噬细胞包围并打破侵入的变应 原。然后巨噬细胞在其细胞壁上展示变应原片段给T淋巴细胞，T 淋巴细胞为身体免疫系统的主要策划者(orchestraters)。
这种识别信号加数种非识别信号(例如细胞因子)激活幼稚 (naive) T-细胞并指示T-细胞分化为T-细胞效应器亚群。变应性级联 中关4定因子为T-细胞的Th-2表型(TH-2)。 TH-2类型T-细胞特征为 分泌几种细胞因子包括白介素-4 (IL-4)、 IL-5和IL-13。然后细胞因 子IL-4和IL-13激活产生抗体亚类E (IgE)的B淋巴细胞。IgE抗体
直接对抗特殊的变应原。在效应细胞(肥大细胞和嗜碱性粒细胞)表面 上的特异性IgE抗体与变应原的相互作用触发速发型超敏反应的早期 阶段。
肥大细胞激活通常在第二次暴露于变应原后几分钟内发 生。致敏阶段期间构建的肥大细胞上的IgE抗体识别变应原并与此侵 入者结合。 一旦变应原结合于受体，肥大细胞内颗粒即释放其内含 物。这些内含物或介质为促炎症物质例如组胺、血小板活化因子、 前列腺素、细胞因子、白细胞三烯。这些介质实际上激活变态反应 发作。组胺刺激粘液产生并导致红、胂和发炎。前列腺素使气道收 缩及血管扩张。
变应性免疫反应的第二阶段特征为炎症细胞浸润，例如 变应原接触后嗜酸性粒细胞浸润入气道。T-细胞代表了致敏作用与炎 症间重要的联系，其分泌的介质不仅涉及IgE合成，而且涉及嗜酸性 粒细胞募集、激活和存活。组织肥大细胞及相邻细胞产生化学信使 发信号使循环性嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞及其它细胞迁移入组 织中且帮助对抗外来物质。嗜酸性粒细胞自身分泌的化学物质维持 了炎症，导致组织损伤并甚至募集更多免疫细胞。这个阶段可在变 应原接触后几小时-几天中任何部位发生且可持续几小时甚至几天。
呼吸变态反应是影响呼吸道的特殊变态反应类型。自鼻 至肺的气道内层结构相似且通常受类似的变应性疾病侵害。因此影 响鼻或窦的变应原也可影响肺。
例如变应性鼻炎，也称为花粉症，是由于鼻粘膜及气道 对空气中变应原的变应性反应所致。变应性鼻炎的症状通常包括鼻、 咽喉和眼发痒及频繁打喷噢。然后通常是鼻塞或流粘液。
由于呼吸道内 一部分的变应原可影响另外部分的呼吸 道，因此鼻道中鼻炎可导致哞喘，其为肺内发生的更严重的疾病。 哮喘特征为出现气道高反应性、呼吸急促、呼气喘鸣、千咳及胸部 的紧缩感(feeling of tightness in the chest)。变应原反复4矣触可维持气
道内炎性免疫反应，导致气道重建，通常称为慢性哞喘(chronic asthma)。
并非每个变应性鼻炎均发展为哮喘症状，但是显著数量的泰,变应尤其是患复发的未治疗的变态反应的患者显示肺炎症变化， 性鼻炎中约40%人群实际上彻底发展为哮喘。
如果伴有变应性鼻炎的鼻炎症发展到窦，结果可为不良 的感染称为窦炎(sinusitis)或鼻窦炎(rhino-sinusitis),其中窦不能自己 排空细菌。症状包括鼻充血、鼻流粘液、咽喉痛、发热、头痛、疲 劳和咳嗽，也包括额内、颊后疼痛，甚至牙齿和颚疼痛。
呼吸变态反应是儿童期最普遍的疾病之一。正如成人的 情况一样，儿童中呼吸变态反应最有可能以变应性鼻炎和哮喘形式 存在。
婴儿和幼儿中呼吸变态反应的预防尤为重要，因为看来 对变应原的早期变应性致敏似乎与正常免疫反应的成熟的延迟有Baena-Cagnani, Ao/e o/ Food yl〃e厂gy^4w/2wcrCMcZ/zooc/, Allergy. Clin. Immun. 1(2):145-149 (2001)。生活中早期开始的哮喘经常与特应 性有关，因此早期变应性致敏似乎也在持久性哮喘中起重要作用。 Martinez, F., Deve/op舰wf 附ee2:Zwg D/soniera a"<i JW/2腿 i^^c/wo/ C/2/Wre", Pediatr. 109:362-367 (2002)。
变应性致敏与译喘不仅具有紧密的联系，而且这种联系 看来好像具有年龄依赖性。虽然很少有儿童在生活头几年成为变应 性致敏，但是其中大多数在此期间被致敏的人在以后的生活中发展 出哞喘才羊症4犬。Martinez, F.,F"/nwes a"c/爿top/c Sem7'te^"o"f/ze Fz'raf 7e"ra Am. J. Respir. Crit. Care Med., 162:S95-S99 (2000)。因此重要的。
