一种甲基营养型芽孢杆菌及其在农业生产中的应用的制作方法

本发明涉及功能微生物筛选与应用
技术领域：
，具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌及其在农业生产中的应用。
背景技术：
：微生物和农业的关系十分密切，素有“微生物大本营”之称的土壤中，微生物扮演着质循环的主要角色，有着不可替代的作用。它们分解动植物的残体废物而将其转化为腐殖质，促进土壤良好结构的形成。许多土壤微生物可固定空气中的氮素和转化各类有机物，不断为植物提供可有效利用的碳、氮、磷、钾等各类营养元素。自然界还广泛存在昆虫的病原微生物和植物病菌的拮抗微生物，它们可用于植物病虫害的防治而部分替代化学农药。另外，通过微生物繁殖和发酵能生产有机酸、氨基酸、生长激素、抗生素、各类酶制剂等多种产品，可分别用作饲料添加剂、食品添加剂和农药等，应用日益广泛。1、微生物肥料微生物肥料，又称细菌肥料或生物肥料，是一类通过人工培养对植物有益的微生物而制成的微生物制剂。微生物肥料的功效是一种综合性作用，一般不直接为农作物提供营养元素，主要起间接营养作用，能增进土壤肥力，改良土壤结构，刺激作物生长，改善作物品质，增强植物抗病(虫)和抗逆性。使用微生物肥料后有效可以减少化肥的施用量，提高肥料利用率。按微生物种类可分为五大类：①细菌类肥料(如根瘤菌肥、固氮菌肥、解磷菌肥、解钾菌肥、光合菌肥)；②放线菌类肥料(如抗生菌肥)；③真菌类肥料(菌根真菌肥：包括外生菌根菌剂和内生菌根菌剂)；④藻类肥料(如固氮蓝藻菌肥)；⑤复合型微生物肥料，即肥料由两种以上微生物按一定比例组合形成。2、微生物农药微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素等，这一类微生物包括杀虫防病的细菌、病毒和真菌。杀虫微生物中研究最多、用量最大的是苏云金芽孢杆菌，该菌在生成芽孢时菌体中可形成一个或多个具有强烈杀菌作用的称为内毒素的蛋白晶体，因而可广泛用于粮食、经济作物与蔬菜、林业以及一些卫生害虫的防潮。苏云金芽孢杆菌的另一个突出优点是选择性强，对人畜、天敌、植物都非常安全，堪称“无公害农药”。但该菌也存在一些缺点和不足，如毒素蛋白晶体易受环境因素作用而分解；杀虫作用不持久，田间防治效果仅能维持3,4天；杀虫谱偏窄，仅对部分鳞翅目害虫有效，常年使用，害虫可能产生抗药性等。另外，自然界中许多微生物对植物病原菌具有抑制和拮抗作用。例如，不少细菌、放线菌和真菌通过产生抗生素或争夺营养与生存空间而阻止病害的发生与蔓延，但防治病害的效果也受到复杂环境条件的影响而不能稳定或持久。3、饲料用微生物制剂新型饲料微生物制剂的研究已经成为饲料产业技术革新和产品更新换代的主要手段，对于消除抗营养因子、提高资源利用率、开辟新的饲料来源以及解决畜牧业环境污染都有重要作用。4、环境净化微生物在各类农业环境污染物的分解中可以发挥独特的作用，能够有效分解植物秸秆、畜禽粪便、残留农药、工业废水、生活垃圾等多种污染物的微生物菌株正在陆续发掘应用。生物降解和生物恢复技术具有效率高、速度快、成本低、反应条件温和以及无二次污染等显著优点，成为国际上农业环境污染治理的重要发展方向。由于污染物成分和环境污染因素的复杂性，用于环境污染净化的微生物不仅应有很强的降解能力和对环境的耐受性，而且要有降解能力的多样性。微生物在农业生产中的广泛应用有利于改善农业生态环境，提高粮食产量，减少环境污染，实现农业的可持续发展，对促进农业生产的变革具有明显的现实意义和深远的历史影响。挖掘、筛选、拓展新的功能性微生物菌种，选育具有作物亲和性、地域性、针对性、适应性、生产性优良的微生物产品，提高应用效果的稳定性，是目前本领域的研究重点。技术实现要素：本发明的目的是提供一株新的甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)，并提供了其在农业生产中的应用。所述甲基营养型芽孢杆菌筛选自白俄罗斯明斯克地区的土壤中，对多种病原菌具有显著抑制作用，可有效防治常见作物病害，及提高作物产量，应用前景广泛。