一种快速检测罗汉果番木瓜环斑病毒的方法与流程

本发明涉及植物病毒检测领域，特别涉及一种快速检测罗汉果番木瓜环斑病毒的方法。

背景技术：

随着罗汉果生产的规模化，许多问题逐渐暴露出来，并且亟待解决。如罗汉果生产扩大与当地生态保护之间的矛盾，罗汉果品种退化，病虫害大规模地发生，生产技术有待规范化等等。特别是其病虫害的发生，严重制约着罗汉果生产的发展。危害罗汉果的病虫害主要有根结线虫病、病毒病、芽枯病、瓜藤天牛等。特别是罗汉果根结线虫病及病毒病，给罗汉果的生产造成了严重的影响，不仅是产量的损失，还造成品质的严重下降，降低了果实的等级，进而影响到果农的收益。目前这两种病害都没有很好的防治方法。据林纬等调查，永福县传统种薯块茎种植的罗汉果病毒病病株率高达100％，采用罗汉果组培苗种植的发病率较低。在罗汉果果园附近种植葫芦科植物的地方发病重；平地栽培比深山种植发病重，留薯年限越长，病害越重。罗汉果病毒病对产量的影响随植株发病时期而异。苗期发病，植株多数严重矮化，不能结果；生长中期(开花前)受害，植株稍微矮化，茎蔓可以上棚结小果，经济价值较低；植株开花结果期被害，新抽枝叶表现花叶症状，对产量影响较小。种植管理水平高，合理施肥的果园，病害发病率虽高，但因前期生长好，多数在结果期才表现症状，对罗汉果产量的影响小。

罗汉果番木瓜环斑病毒是严重制约罗汉果生产发展的主要因素之一，罗汉果的传统繁殖方法有有性繁殖和无性繁殖，有性繁殖即用种子播种而获得苗木，有性繁殖获得的苗木雄株比例大，雌株比例小，因此，一般生产上不用有性繁殖；无性繁殖包括嫁接繁殖和压蔓繁殖，在罗汉果产区，主要采用压蔓繁殖，但其后代病毒病发生严重。目前生产上大量采用脱毒组培苗，在一定程度上可以延缓病毒病的发生，但并未从根本上解决罗汉果的病毒病问题。

防治罗汉果番木瓜环斑病毒的前提之一是对罗汉果病毒及其株系种类进行诊断和鉴定。检测罗汉果体内prsv的存在不仅是有效防治prsv和研究罗汉果抗prsv能力的重要措施，而且对罗汉果抗prsv育种有积极意义。但由于prsv粒子细长，易与寄主杂质粘结而丢失，且易在提纯过程中断裂或聚集，因而提纯较为困难，也给prsv检测带来不便。

目前罗汉果番木瓜环斑病毒检测有以下2个方法:1)依靠感染后期植株表现出来的表观病症来判断；2)多克隆抗体检测技术。罗汉果病毒从感染到产生症状有一个较长的潜伏期。第一种方法无法在移栽前检定并及时去除还没有产生症状的带毒种苗，产生的后果是不可避免的把混在健康种苗群体里面的带毒种苗移栽大田，增加了罗汉果种植区病毒病传布的风险；第二种方法操作复杂，存在检测成本高、检测周期长，不能实现罗汉果番木瓜环斑病毒的快速检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术之不足，提供一种快速检测罗汉果番木瓜环斑病毒的方法，显著提高罗汉果番木瓜环斑病毒检测的灵敏性。