越来越多的证据表明许多方面的健康和疾病不仅在婴儿 期而且在怀孕期就已确定。当分娩时的免疫反应提示子宫内接触是首要致敏因素时，对于这种变应性疾病来说更是确信无疑。例如， 变应原特异性T-细胞在分娩时已经存在而早期对食物变应原的致敏作用筌定为后来发展出的呼吸变态反应的预测指标(predictors)。 Illi 等,7726 JVafwrar/ Cowrae o/Jto/ /c to爿ge 7 7ec ^yf/2e J>woc/a"o" w"/2 ^4对/z附a, Clin. Exp. Allergy 27:28-35 (1997)。 另 外，肺发育受精后很早就开始且分娩后至少持续2年或3年。因此 产前及出生后气道发育对婴儿和儿童中呼吸变态反应的发病机理均 是重要的。
也已经显示人胎JL在妊娠早期形成(develops)IgE-产生的 B细胞且能够以类似于在各种产前感染中观察到的公认的IgM反应 的方式产生响应适当的抗原刺激的IgE抗体。Weil, G等，尸"wato//w/ec^/A/^^m, J. Clin. Invest. 71 :1124-1129 (1983)。这也表明预防 产前与出生后对呼吸变应原的变应性致敏的重要性。
用于呼吸变态反应的常^见药物包括抗组织胺药、局部鼻 类固醇、解充血药和色甘酸钠溶液。作为常规药物的替代药物，益 生菌显示可能用来治疗某些类型变态反应。
益生菌为对宿主健康有利的活微生物。为<4康肠内正常 寄居(inhabitants)的乳酸杆菌属(丄acto6ac/〃w力spp.和双岐杆菌属 (说/Wo^"en'MW) spp.是益生菌的常见种类。令人遗憾的是，关于嬰 儿中益生菌补充剂的临床疗效的研究公开很少。Agostoni, C等,ES尸G/M/V Co羅她e J. Pediatr. Gastro. Nutr. 38:365-74(2004)。
授予Versalovic等的美国专利申请第20040208863号涉及一种具有抗炎活性且自乳酸杆菌分泌的化合物。该申请描述了乳 酸杆菌GG (LGG)的抑制促炎细胞因子的用途。但是该参考文献集中
在成人上且没有公开或建议在妊娠期或婴儿期给予LGG将是有益 的。
授予Isolauri等的美国专利申请第6,506,380号描述了一 种通过给予其益生菌抑制患食物变态反应的患者的食物诱导的超敏 反应的方法。但是该参考文献没有^^开益生菌治疗呼吸变态反应的 用途。另外虽然该专利讨论了用益生菌治疗嬰儿的方法，但是其没 有公开在产前及出生后治疗均具有重要性。
几个研究集中于产前及出生后给予益生菌^^人而预防婴儿 和儿童的某些变态反应。例如一个研究结论认为妊娠期及哺乳期给 予益生菌可保护婴儿免受特应性湿渗。Rautava, S等，尸ro&o"oy尸rafeWo"々a/"Wv4啤/c Lfeease Ae /—wf， J. Allergy Clin. Immunol. 109: 119-121 (2002)。虽然该研究发现益生菌组中婴儿发生特应性湿 渗的比安慰剂组更少，但是该研究推断给予益生菌"对于与特应性 和特应性疾病相关的常规治疗目标(即皮肤单刺试验结果和血清IgE 抗体)无效。，，因此，由于通过益生菌补充不影响特应性的通常标记 (markers),因此必须假定给予益生菌仅对特应性湿疹而非所有变态反 应有效。
类似的， 一个2001年的研究推断益生菌可预防特应性 湿渗，但是"益生菌组与安慰剂组之间的总浓度和抗原特异性IgE浓 度的提高频率及皮肤单刺试验阳性反应率非常相似。"Kalliomaki, M.,P/ac&o-Co"fro〃WJWa/, Lancet 357:1076-79 (2001)。此外，这些结果 建议给予益生菌虽然影响特应性湿渗，但是对其他类型变态反应不 一定有效果。发明概述
简单说来，本发明指出了 LGG的一种新用途，用于制 造预防或治疗受试者发生呼吸变态反应的药物。
本发明也指出了 LGG的一种新用途，用于制造预防或 治疗受试者的呼吸变态反应的药物。〖00025]本发明的另一个方面指出LGG的一种新用途，用于制 造预防或治疗受试者体内 一种或多种促炎细胞因子释放的药物。
另外，本发明指出了 LGG的一种新用途，用于制造预 防或治疗受试者血清IgE抗体产生的药物。
本发明也指出了 LGG的一种新用途，用于制造增加受 试者体内血清lgA抗体产生的药物。
发现由本发明完成的数个优点中，其中一个优点是，受 试者通过减轻或预防肺或气道内变态反应诱导的炎症，包括减轻气 道组织炎症和气道腔炎症而受益。本发明也能够减少粘液产生或扩 大气道。.本发明也能够减少或阻碍受试者体内一种或多种促炎细胞 因子和血清IgE抗体释放，及增加血清IgA产生。由于类似研究提 供了相反结果，这些益处令人吃惊并出乎预料。附图简述
为更完全理解本发明，目前用下列描述结合附图进行参考。
图1表示本发明利用的方案。
图2表示LGG-处理小鼠与对照组小鼠粪便中检测的 LGG比较。
图3表示LGG-处理与对照组小鼠粪便中细菌比较。
图4表示LGG对血清抗-OVA-lgE、血清抗-OVA-lgGl及血清抗-OVA-lgG2a的影响。
图5表示LGG对血清IgA抗体水平的影响。