本发明一方面提供了一种甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)，命名为甲基营养型芽孢杆菌vb1263(bacillusmethylotrophicusvb1263)，已于2019年6月6日保藏于中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno：m2019439。本发明一方面提供了所述甲基营养型芽孢杆菌在植物病害防治中的应用。所述植物病害包括烂脖子病、炭疽病、纹枯病、弯孢病、根腐病、白绢病、白粉病、疮痂病、灰霉病、枯萎病、褐斑病和果腐病中的任意一种。本发明一方面提供了所述甲基营养型芽孢杆菌在生物肥中的应用。本发明还提供了一种微生物制剂，包含上述甲基营养型芽孢杆菌vb1263。所述微生物制剂还包含芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或两种或多种的组合。所述微生物制剂中甲基营养型芽孢杆菌vb1263的活菌量至少为108cfu/g。本发明还提供了上述微生物制剂在植物病害防治中的应用。本发明还提供了上述微生物制剂在生物肥中的应用。本发明筛选到的甲基营养型芽孢杆菌vb1263对尖孢镰刀菌、链格孢、禾旋孢腔菌、灰霉菌、立枯丝核菌等常见病原菌均有较强的抑制作用，尤其是对禾旋孢腔菌、立枯丝核菌、根癌土壤杆菌和胡萝卜软腐病果胶杆菌的抑菌效果最强，抑菌带宽度超过24mm。所述甲基营养型芽孢杆菌可广泛应用于常见植物病害的防治，其中对姜烂脖子病和玉米弯孢病的防治效率分别高达75.2％和82.7％。该菌株还能显著提高甜瓜的产量，提升甜瓜的品质。与对照组相比，施用甲基营养型芽孢杆菌vb1263菌粉的处理组甜瓜的产量普遍提高了5.1％-25.4％，增产效果明显；处理组甜瓜中可溶性固形物含量提高了10.3％-24.1％，维生素c含量提高了10.7％-33.5％，取得了意料不到的技术效果。甲基营养型芽孢杆菌vb1263具有较强的固氮能力，其固氮酶活性高达40.9nmol/(mg·h)。在甜瓜苗期施用甲基营养型芽孢杆菌vb1263菌粉的处理组土壤中有效氮磷钾养分均得到显著提高，土壤中碱解氮、有效磷和速效钾含量比对照组分别提高了53.9％、44.2％和46.9％，取得了意料不到的技术效果。从而说明，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌vb1263具有显著的固氮、解磷和解钾效果，能有效提升土壤肥力，改善土壤环境，有利于提高作物产量，增加经济效益。综上本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌vb1263可作为生防菌剂、生物肥等，广泛应用于农业生产领域，效果显著，应用前景广阔。附图说明图1为vb1263菌株的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tofms)。具体实施方式本发明实施例中选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。下面结合具体实施例进一步阐述本发明。实施例1菌株筛选与鉴定1、菌株筛选：(1)土壤样品：采集自白俄罗斯明斯克地区的土壤。(2)采用梯度稀释法制备土壤稀释液，然后进行平板涂布和划线培养，分离获得多株土壤微生物；再进一步采用透明圈法筛选出对立枯丝核菌、合谷镰孢菌和草莓炭疽菌等病原菌抑菌效果最显著的三株菌，分别命名为vb1263，vb1264，vb1266。2、菌株鉴定：vb1263菌株形态特征：菌落呈圆形，直径3-6mm，菌落边缘整齐、表面光滑、湿润；长时间培养后菌落表面粗糙、呈扁平状；革兰氏阳性菌，可产生芽孢；芽孢呈椭圆形，局部呈圆形或近似圆形，孢子囊不膨胀；细菌细胞单个或成对存在，或者呈短链状。对vb1263菌株进行分子生物学鉴定，测得其16srdna序列和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tofms)(如图1所示)。结合上述生物学特性和分子生物学鉴定结果，申请人确认vb1263菌株为甲基营养型芽孢杆菌，命名为甲基营养型芽孢杆菌vb1263(bacillusmethylotrophicusvb1263)。