本发明的目的是通过下述方案来实现的：

本发明提供一种快速检测罗汉果番木瓜环斑病毒的方法，所述的方法采用包括以下任一引物对进行pcr检测：

引物对1

pv1：其核苷酸序列如sedidno.1所示；

pv2：其核苷酸序列如sedidno.2所示；

引物对2

pv1：其核苷酸序列如sedidno.1所示；

pv3：其核苷酸序列如sedidno.3所示；

引物对3

pv4：其核苷酸序列如sedidno.4所示；

pv5：其核苷酸序列如sedidno.5所示；

引物对4

pv6：其核苷酸序列如sedidno.6所示；

pv7：其核苷酸序列如sedidno.7所示；

引物对5

pv1：其核苷酸序列如sedidno.1所示；

pv8：其核苷酸序列如sedidno.8所示；

优选地，所述的检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测罗汉果的总rna；

2)以所提取的总rna为模板，反转录合成第一链cdna；

3)以步骤2)得到的cdna样品为模板，采用所述的任一引物对进行pcr，得到扩增产物，检测扩增产物的长度；

4)根据扩增产物目标片段的长度判断是否感染番木瓜环斑病毒，若所述扩增产物长度与目标片段的长度相符，则所述待测罗汉果感染番木瓜环斑病毒。

优选地，所述引物对1目标片段的长度为411bp；

优选地，所述引物对2目标片段的长度为378bp；

优选地，所述引物对3目标片段的长度为375bp；

优选地，所述引物对4目标片段的长度为368bp；

优选地，所述引物对5目标片段的长度为365bp；

优选地，所述pcr体系为25μl，包含：ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，第一链cdna1μl，dntp1μl，引物对2μl，extaq聚合酶0.2μl；

优选地，所述pcr反应的条件为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。

本发明通过根据目前发现的罗汉果番木瓜环斑病毒dna序列，在ncbi核酸数据库找到大量高度同源病毒序列，把已知罗汉果病源病毒dna与从数据库找到的病毒同源序列进行比对，找到高度保守区。在dna高度保守区域设计pcr引物，根据所设计引物，优化pcr参数，快速检测目前在罗汉果植株番木瓜环斑病毒(prsv)，新方法灵敏度高，结果可靠，假阳性机率低。

本发明的有益效果：

1、本发明通过深入分析罗汉果番木瓜环斑病毒核酸序列特征，在其最保守区域设计了不同以往的新的引物对，避开某些变异株的变异区，预期产物特异性强，敏感性高、特异性强、重复性好，假阳性机率低。

2、克服了传统方法无法在移栽前检定并及时去除还没有产生症状的番木瓜环斑病毒种苗等弊端，避免了把混在健康种苗群体里面的带毒种苗移栽大田，减低了罗汉果种植区番木瓜环斑病毒传布的风险；同时，相对于传统的酶联免疫吸附法(elisa法)及cdna分子探针法，本发明检测成本低、检测周期短，可实现幼苗期罗汉果番木瓜环斑病毒的快速检测。

附图说明

图1罗汉果叶片总rna。

其中，泳道1～6：罗汉果叶片总rna

图2pcr扩增prsv片段。

其中，泳道1：引物pv1/pv2；泳道2：引物pv1/pv3；泳道3：引物pv4/pv5；泳道4：引物pv6/pv7；泳道5：引物pv1/pv8；m：dna条带长度标记。

图3pcr检测罗汉果番木瓜环斑病毒(prsv)。

其中，泳道1～15：不同罗汉果幼苗的cdna样品，p:prsv感染植株对照，n：无毒植株对照，m：dna条带长度标记(最亮的dna条带为400bp)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例一

1)检测引物的设计

根据genbank中prsv外壳蛋白基因核苷酸序列保守区设计检测引物，正向引物pv1：tctggtgtctgggtaatgatggatgg，反向引物pv2：gcgcatacccaggagagagtgcatg，预期特异性产物的长度为411bp。

2)总rna提取

称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。

3)pcr的分子生物学检测

第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物pv11μl，反向引物pv21μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。

4)pcr产物的电泳

将步骤3)的pcr扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染番木瓜环斑病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。

5)病毒感染的判断

若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有411bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染番木瓜环斑病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有411bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有411bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染番木瓜环斑病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。