图6表示LGG对OVA-致敏的婴儿体内各种促炎细胞因子、IFN-y(图A)、 MCP-1 (图B)、 IL-10 (图C)及IL-6 (图D)的影响。
图7表示LGG对变应性气道内单核细胞分布的影响。
图8表示抑制牛乳特异性抗体产生。
图9表明通过被动皮肤过敏试验和肥大细胞蛋白酶-1释 ;^文实验评价牛乳特异性抗体免疫效应子功能。优选实施方案详述
目前将要详细提到的是本发明实施方案，下文列出了该实施方案的 一个或多个实施例。以解释本发明而不是限制本发明的方式提供每个实施例。实际上，不偏离本发明的范围或精神对本发 明可作各种修改和变化对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，说明或描述的一个实施方案部分的特征可用于另一个实施方案从而 产生又一个实施方案。
因此本发明意图涵盖这些修改和变化，视其为进入附录 权利要求书及其等同方案的范围内。本发明的其它目标、特征及方 面随下列详细描述得以公开或变得显而易见。本领域普通技术人员 理解本讨论仅为示例性实施方案的描述，而并非意图限制本发明更 广泛的方面。定义
术语"益生菌"指对宿主健康发挥有益影响的微生物。
本文所用术语"益生素"("prebiotic")指促进益生菌生长和/或活性的不可消化的食物成分。
术语"受试者，，指任何哺乳动物，优选人。
本文所用术语"治疗，，指緩解、改善或治疗疾病或病症的病况、紊乱或症状。
术语"预防"指通过一些行为停止或抑制疾病或病症的病况、紊舌L或症状。
术语"治疗上有效量"指导致改善或治疗疾病或病症的病况、紊乱或症a犬的量。术语"产前给予"("prenatal administration")或"产前给 药"("prenatally administering")指给予未出生受试者的妊娠母亲的任 4可给药方法。
术语"出生后给予，，("postnatal administration")或"出生 后给药"("postnatally administering")指给予出生至约生后1年的受试 者的任何给药方法。
本文所用术语"婴儿配制食品"指作为母乳替代品的满 足婴儿营养需要的组合物。在美国，21 C.F.R.条款IOO、 106和107 公布的联邦法规指示了婴儿配制食品的内容。这些法规定义了致力 于提高人母乳营养和其它性质的大量营养素、维生素、矿物质及其 它成分的水平。发明
本发明发现了 LGG的一种新用途，用于制造预防或治 疗受试者发生呼吸变态反应的药物。根据本发明，当产前和/或出生 后给予未出生和婴儿期的受试者LGG可预防或治疗以后生活中呼吸 变态反应。
LGG为一种分离自健康人肠内菌丛的益生菌抹。其公开 于授予Gorbach等的美国专利第5,032，399中，其全部内容通过引用 结合于本文中。LGG耐受大多数抗生素，在酸和胆汁存在下稳定， 并易于结合于人肠道粘膜细胞。在大多数个体内存活1-3天而在30% 受试者体内存活长达7天。除了其群集(colonization)能力外，LGG也 有益于粘膜的免疫反应。LGG以检索号ATCC 53103保藏于授权保 藏单位美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。
在本发明用途中，治疗上有效量的LGG可相当于约lx104 -lxlO12 cfo/L/kg/天。在另一个实施方案中，本发明包括给予约lx106 -lxlO9 cfWL/kg/天的LGG。在又一个实施方案中，本发明包括给予约 lxl08 cftj/L/kg/天的LGG。只要给予治疗上有效量的LGG，而给予LGG的形式并 非本发明用途的关键。对于产前给药，LGG可给予未出生受试者的 妊娠母亲且可由此递送给未出生受试者。产前给药可以补充剂 (supplement)形式给予母亲。例如可以丸剂、片剂、胶嚢、小胶嚢 (caplet)、粉剂、液体或凝胶的形式摄入LGG。在这个用途的实施方 案中，可与其他营养补充剂例如维生素联用摄入LGG补充剂。在另一个实施方案中，可将产前给予的LGG胶嚢化包 封于糖、脂肪或多糖基质中从而进一步提高细菌存活的机率。本发 明组合物也可以适于消费的选自饮料、奶、酸奶酪、果汁、水果饮 料、口嚼片、小甜饼、饼千或其組合的形式提供。如果出生后笫一年受试者为母乳喂养，出生后给予LGG 可经母乳给药。在这个实施方案中，在其母乳喂养期间，母亲可继 续使用LGG补充剂，由此经母乳递送有效量的LGG至其子代。如果出生后第一年受试者为配方喂养，或为母乳喂养联 用配方喂养，可将LGG添加进婴儿配制食品内然后给予受试者。这 也是一种出生后给予LGG的方法。在一个实施方案中，为本发明使用的婴儿配制食品为完 全营养的且含有适当类型和适当量的脂质、碳水化合物、蛋白质、 维生素和矿物质。