申请人已于2019年6月6日将上述甲基营养型芽孢杆菌vb1263(bacillusmethylotrophicusvb1263)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019439。实施例2甲基营养型芽孢杆菌vb1263抑菌能力评价1、菌液的制备先将甲基营养型芽孢杆菌vb1263进行活化，然后挑取活化后的甲基营养型芽孢杆菌vb1263接种于lb液体培养基中，37℃，220r/min培养14h，获得活菌量为108-109cfu/ml的菌液。2、病原菌的制备将尖孢镰刀菌、链格孢、禾旋孢腔菌、灰霉菌(灰葡萄孢菌)、立枯丝核菌、根癌土壤杆菌、野油菜黄单胞菌、胡萝卜软腐病果胶杆菌、米氏单胞藻和密执岁棍状杆菌共10种病原菌(山东省农科院植保所提供)分别接种于pda培养基上，30℃培养5天后备用。3、平板抑菌试验在营养琼脂培养基的中央接种直径为7mm的病原菌菌饼，将已经灭菌的滤纸片放于菌饼两侧距离培养皿中心25mm处，吸取20ul甲基营养型芽孢杆菌vb1263菌液浸润滤纸片；然后将培养皿放于30℃培养箱中培养5天后取出，测量抑菌带的宽度。每种病原菌做三个重复，取平均值。这种滤纸片方法可以避免菌液扩散到外面形成不规则的菌落，可以快速准确统计抑菌效果。甲基营养型芽孢杆菌vb1263对上述10种病原菌的抑菌效果详见表1。表1甲基营养型芽孢杆菌vb1263对不同病原菌的抑菌效果病原抑菌带宽度mm尖孢镰刀菌22.0±1.0链格孢23.0±1.5禾旋孢腔菌24.0±1.0灰霉菌(灰葡萄孢菌)23.0±1.5立枯丝核菌24.0±1.0根癌土壤杆菌24.0±1.5野油菜黄单胞菌22.0±0.5胡萝卜软腐病果胶杆菌24.0±1.5米氏单胞藻23.0±1.0密执岁棍状杆菌23.0±1.5从表1的结果可以看出，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌vb1263对上述10种病原菌均具有明显的抑制作用，其中对禾旋孢腔菌、立枯丝核菌、根癌土壤杆菌和胡萝卜软腐病果胶杆菌的抑菌效果最强，抑菌带宽度超过24mm。实施例3甲基营养型芽孢杆菌vb1263固氮效果评价1、固氮酶活性测定方法：(1)乙烯含量测定在体积为21ml的螺口试管中加入4ml固氮培养基制成斜面，接种待测菌株后，于28℃培养箱中培养，以不接种的空斜面为阴性对照，已知具有酶活的圆褐固氮菌为阳性对照，分别设7个重复。72h后换橡胶塞，注入乙炔气体至终浓度为10％，用封口膜密封，继续培养72h。取100μl反应气体在气相色谱仪中测定乙烯生成量。乙烯含量标准曲线：取4，8，10，15，20，40，60，80μl纯乙烯注入一定体积的螺口试管中，于28℃培养箱中培养72h，测定其峰高值。以乙烯体积(μl)为横坐标，对应峰高值(mv)为纵坐标做标准曲线。(2)菌体蛋白测定-------bradford法(考马斯亮蓝法)用5ml生理盐水将上述斜面上的待测菌株洗入离心管，8000r/min离心收集菌体；向沉淀中加入3ml0.5mol/lnaoh，沸水煮5min；加入3ml0.5mol/lhcl混合均匀后，5000r/min离心，取上清液1.0ml加入5ml考马斯亮蓝，立即在旋涡混合器上混合，2-5min后，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值od595。蛋白质标准液：称取10mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中，制成100μg/ml贮备液。蛋白标准曲线：准确吸取0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml含牛血清100μg/ml贮备液，加入试管中，分别加水至1ml，每管含牛血清10，20，40，60，80μg，加入5.0ml考马斯亮蓝g-250蛋白试剂，其他操作同上。以光吸收值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，作标准曲线。根据牛血清白蛋白标准曲线计算上述斜面上的待测菌株的菌体蛋白量。(3)根据以下公式换算成固氮酶活性：固氮酶活性[nmol/(mg·h)]＝c2h4摩尔数(nmol)/[菌体蛋白量(mg)×反应时间(h)]，c2h4摩尔数(nmol)＝c2h4体积(μl)×273×p/[22.4×(273+t℃)×760]。