实施例二

1)检测引物的设计

根据genbank中prsv外壳基因核苷酸序列保守区设计检测引物，正向引物pv1：tctggtgtctgggtaatgatggatgg，反向引物pv3：gacatcttccactgtgtgtctctccgt，预期特异性产物的长度为378bp。

2)总rna提取

称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。

3)pcr的分子生物学检测

第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物pv11μl，反向引物pv31μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。

4)pcr产物的电泳

将步骤3)的pcr扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染番木瓜环斑病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。

5)病毒感染的判断

若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有378bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染番木瓜环斑病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有378bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有378bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染番木瓜环斑病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。

实施例三

1)检测引物的设计

根据genbank中prsv外壳基因核苷酸序列保守区设计检测引物，正向引物pv4：tctggtgtctgggtaatgatgg，反向引物pv5：atcttccactgtgtgtctctccgt，预期特异性产物的长度为375bp。

2)总rna提取

称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。

3)pcr的分子生物学检测

第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物pv41μl，反向引物pv51μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。

4)pcr产物的电泳

将步骤3)的pcr扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染番木瓜环斑病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。

5)病毒感染的判断

若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有375bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染番木瓜环斑病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有375bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有375bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染番木瓜环斑病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。

实施例四

1)检测引物的设计

根据genbank中prsv外壳基因核苷酸序列保守区设计检测引物，正向引物pv6：tctggtgtctgggtaatgatggatggg，反向引物pv7：actgtgtgtctctccgtgttttcttccttgtt，预期特异性产物的长度为368bp。

2)总rna提取

称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。

3)pcr的分子生物学检测

第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物pv61μl，反向引物pv71μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。

4)pcr产物的电泳

将步骤3)的pcr扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染番木瓜环斑病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。

5)病毒感染的判断

若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有368bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染番木瓜环斑病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有368bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有368bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染番木瓜环斑病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。

实施例五

1)检测引物的设计

根据genbank中prsv外壳蛋白基因核苷酸序列保守区设计检测引物，正向引物pv1：tctggtgtctgggtaatgatggatgg，反向引物pv8：gtgtgtctctccgtgttttcttccttgt，预期特异性产物的长度为365bp。

2)总rna提取

称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。

3)pcr的分子生物学检测

第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物pv11μl，反向引物pv81μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。

4)pcr产物的电泳

将步骤3)的pcr扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染番木瓜环斑病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。

5)病毒感染的判断

若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有365bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染番木瓜环斑病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有365bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有365bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染番木瓜环斑病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。

结果与分析

将实施例1～5中检测的结果，使用其他引物交叉验证，elisa法及cdna分子探针法复查，同时结合感染后期植株表现出来的表观病症来判断，统计其假阳性、假阴性的概率，结果见下表：

由上表可以看出，根据本发明选择的prsv病毒基因组保守区而设计的引物对可以特异性扩增病毒dna，灵敏地检测出罗汉果幼苗的病毒感染情况。如图2所示的，本发明提供的5个引物对可以从psrv感染的罗汉果幼苗扩增得到相应大小的病毒dna，而在无病毒感染幼苗没有扩增得到dna条带。表明这些引物对可以用于罗汉果prsv病毒的检测。如图3所示，利用引物对pv6和pv7对来自15个不同罗汉果种苗的cdna样品进行pcr检测；结果表明，除了样品3,11,14和15外，其它11个样品都扩增出一条368bp的dna条带，表明对应于这些样品的罗汉果种苗感染了prsv病毒。同时，发了防止漏检，在对阴性的样品采用elisa法及cdna分子探针法进行复查，发现检测结果与5个引物对的检测相符，假阴性的概率为零；因此，本发明的精确度高。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>桂林莱茵生物科技股份有限公司

<120>一种快速检测罗汉果番木瓜环斑病毒的方法

<130>2019

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工系列(人工序列)

<400>1

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<400>2

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<213>人工系列(人工序列)

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