脂质或脂肪的量通常可在约3 g/100千卡-约7 g/100 千卡间变动。蛋白质量通常可在约1 g/100千卡-约5 g/100千卡间变 动。碳水化合物的量通常可在约8 g/100千卡-约12 g/100千卡间变动。 可使用本领域中任何蛋白源例如去脂乳、乳清蛋白、酪蛋白、大豆 蛋白、水解蛋白、氨基酸等。可使用本领域中任何碳水化合物源例 如乳糖、葡萄糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精、蔗糖、淀粉、大米糖 浆固体等。可使用本领域中任何脂质源例如植物油例如棕榈油、大 豆油、向日葵油、椰子油、中链甘油三酯油、高油性向日葵油、高 油性红花油等。可方便的使用商业可得到的婴儿配制食品。例如 Enfamil 、 Enfamil 早产儿配方、含铁Enfamil 、 Lactofree 、 Nutramigen 、 Pregestimil 禾口 ProSobee㊣(可得自 Mead Johnson & Company, Evansville, IN,美国)可补充适当水平的LGG且用于本发明 实践中。
作为婴儿配制食品的替代品，可作为一种不整合到配方 喂养的补充剂出生后给予LGG。例如可以丸剂、片剂、胶嚢、小胶 嚢(caplet)、粉剂、液体或凝胶的形式摄入LGG。在这个用途的实施 方案中，可与其他营养补充剂例如维生素联用摄入LGG补充剂。
在另一个实施方案中，可将产前给予的LGG胶嚢化包 封于糖、脂肪或多糖基质中从而进一步提高细菌存活的机率。本发 明组合物也可以适于婴儿消费的选自较大婴儿(follow-on)配方食品、 饮料、奶、酸奶酪、果汁、水果饮料、口嚼片、小甜饼、饼干或其 组合的形式提供。
在本发明用途的一个实施方案中，出生后给予LGG至 少持续3个月。在本发明另一个实施方案中，出生后给予LGG至少 持续6个月。在本发明又一个实施方案中，出生后给予LGG至少持 续12个月。在本发明一个特定的实施方案中，出生后给予LGG持 续时间无限期。
在本发明的一个实施方案中，产前或出生后给予的LGG 可与一种或多种另外的益生菌联用。这种实施方案中可接受本领域 已知的任何益生菌。在一个特定的实施方案中，益生菌选自乳酸菌 属(丄"c/oZwc/〃—禾口双岐杆菌属(S,oZx3cten.画)。
在本发明的另一个实施方案中，产前或出生后给予的 LGG可与一种或多种益生素联用。这种实施方案中可接受本领i^已 知的任何益生素。本发明的益生素可包括乳酮糖、半乳-寡糖(galacto-oligosaccharide)、 果-寡糖(fructo-oligosaccharide)、 异麦芽隱寡糖(isomalto-oligosaccharide)、大豆寡津唐、吝丄酰,、lt(lactosucrose)、木國寡 糖(xylo曙oligosacchairde)和龙胆-寡糖(gentio-oligosaccharides)。
在本发明的一种用途中，产前和/或出生后给予LGG预 防或治疗变应性鼻炎、哮喘或鼻窦炎的发展。
在本发明的另一种用途中，产前和/或出生后给予LGG 预防或治疗受试者肺或气管变态反应诱导的炎症。特别的，本发明 的用途可预防或治疗气道组织炎症、气腔炎症、减少粘液产生或扩 大气道。
在本发明又一种用途中，产前和/或出生后给予LGG减 少或抑制一种或多种促炎细胞因子的释放。本文所用"促炎"细胞 因子包括本领域中已知的涉及上调炎症反应的细胞因子。例如包括 但不限于IFN-y、 MCP-1、 IL-6和IL-10。
在本发明的一个特定的实施方案中，产前和/或出生后给 予LGG抑制或减少受试者体内血清IgE抗体产生。在另一个实施方 案中，产前和/或出生后给予LGG增加受试者体内血清IgA抗体产生。
下列实施例描述本发明的各种实施方案。其他本文要求 保护的范围内的实施方案对于本领域技术人员考虑本说明书或本文 公开的发明实践是明显的。应考虑说明书连同实施例仅为示例，用 实施例后权利要求书指示本发明的范围和精神。在实施例中，除非 另有说明所有百分比为重量百分比。实施例1
本实施例描述了实验材料与方法，这些材料和方法为显 示产前给予LGG对肺和气道内呼吸变态反应及炎症发展的效果所必 需的。雌性bag albino, c亚系(BALB/c)小鼠，6-8周龄，得自Harlaan Hinkelmann(Hannover,德国)。维持其无卵白蛋白(OVA)-饮食。所有 实验步骤均经动物伦理委员会批准。产前接触鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG (XGG)
交配前笫10、 8、 6、 4、 2天雌性BALB/c小鼠共灌胃(i.g.) 给予5次200 pl体积的108菌落形成单位(cftj)的冻干LGG(重新溶解 在磷酸緩沖盐溶液(PBS))。交配后及妊娠期和哺乳期，所有组别的小 鼠每2天灌胃给予200 pl体积的108 cfti冻干的LGG。周龄匹配的， 々i接触的对照动物给予PBS代替LGG(对照组)。新生期接触OVA