2、固氮酶活性测定结果：按照上述方法测得本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌vb1263的固氮酶活性为40.9nmol/(mg·h)，从而说明该菌株具有较强的固氮能力，取得了意料不到的技术效果。实施例3甲基营养型芽孢杆菌vb1263在姜烂脖子病防治中的应用1、甲基营养型芽孢杆菌vb1263菌粉制备将甲基营养型芽孢杆菌vb1263在5吨发酵罐中进行液体发酵，当镜检芽孢率达到90％以上时停止发酵；5000rpm离心10min，去除发酵上清液，将菌泥进行喷雾干燥，制得活菌量为10亿/g的菌粉。2、姜烂脖子病防治实验(1)实验地点：昌邑市围子街道姜种植地，该地块连年种姜，有严重的重茬病害—烂脖子病。(2)实验设计：选取10m×8m的区域作为一个实验区，每个实验区内种10垄姜，约400±20株。共设置15个实验区，每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。(1)空白对照组：不撒施任何菌粉，直接在姜沟中种姜；(2)vb1263菌粉处理组：先将vb1263菌粉(活菌量为10亿/g)按2-5kg/亩的用量均匀撒施于姜沟内，然后在姜沟中种姜。其中：处理组1：vb1263菌粉用量为2kg/亩；处理组2：vb1263菌粉用量为3kg/亩；处理组3：vb1263菌粉用量为4kg/亩；处理组4：vb1263菌粉用量为5kg/亩。在姜的生长过程中，对各试验区均采用相同的田间管理方法。在姜收获时，统计姜烂脖子病的发生情况，计算甲基营养型芽孢杆菌vb1263对姜烂脖子病的防治效率，具体结果见表2。病害分级标准：0级，姜株健康无病；1级，母姜株局部发病，子孙姜株健康无病；2级，子孙姜株有病斑，但无枯死；3级，姜丛局部枯死(30％～50％)；4级，姜丛基本枯死或完全枯死，姜肉变色腐烂60％以下；5级，姜丛完全枯死，姜肉腐烂60％以上。病情指数和相对防治效果计算公式分别为：病情指数＝(∑(各级发病株数×对应发病级数)/(调查总株数×最高发病级数))×100；相对防效(％)＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。表2甲基营养型芽孢杆菌vb1263对姜烂脖子病的防治效果从表2的数据可以看出，与对照组相比，在种姜前撒施甲基营养型芽孢杆菌vb1263菌粉的各处理组姜的烂脖子病病情指数得到大幅度降低，从而说明本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌vb1263对姜烂脖子病具有显著的防治效果，防治效率最高达到75.2％，取得了意料不到的技术效果。实施例4甲基营养型芽孢杆菌vb1263在玉米大田弯孢病防治中的应用1、实验地点：青岛市即墨七级镇玉米大田种植区，该种植区内的玉米播种时间相同，玉米长势相近。2、玉米弯孢病防治实验：选取10m×10m的方形区域作为一个实验区，共设置15个实验区，且每个实验区之间保持5米的间隔。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。(1)空白对照组：清水浇施玉米根部；(2)vb1263菌粉处理组：将vb1263菌粉(活菌量为10亿/g)按1-4kg/亩的用量随水浇施于苗期玉米的根部，间隔7天用一次，连续使用三次。其中：处理组1：vb1263菌粉用量为1kg/亩；处理组2：vb1263菌粉用量为2kg/亩；处理组3：vb1263菌粉用量为3kg/亩；处理组4：vb1263菌粉用量为4kg/亩。在玉米生长期内，统计玉米弯孢病发病情况，计算甲基营养型芽孢杆菌vb1263对玉米弯孢病的防治效率，具体结果见表3。病害分级标准：0级无病斑；1级：病斑面积占叶面积的1/4以下；2级：病斑面积占叶面积的1/4-2/4；3级：病斑面积占叶面积的2/4-3/4；4级：病斑面积占叶面积的3/4以上。病情指数＝[∑(病级值×该级发病叶数)/(调查总叶数×最高病级值)]×100。防治效率的计算公式＝[1-(处理组病情指数/对照组病情指数)]×100％。