本发明是有关于一株具有高乳酸生产能力(highlacticacid-producingability)的凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)rbe4-4分离株，它以保藏编号bcrc910831被保藏于食品工业发展研究所(firdi)的生物资源保存及研究中心(bcrc)，以及以保藏编号cctccm2018310被保藏于中国典型培养物保藏中心(chinacenterfortypeculturecollection,cctcc)。所述凝结芽孢杆菌rbe4-4分离株可被用于生产乳酸。
背景技术：
：：纤维素生质(cellulosicbiomass)是一种经由工业与农林业运作而可被大量地生产的可再生能量资源(renewableenergyresources)，其中，利用生物学方法来将纤维素生质转换成乳酸(lacticacid)已被广泛地研究与探讨。当利用微生物来发酵纤维素生质以生成乳酸时，通常需要先将所述纤维素生质经过适当的糖化(saccharification)，而使其中的纤维素(cellulose)与半纤维素(hemicellulose)释出可发酵糖(fermentablesugars)[包括六碳糖(主要为葡萄糖)与五碳糖(主要为木糖)]，借此而得到一可供后续发酵(fermentation)使用的底物(substrate)，例如，纤维素水解液(cellulosichydrolysate)。凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)因可发酵五碳糖与六碳糖来生产乳酸，并且所生产的乳酸几乎皆为l型(l-form)而具有接近100％的光学纯度(opticalpurity)，因而已被广泛利用于纤维素生质的发酵以生产乳酸。此外，凝结芽孢杆菌具有耐酸与耐高温的特性，可于较低的ph值以及较高的温度下进行发酵，借此可减低菌体污染的风险，甚至可以不需无菌操作以及相关灭菌程序(qinj.etal.(2009),plosone,4(2):e4359；xuez.w.etal.(2012),springerplus.,1:43)。在patelm.a.etal.(2006),appl.environ.microbial.,72(5):3228-35中，patelm.a.等人从土壤中分离出380株能够利用木糖的细菌菌株，其中，凝结芽孢杆菌17c5以及36d1经由实验证实可利用经氢氧化钙超施石灰(calciumhydroxideoverliming)处理的甘蔗渣水解液(sugarcanebagassehydrolysates)当中的可发酵糖来生产乳酸，并且具有所欲的乳酸产率。另外，在rheem.s.etal.(2011),stand.genomic.sci.,5(3):331-40中，rheem.s.等人进一步将凝结芽孢杆菌36d1拿来进行糖类发酵型态分析(carbohydratefermentationprofileanalysis)，分析结果发现，凝结芽孢杆菌36d1可利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖(arabinose)、半乳糖(galactose)、麦芽糖(maltose)、果糖(fructose)以及纤维双糖(cellobiose)，但无法利用纤维素与木聚糖(xylan)。经糖化的纤维素生质除了含有可发酵糖之外，通常还伴随有因半纤维素与可发酵糖的降解所产生的发酵抑制物[例如醋酸、糠醛(furfural)、羟甲糠醛(hydroxymethylfurfural,hmf)，以及酚类化合物(phenoliccompounds)等]，它们会抑制微生物的生长与发酵的进行，进而影响乳酸的产率。为了克服发酵抑制物所造成的负面影响，已有许多去毒处理(detoxification)被提出，它们包括：(1)物理去毒处理(physicaldetoxification)，诸如蒸发(evaporation)以及膜媒介的去毒处理(membranemediateddetoxification)；(2)化学去毒(chemicaldetoxification)，诸如上述氢氧化钙超施石灰处理、中和(neutralization)、活性炭处理(activatedcharcoaltreatment)以及离子交换树脂(ionexchangeresins)；以及(3)生物去毒(biologicaldetoxification)，诸如使用虫漆酶(laccase)或木质素过氧化酶(ligninperoxidase)等。然而，这些去毒处理不但会使得发酵制程变得繁杂，更会提高所需要的成本，同时可能会使得可发酵糖流失。基于上述，申请人积极致力于开发出具有高乳酸-生产能力以及对发酵抑制物具有高度耐受性的菌株。技术实现要素：于是，在第一个方面，本发明提供一种凝结芽孢杆菌rbe4-4，它以保藏编号bcrc910831被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号cctccm2018310被保藏于中国典型培养物保藏中心。