在25日龄及然后在39日龄，通过腹腔注射(i.p.)总体 积200 pl的1.5 mg Al(OH)3 (Pierce, Rockford,美国)中乳化的10吗 OVA (等级VI; Sigma, Deisenhofen，德国)使'J 、鼠对OVA致敏。
为评价气道炎症，第44、 45、 46和47天，小鼠放置于 Plexiglas室内且暴露于雾化的OVA (1%重量/体积稀释于PBS中)20 分钟。在最后一次变应原-气溶胶接触后24小时评价气道炎症。
在第53天评价OVA-致敏小鼠的细胞因子产生及IgE和 IgA抗体反应 粪便样品中LGG-DNA测定
无菌称量粪便样品(0.05 g)，放置入无菌试管中并均匀分 散在1.4 ml溶解緩沖液中。根据制造商说明书(QIAamp DNA粪便试 剂盒，Quiagen)完成基因组DNA提取。使用热启动PCR试剂盒 (Quiagen)及LGG-特异性引物对(LGG有义gagaagaatggtcggcagag及 LGG反义catttcaccgctacacatgg)扩增DNA。子代暴露于OVA[OOO75]在25日龄及然后在39日龄，通过腹腔注射(i.p.)总体 积200 pi的1.5 mg Al(OH)3 (Pierce, Rockford,美国)中乳化的10吗 OVA (等级VI; Sigma, Deisenhofen,德国)使子代对OVA致敏。在 第53天评价OVA致敏小鼠的抗体反应。
第44、 45、 46和47天，为评价气道炎症将小鼠放置于 Plexiglas室内且暴露于雾化的OVA (1%重量/体积稀释于PBS中)20 分钟。OVA-特异性抗体血清水平测定
在第53天通过ELISA技术测定OVA-特异性IgGl、lgG2a 和IgE抗体滴度水平。用稀释于0.1 M碳酸盐包被缓冲液，pH8.2(对 于IgGl)或PBS(对于IgE、 lgG2a)中的OVA (20)ig/ml)包被96-孔聚苯 乙烯平底微滴定板(Greiner)。 4。C下滴定板孵育过夜，用洗涤緩冲液 (PBS/0.1 %Tween 20)冲洗3次，在室温下使用封闭溶液(3% BSA/PBS) 封闭2小时。滴定板冲洗(3次)后，加入样品(稀释于PBS/0.1% Tween 20)并在4°C下孵育过夜，然后在室温下用生物素缀合(conjugated)的 抗鼠IgE、 lgG2a或IgGl单克隆抗体(2,5吗/ml，所有抗体得自 Pharmingen)孵育2小时。室温下暗室内用链霉抗生物素蛋白-过氧化 物酶(稀释的l:1000)并用四曱基联苯胺(Roche)作为底物进行反应30 分钟。用2N硫酸中止反应并在450/490 nm测定滴定板。细支气管肺泡灌洗(Bronchioalveolai lavage) (BAL)及细胞分化
末次OVA-气溶胶暴露后24小时收集灌洗液。将导管插 入气管并用0.8 ml用冰预冷的PBS灌洗2次完成BAL。测定回收的 BAL-体积和总细胞数。通过离心分离50^1 BAL-';^/150 pl PBS (lOOg， 5分钟)制备每个样品的细胞离心涂片(Cytospins)。细胞离心涂片固 定后用Diff Quick(Baxter Dade)染色。进行100个细胞的分化细胞计 数(Differential cell counts)。通过标准形态学指标将细胞分类为中性粒 细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞或淋巴细胞。实施例2
本实施例说明治疗小鼠粪便内LGG的存在。与仅接受 PBS小鼠相比，测评LGG-处理的小鼠粪便样品内LGG的存在。微 生物培养后，LGG处理的小鼠粪便样品内存在LGG，而PBS处理的 小鼠粪便样品中检测不到LGG(图2A)。为进一步证实检测的LGG 与LGG补充剂确实相同，自粪便样品中制备并用LGG-PCR-特异性 引物扩增DNA。如图1 B所示，自LGG处理后小鼠的样品中可^r测 到LGG特异性PCR产物，而自PBS处理后小鼠的样品中无法检测 到LGG特异性PCR产物(图2B)。这个结果表明，产前及出生后早 期处理小鼠导致肠内群集(colonization),且在末次LGG补充剂后至 少3周仍可检测到LGG。
为评价母体给予LGG是否导致小鼠内长期(停止补充后 超过3周)LGG群集，自53日龄小鼠粪便样品制备DNA。 PCR分析 显示PBS处理及LGG-处理的小鼠都没有LGG群集(图2C)。该结果 表明，母体递送的LGG不会导致出生后子代内长期群集。