表3甲基营养型芽孢杆菌vb1263对玉米弯孢病的防治效果从表3的数据可以看出，施用甲基营养型芽孢杆菌vb1263菌粉的各处理组玉米的弯孢病病情指数仅为12.1-28.6，远远低于对照组。从而说明本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌vb1263对玉米弯孢病具有显著的防治效果，防治效率最高达到82.7％，取得了意料不到的技术效果。实施例5甲基营养型芽孢杆菌vb1263在甜瓜种植中的应用1、实验地点：青岛市莱西市邹家许村甜瓜种植大棚。2、甜瓜种植实验：选取10m×8m的区域作为一个实验区，每个实验区内有10垄甜瓜，约500±10株。共设置15个实验区，每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。(1)空白对照组：清水浇施甜瓜苗根部；(2)vb1263菌粉处理组：将vb1263菌粉(活菌量为10亿/g)按1-8kg/亩的用量在甜瓜苗移栽后随水冲施，7天后再用一次。其中：处理组1：vb1263菌粉用量为1kg/亩；处理组2：vb1263菌粉用量为3kg/亩；处理组3：vb1263菌粉用量为5kg/亩；处理组4：vb1263菌粉用量为8kg/亩。进入成熟期后，每天6:00-8:00集中采摘成熟度超过8成的甜瓜，称重，记录各实验区每天的甜瓜产量；并从每个实验区每天采摘的甜瓜中随机挑取20个甜瓜，分别检测其可溶性固形物含量(质量百分比)和维生素c的含量(mg/100g)。全部甜瓜收获完毕后，统计各实验区甜瓜的总产量，分别计算对照组和处理组甜瓜的平均总产量和增产率，具体结果见表4；分别计算对照组和处理组甜瓜中可溶性固形物和维生素c的平均含量，具体结果见表5。增产率＝(处理组甜瓜产量-空白对照组甜瓜产量)/空白对照组甜瓜产量×100％。表4甲基营养型芽孢杆菌vb1263对甜瓜产量的影响实验分组平均产量(kg/亩)增产率空白对照组2461-vb1263处理组12672.545.1％vb1263处理组22768.3112.5％vb1263处理组32908.7918.2％vb1263处理组43086.3625.4％表5甲基营养型芽孢杆菌vb1263对甜瓜品质的影响实验分组可溶性糖含量vc含量(mg/100g)空白对照组8.7％5.4vb1263处理组19.6％5.98vb1263处理组29.86.31vb1263处理组310.57.19vb1263处理组410.87.21从表4和表5的结果可知，通过在甜瓜苗期施用甲基营养型芽孢杆菌vb1263菌粉，可以显著提高甜瓜的产量，提升甜瓜的品质。与对照组相比，处理组甜瓜的产量普遍提高了5.1％-25.4％，增产效果明显；处理组甜瓜中可溶性固形物含量提高了10.3％-24.1％，维生素c含量提高了10.7％-33.5％，取得了意料不到的技术效果。3、土壤肥效测定：甜瓜收获后，移除地上的甜瓜秧，采用对角线法在每个实验区各选择5个取样点。在每个取样点处，分别采集地表以下10cm和20cm处的土层各1kg。将收集的土样进行风干、去杂、磨细、过筛、混匀，然后分别检测各个土样中碱解氮、有效磷和速效钾的含量，计算空白对照组和处理组土壤中碱解氮、有效磷和速效钾的平均含量，具体结果见表6。表6甲基营养型芽孢杆菌vb1263对土壤中氮磷钾养分的影响从表6中的数据可以看出，与对照组相比，在甜瓜苗期施用甲基营养型芽孢杆菌vb1263菌粉的处理组土壤中有效氮磷钾养分均得到显著提高，尤其是处理组4的土壤中碱解氮、有效磷和速效钾含量最高，分别提高了53.9％、44.2％和46.9％，取得了意料不到的技术效果。从而说明，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌vb1263具有显著的固氮、解磷和解钾效果，能有效提升土壤肥力，改善土壤环境，有利于提高作物产量，增加经济效益。综上所述，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌vb1263可单独作为生防菌剂、生物肥等广泛应用于农业生产领域，还可与其他芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或多种进行组合，用于植物病害防治，提高土壤肥力，改善作物品质，应用前景广阔。当前第1页1 2 3