在第二个方面，本发明提供一种用于生产乳酸的方法，其包括：使用一如上所述的凝结芽孢杆菌rbe4-4来发酵一含有可发酵糖的底物，而使得乳酸被生成。较佳地，所述方法进一步包括令一生质进行糖化，以生成所述含有可发酵糖的底物。较佳地，所述糖化是在所述发酵期间被进行。较佳地，所述糖化是在所述发酵之前被进行。较佳地，所述含有可发酵糖的底物进一步含有至少一种选自于由下列所构成的群组中的发酵抑制物：醋酸、羟甲糠醛、糠醛以及酚类化合物。较佳地，所述含有可发酵糖的底物进一步含有1至20g/l的醋酸。较佳地，所述含有可发酵糖的底物进一步含有0.5至5g/l的羟甲糠醛。较佳地，所述含有可发酵糖的底物进一步含有0.5至5g/l的糠醛。较佳地，所述含有可发酵糖的底物进一步含有0.3至4g/l的酚类化合物。较佳地，所述可发酵糖是选自于下列所构成的群组：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、纤维双糖、半乳糖，以及它们的组合。生物材料保藏信息说明保藏编号：m2018310，分类命名：凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)rbe4-4，保藏日期：2018年05月28日，保藏单位：cctcc-中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学。具体实施方式为了清楚地说明本发明的目的，将被了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有一对应的意义。除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。一熟悉本领域者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。为表清楚，下面的界定被使用于本文中。目前利用微生物来将纤维素生质转换成乳酸的方法已被广泛地研究与探讨。然而，在对纤维素生质进行前处理以及水解处理的过程中，常会伴随产生发酵抑制物(例如，醋酸、糠醛、羟甲糠醛以及酚类化合物等)，进而影响微生物发酵产生产乳酸的能力。因此，申请人积极致力于开发出具有高乳酸-生产能力以及对发酵抑制物具有高度耐受性的乳酸菌株。申请人从土壤中分离与筛选出5株乳酸菌分离株，继而通过评估其发酵五碳糖与六碳糖的能力，而进一步筛选出一株可共发酵五碳糖与六碳糖来生产大量乳酸的乳酸菌分离株，接着使用纤维素水解液来对所述乳酸菌分离株进行驯化，而得到一对于发酵抑制物具有良好的耐受性的乳酸菌分离株rbe4-4。所述乳酸菌分离株rbe4-4经特征鉴定而被归属于凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)，它被申请人命名为“凝结芽孢杆菌rbe4-4”，并已于公元2018年3月2日以保藏编号bcrc910831被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(bcrcoffirdi)。这个分离株亦有依据布达佩斯条约(thebudapesttreaty)的规定，于公元2018年5月28日以保藏编号cctccm2018310被保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)。申请人接着在以纤维素水解液作为底物的情况下使用凝结芽孢杆菌rbe4-4来进行分步水解共发酵(separatehydrolysisandco-fermentation,shcf)以及同步糖化共发酵(simultaneoussaccharificationandco-fermentation,sscf)制程，而结果显示，无论是shcf或sscf制程，本发明的凝结芽孢杆菌rbe4-4皆能展现优异的乳酸发酵能力。基于上述，本发明的凝结芽孢杆菌rbe4-4可供用大量生产乳酸。于是，本发明亦提供一种用于生产乳酸的方法，其包括：使用一如上所述的凝结芽孢杆菌rbe4-4来发酵一含有可发酵糖的底物，而使得乳酸被生成。如本文中所使用的，术语“可发酵糖(fermentablesugars)”意指任何水溶性且可以被凝结芽孢杆菌作为碳源来使用的糖类，包括单醣(monosaccharide)、双醣(disaccharide)以及寡醣(oligosaccharide)。适用于本发明的可发酵糖包括，但不限于：葡萄糖、木糖(xylose)、阿拉伯糖(arabinose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、纤维双糖(cellobiose)、甘露糖(mannose)、鼠李糖(rhamnose)、麦芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、蜜二糖(melibiose)、海藻糖(trehalose)。