为进一步评价产前及出生后早期LGG-补充剂是否影响 肠道菌群(bacterial gut colonization)的分布，评价粪便样品中几种菌才朱 (LGG、肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、类杆菌)。如图3所示， LGG-补充剂具有以有益的方式转变细菌群集的趋势。与对照小鼠相 比，LGG-补充剂小鼠粪便样品内检测到更高数量的肠球菌、大肠杆 菌和类杆菌属类的细菌(图3)。另外与PBS小鼠相比，具有降低肠内 金黄色葡萄球菌群集的趋势。这些结果表明，LGG处理改善正常健 康的肠内群集并同时抑制小鼠肠道内(病理性)细菌的增殖。实施例3
本实施例说明LGG对变应性受试者体内血清变应原特 异性抗体产生的影响。进一步研究产前及出生后早期LGG-补充剂是 否抑制以后生活中变应性表型的发展。因此在小鼠子代内腹膜内给 予OVA致敏后接触OVA-变应原气溶胶评价产生的变应原特异性抗 体。如图4A和4B中所示，与PBS对照比较出生前及出生后早期接 触LGG小鼠产生的抗-OVA IgGl显著降低(图4A, B),表明母体LGG-补充剂抑制变应原特异性抗体反应的发展。鼠科动物IgGl抗体亚类 为变应性表现例如皮月夫单刺试一睑阳性反应(positive skin prick tests)和 气道炎症的发展中的效应分子。关于这种变应性效应子功能，鼠科
动物IgGl抗体亚类相当于人IgE抗体亚类。关于抗-OVA lgG2a抗体 产生水平，可检测到显著性差异(图4C)。这些结果表明，母体LGG國 补充剂降低以后生活中呼吸变应原的变应性致敏作用。实施例4
本实施例表明LGG对受试者体内血清IgA抗体升高的 影响。母乳含有高水平的igA亚类的分泌抗体。同样众所周知的是， 这种抗体亚类与提高接触变应原后的免疫耐受性有关。因此结果令 人惊讶的显示，与对照母体的子代(PBS)比较，LGG-补充的母体的子 代产生的血清IgA抗体(PBS)显著提高(图5)。这个结果表明，母体 LGG补充剂不仅抑制子代的变应性免疫反应的发展，表现为显著降 低IgGl抗体产生，而且诱导一类与提高免疫耐受性有关抗体(IgA)的 产生。实施例5
本实施例说明LGG对受试者脾细胞促炎细胞因子的产 生的影响。为进一步评价母体LGG-补充剂对子代抗体产生的有益效 应是否与涉及免疫耐受性的免疫反应相关，在LGG或变应原(OVA) 存在下培养得自OVA-致敏的和未致敏的子代的脾的单核细胞。72 小时后评价细胞因子产生。LGG-补充的小鼠母体的子代显示IFN-y 、 MCP-1、 IL-10和IL-6的产量显著降低(图6 A-D)。这些结果表明， 母体LGG-接触导致这些小鼠中促炎细胞因子的显著下调。实施例6
本实施例"^兌明LGG对变应性受试者气道炎症的抑制的 影响。为检验产前接触LGG的效应是否影响实验性哮喘的发展，OVA-致敏的小鼠用气溶胶变应原攻击4次。通过分析支气管-肺泡灌洗 (BAL)液体考察气道炎症。与产前接触PBS的OVA-致敏小鼠相比， 母体接触LGG的母鼠的OVA-致敏小鼠的BAL液体含有的粒细胞数 目显著降低(图7)。另外，BAL液体的细胞组成显示嗜酸性粒细胞与 巨噬细胞显著降低而淋巴细胞仅仅显示出数目减少的趋势。实施例7
本实施例描述了实验材料与方法，这些材料与方法为显 示产前给予LGG对肺和气道内呼吸变态反应及炎症发展的效应所必 需的。雌性BALB/c在交配生产BALB/c小鼠前及在妊娠期间灌胃给天。对照小鼠给予PBS代替LGG。
在第0、 2、 4、 6、 8、 10和12天，雌性BALB/c小鼠 灌胃给予5次200 pl体积的108菌落形成单位(cfu)的冻干LGG(重新 溶解在PBS)。对照组仅给予PBS。在第21和28天，所有动物都腹 腔注射给予致敏的100吗的牛乳蛋白和1.5 mg A1(0H)3佐剂。为评 价血清抗体水平和免疫效应子功能(PCA)，在第0天和笫49天收集 血样。
Wistar大鼠背部及两胁腹去毛并皮内注射0.1 ml的取自 49天的小鼠试验血清稀释液，然后24小时后静脉注射1 ml的牛乳 蛋白(Mead Johnson Nutritionals, Evansville, IN，美国)和伊文思蓝;容液 (2%的无菌盐水内)的1 :1混合溶液。20-30分钟后，检查阳性反应动 物。测定血清注射部位染料外渗的直径。
通过ELISA技术在第49天测定牛乳蛋白特异性IgGl、 IgG2a和IgE抗体滴度水平。用稀释于0.1 M碳酸盐包被緩冲液，pH 9.6 的牛乳蛋白(5昭/ml)包被96孔平底微孔板(NUNC,德国)，然后用 PBS/1% BSA/0.02吐温20封闭(37。C)1小时。在每个滴定板上测定(起 始稀释IgE 1 :10、 IgG2a 1 :100和IgGl 1 :6400)用阳性混合血清(pool serum)(第49天对照)绘制的标准曲线，设置1000任意单位/ml (AU/ml) 为特定的抗原特异性抗体水平。为检测IgE、 IgGl和IgG2a抗体， 加入PO-缀合的抗体(37。C下1小时)。然后3,3'，5,5'-四曱基联苯胺 (TMB; Sigma,德国，100 pl/孔；6 mg/ml DMSO)用于显色反应，用100 pl/孔的2N H^04溶液停止反应并在450 nm测定吸光度。牛乳蛋白 特异性抗体滴度表示为与标准血清比较的任意单位(AU)。
在第56天用100 mg牛乳蛋白口服攻击前和后1小时收 集血样/动物，用ELISA试剂盒(Moredun,苏格兰)测定mmcp-l的 血清水平。根据制造商说明书进行ELISA。使用GraphPad Prism软 件，3.02版分析数据。使用Maim Whitney-U检验确定不同组间差异 性。p<0.05的值认为具统计学显著性。实施例8
本实施例说明出生前和出生后用LGG治疗的小鼠粪便 内LGG的存在。与仅接受PBS小鼠的比较，评价LGG-处理的小鼠 粪便样品内LGG的存在。微生物培养后，LGG处理的小鼠粪便样品 内存在LGG，而PBS处理的小鼠检测不到LGG(图2A)。为进一步 证实检测的LGG与LGG补充剂确实相同，自粪便样品中制备并用 LGG-PCR-特异性引物扩增DNA。如图1 B所示，自LGG处理后小 鼠的样品中可检测到LGG特异性PCR产物，而自PBS处理后小鼠 的样品中无法检测到LGG特异性PCR产物。这个结果表明，产前及 出生后早期处理小鼠导致肠内群集(colonization)，且在末次LGG补 充后至少3周仍可检测到LGG。
为评价母体给予LGG是否导致新生小鼠内LGG群集， 自53日龄新生小鼠粪便样品制备DNA。 PCR分析显示PBS处理及 LGG-处理的小鼠都没有LGG群集。该结果表明，母体递送的LGG 在产前或出生后期间不会传递到新生小鼠。
为进一步评价产前及出生后早期LGG-补充剂是否影响 肠道菌群(bacterial gut colonization)的分布，评价粪便样品中几种菌林 (LGG、肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、类杆菌)。LGG-补充 剂具有以有益的方式转变细菌群集的趋势。与对照小鼠相比，LGG-补充剂小鼠粪便样品内检测到更高数量的肠球菌、大肠杆菌和类杆 菌属类的细菌。另外与PBS-处理的小鼠相比LGG-处理的小鼠肠道 内具有降低金黄色葡萄球菌群集的趋势。这些结果表明，LGG处理
改善正常健康的肠内群集且同时抑制小鼠肠道内(病理性)细菌的增 殖。实施例9
本实施例说明产前和出生后早期LGG-补充剂对变应性 新生小鼠与对照组小鼠两者体内血清变应原特异性抗体产生的影 响。评价腹腔注射OVA致敏后接触OVA-变应原气溶胶产生的变应 原特异性抗体。母体LGG-补充剂抑制变应原特异性抗体反应，其表 现为与PBS对照比较产前及出生后早期LGG-处理的小鼠产生的抗-OVA IgGl显著降低。鼠科动物IgGl抗体亚类相当于人IgE抗体亚 类。鼠科动物IgGl抗体亚类为变应性表现例如皮肤单刺试验阳性反 应(positive skin prick tests)和气道炎症的发展中的效应分子。抗-OVA lgG2a抗体产生水平在LGG-处理小鼠与PBS-处理小鼠之间显著不 同。这些结果表明，母体LGG-补充剂降低以后生活中呼吸变应原的 变应性致^:作用。实施例10
本实施例说明产前和出生后早期LGG-补充剂对变应性 新生小鼠与对照组小鼠两者体内血清igA抗体产生的影响。母乳含有高水平的IgA亚类的分泌抗体。同样众所周知的是，逸种抗体亚 类与提高接触变应原后的免疫耐受性有关。因此结果令人惊讶的显示，与对照母体的新生小鼠(PBS)比较，LGG-补充的母体的新生小鼠 血清IgA抗体的产量显著提高。这个结果清楚的表明，母体LGG补 充剂不仅抑制新生小鼠的变应性免疫反应的发展，表现为显著降低 IgGl抗体产生，而且诱导一类与提高免疫耐受性有关抗体(IgA)的产 生。实施例11
本实施例说明产前和出生后早期LGG-补充剂对变应性 新生小鼠与对照组小鼠两者体内细胞促炎细胞因子产生的影响。在 LGG或变应原(OVA)存在下培养得自OVA-致敏的和未致敏的新生小鼠的脾的单克隆细胞。72小时后评价细胞因子产生。LGG-补充的小 鼠母体的新生小鼠显示产生的IFN- Y 、 MCP-1、 IL-10和IL-6显著降 低。这些结果表明，母体LGG-接触导致这些新生小鼠中促炎细胞因 子的显著下调。实施例12