较佳地，所述可发酵糖是选自于下列所构成的群组：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、纤维双糖、半乳糖，以及它们的组合。依据本发明，所述方法进一步包括令一生质(biomass)进行糖化(saccharification)，以生成所述含有可发酵糖的底物。如本文中所使用的，术语“生质”、“纤维素生质(cellulosicbiomass)”与“木质纤维素生质(lignocellulosicbiomass)”可被交替地使用，并且意指任何包括纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、寡醣和/或单醣的纤维素材料。依据本发明，所述生质可以衍生自一单一来源，或者所述纤维素生质可以包含一衍生自多种来源的混合物。例如，所述纤维素生质可以为一由玉米秸秆(cornstover)与玉米穗轴(corncobs)所构成的混合物，或者一由禾草(grass)与叶所构成的混合物。适用于本发明的生质包括，但不限于：生物能源作物(bioenergycrops)、农业残余物(agriculturalresidues)、都市固体废弃物(municipalsolidwaste)、工业固体废弃物(industrialsolidwaste)、来自造纸的淤泥(sludgefrompapermanufacture)、庭园废弃物(yardwaste)、废材(woodwaste)与林业废弃物(forestrywaste)，以及它们的组合。较佳地，所述生质是选自于下列所构成的群组：芒草(miscanthus)、软木(softwood)、硬木(hardwood)、玉米穗轴、作物残渣(cropresidues)[诸如玉米壳(cornhusks)]、玉米秸秆、禾草、麦秆(wheatstraw)、大麦秆(barleystraw)、干草(hay)、稻秆(ricestraw)、柳枝稷(switchgrass)、废纸(wastepaper)、甘蔗渣(sugarcanebagasse)、蜀黍植物材料(sorghumplantmaterial)、大豆植物材料(soybeanplantmaterial)、得自谷粒(grains)的研磨的组分、树木、树枝、根、叶、木屑(sawdust)、灌木(shrubs)与灌木丛(bushes)、蔬菜、水果以及花，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，所述生质是稻秆。如本文中所使用的，术语“糖化(saccharification)”与“水解(hydrolysis)”可被交替地使用，并且意指从生质中的多醣(polysaccharide)(例如，纤维素以及半纤维素等)产生可发酵糖。依据本发明，所述糖化是一使用纤维素酶(cellulase)的酶水解处理。有关使用纤维素酶的酶水解处理的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。较佳地，所述酶水解处理是通过加入一由纤维素酶与半纤维素酶(hemicellulase)所构成的混合物并在一范围落在50至65℃内的温度下进行搅拌历时48至72小时而被进行。在本发明的一个较佳具体例中，所述酶水解处理是通过加入一由纤维素酶与半纤维素酶所构成的混合物并在一为50至55℃的温度下进行搅拌历时48小时而被进行。依据本发明，所述含有可发酵糖的底物是一包含有葡萄糖以及木糖的纤维素水解液。如本文中所使用的，术语“纤维素水解液(cellulosichydrolysate)”、“木质纤维素水解液(lignocellulosichydrolysate)”与“生质水解液(biomasshydrolysate)”可被交替地使用。依据本发明，所述糖化可在所述发酵期间被进行，或者在所述发酵之前被进行。换言之，依据本发明的发酵制程可为同步糖化共发酵(simultaneoussaccharificationandco-fermentation,sscf)制程或分步水解共发酵(separatehydrolysisandco-fermentation,shcf)制程。依据本发明，所述生质在进行所述糖化之前可被进行一前处理(pretreatment)。依据本发明，所述前处理可破坏所述生质所含有的木质素以及纤维素的结构和/或促进所述生质所含有的半纤维素水解，进而提高后续糖化的效率。适用于本发明的前处理包括，但不限于：蒸气爆裂(steamexplosion)、热化学前处理法(thermalchemicalpretreatment)、机械粉碎、酸处理、有机溶解(organosolve)、亚硫酸盐前处理(sulfitepretreatment)，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，所述前处理是酸催化的蒸气爆裂(acid-catalyzedsteamexplosion)。