本实施例说明产前和出生后早期LGG-补充剂对变应性 新生小鼠与对照组小鼠两者体内气道炎症的抑制的影响。OVA-致敏 的小鼠用气溶胶变应原攻击4次。通过分析支气管-肺泡灌洗(BAL) 液体研究气道炎症。与产前接触PBS的OVA-致敏小鼠相比，母体 接触LGG的母鼠的OVA-致敏小鼠的BAL液体含有的粒细胞数目显 著降低(p0.05)。另外，BAL液体的细胞组合物显示嗜酸性粒细胞与 巨噬细胞显著降低(pO.05)而淋巴细胞仅仅显示出数目减少的趋势。实施例13
本实施例说明出生后LGG补充剂对以后生活中变应性 表型(phonotype)的发展的影响。为评价出生后接触LGG对以后生活 中变应性表型发展的影响，雌性BALB/c小鼠给予LGG或PBS盐水 2周(14天)。在第21和28天，小鼠注射给予两次牛乳蛋白。在第49 和56天，评价口服攻击后产生的牛乳特异性抗体(图8)及免疫效应子 功能，例如被动皮肤过敏试验(图9A)和血清肥大细胞蛋白酶-1释放。
如图8所示，出生后LGG补充剂抑制变应原特异性抗 体反应的发展，表现为牛乳特异性IgE抗体的产生显著减少。变应原 特异性IgE抗体的产生减少与变应原攻击后风渗块和潮红反应(wheal and flare reactions)显著减少有关(图9A)。变应原特异性IgE抗体的产 生减少也与变应原攻击后肥大细胞蛋白酶-1的释;^丈显著减少有关(图 9B)。这些结果表明，LGG补充剂降低变应原特异性免疫反应的发展， 也降低变应原暴露后变应性症状。因此，变应性致敏后LGG暴露降 低以后生活中变应性表型的发展。
本说明书中引用的所有参考文献，包括而不限于所有文件、出版物、专利、专利申请书、说明、文本、报告、手册、小册子、书籍、网络邮寄品(internet postings)、期刊文章、期刊等，其全部内容通过引用结合于本说明书中。本文参考的讨论仅仅用于才既 括其作者的主张而不意味着承认任何参考文献构成先有技术。申请人保留质疑引用的参考文献的准确性和适当性的权利。
在不偏离本发明的精神和范围前提下，本领域普通技 术人员可实践对本发明的这些及其他修改和变化，在所附权利要求 书中作了更具体的说明。另外，应理解各种实施方案的多方面可全性的，而不是意图限制本发明，因此在所附权利要求中作进一步描 迷。因此所附权利要求书的精神和范围不应局限于本文包括的所述 优选方案。
权利要求
1.LGG在制造用于预防或治疗受试者的呼吸变态反应的药物中的用途。
2. 权利要求1的用途，其中呼吸变态反应选自变应性鼻炎、哮 喘和鼻窦炎。
3. 权利要求l的用途，其中所述药物在产前给予受试者。
4. 权利要求3的用途，其中产前给予该药物包括由未出生受试 者的妊娠母亲服用。
5. 权利要求l的用途，其中所述药物在出生后给予受试者。
6. 权利要求5的用途，其中出生后给予该药物包括由受试者母 亲服用并经母乳喂养给予受试者。
7. 权利要求5的用途，其中出生后给予该药物包括将该药物掺 入婴儿配制食品并由受试者食用该婴儿配制食品。
8. 权利要求5的用途，其中出生后给予该药物持续至少3个月。
9. 权利要求5的用途，其中出生后给予该药物持续至少6个月。
10. 权利要求5的用途，其中出生后给予该药物持续至少1年。
11. 权利要求1的用途，其中药物中LGG的量为约1 x 104-1 x 101Q cfu/L/kg/天。
12. 权利要求1的用途，其中药物中LGG的量为约1 x 106-1 x io9 cfii/L/kg/天。
13. 权利要求1的用途，其中药物中LGG的量为约1 x io8 cfti/L/kg/天。
14. 权利要求1的用途，其中药物另外包含至少一种其它益生菌。
15. 权利要求l的用途，其中药物另外包含至少一种益生元。
16. LGG在制造用于预防或治疗受试者肺及气道变态反应诱导的 炎症的药物中的用途。
17. 权利要求1的用途，其中所述药物在产前给予受试者。
18. 权利要求l的用途，其中所述药物在出生后给予受试者。
19. 权利要求16的用途，其中所述药物减轻或预防气道组织炎 症，减轻或预防气道腔炎症，减少粘液产生或扩大气道。
20. LGG在制造用于阻止或减少受试者体内一种或多种促炎细胞 因子释^:的药物中的用途。
21. 权利要求20的用途，其中促炎细胞因子选自IFN-y、 MCP-1、 IL-6和IL-10。
22. LGG在制造用于阻止或减少受试者体内血清IgE抗体产生的 药物中的用途。
23. LGG在制造增加受试者体内血清IgA抗体产生的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及LGG在制备预防或治疗患者的呼吸变态反应的药物中的新用途。
文档编号A61K35/74GK101160135SQ200680012467
公开日2008年4月9日 申请日期2006年3月22日 优先权日2005年4月15日
发明者H·伦茨, H·加恩, N·布吕默, U·赫尔茨 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司