有关前处理的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。依据本发明，所述含有可发酵糖的底物可进一步含有至少一种选自于由下列所构成的群组中的发酵抑制物：醋酸、羟甲糠醛、糠醛以及酚类化合物。较佳地，所述含有可发酵糖的底物进一步含有1至40g/l的醋酸。更佳地，所述含有可发酵糖的底物含有1至20g/l的醋酸。较佳地，所述含有可发酵糖的底物进一步含有0.5至5g/l的羟甲糠醛。更佳地，所述含有可发酵糖的底物含有1至3g/l的羟甲糠醛。较佳地，所述含有可发酵糖的底物进一步含有0.5至5g/l的糠醛。更佳地，所述含有可发酵糖的底物含有1至3g/l的糠醛。较佳地，所述含有可发酵糖的底物进一步含有0.3至4g/l的酚类化合物。更佳地，所述含有可发酵糖的底物含有0.5至2.5g/l的酚类化合物。依据本发明，所述发酵是在一范围落在5至8的ph值的条件下被进行。较佳地，所述发酵是在一范围落在5.5至7.0的ph值的条件下被进行。本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例仅是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。<实施例>一般实验方法：1.高效能液相层析(highperformanceliquidchromatography,hplc)分析：在下面的实施例中，纤维素水解液以及发酵培养物中所含有的葡萄糖、木糖、乳酸、醋酸、羟甲糠醛和/或糠醛及其等成份的浓度(g/l)是参考美国国家再生能源实验室(nationalrenewableenergylaboratory,nrel)所颁布的有关标准生物质分析的实验室分析程序(laboratoryanalyticalprocedures,laps)，并通过使用一配备有一个折射率(ri)检测器(refractiveindexdetector)的高效能液相层析仪(dionexultimate3000)来进行测定，而有关hplc的各项操作参数与条件被显示于下面的表1中。表1.hplc的操作参数与条件实施例1.具有高乳酸生产能力的可共发酵五碳糖与六碳糖的乳酸菌分离株的筛选(screeningofpentose-and-hexose-co-fermentinglacticacidbacteriaisolateshavinghighlacticacid-producingability)a.分离与筛选具有高乳酸生产能力的乳酸菌分离株：申请人使用采集自中国台湾台北市阳明山的土壤作为样品来源，并大体上参考j.qinetal.(2009),plosone,4(2):e4359当中所述的方法来进行乳酸菌分离株的筛选与纯化，不同处在于：使用木糖(xylose)来取代培养基中的葡萄糖，以作为菌株生长所需的碳源。经由数次筛选与纯化后，得到5株经纯化的乳酸菌分离株rbe1、rbe2、rbe3、rbe4以及rbe5。b.制备乳酸菌分离株rbe1至5的接种源(inoculum)：将依据上面第a项中所得到的乳酸菌分离株rbe1至5分别以一为5×109细胞/ml的接种量接种至90ml的ypd40培养基[含有10g/l酵母菌萃取物、40g/l葡萄糖以及20g/l蛋白胨(peptone)]，并加入适量的caco3将ph值调整至5至7，继而将之置于一恒温振荡培养箱(50℃、150rpm)内进行培养历时24小时。由此所得到的培养物被使用作为下面实施例中的乳酸菌分离株的接种源。c.筛选可共发酵五碳糖与六碳糖来生产乳酸的乳酸菌分离株将依据上面第b项中所得到的乳酸菌分离株rbe1至5的接种源各自分成1个五碳糖组、1个六碳糖组以及1个双糖组(dualsugargroup)，继而将各组以一为10％(v/v)的接种量分别接种至含有对应的糖类组成的具有如下面表2中所示的配方的发酵培养基(90ml)中。表2.各组发酵培养基的配方接着，将五碳糖组、六碳糖组以及双糖组于一厌氧条件下以及一恒温振荡培养箱(50至52℃、150rpm)中分别进行发酵反应历时16、24以及54小时。之后，将所得到的各组发酵培养物于12,000rpm下予以离心历时6分钟，而所得到的发酵产物(fermentationproduct)是依据上面“一般实验方法”的第1项「高效能液相层析分析」当中所述的方法来进行乳酸的含量分析。乳酸产率是参考y.c.kuoetal.(2015),bioresour.technol.,198:651-7当中所述的方法将所测得的乳酸含量以及发酵时间代入下列公式(1)而被计算出：公式(1)：a＝b/c其中：a＝乳酸产率(g/l/h)b＝所测得的乳酸含量(g/l)c＝发酵时间(h)所得到的结果被显示在下面的表3中。表3.各组所测得的乳酸产率由表3可见，无论是五碳糖组、六碳糖组以及双糖组，乳酸菌分离株rbe4的产率皆高于其他乳酸菌分离株所具者。申请人据此而认为：乳酸菌分离株rbe4具有开发潜力，因此将它拿来进行下面的驯化。实施例2.以纤维素水解液对乳酸菌分离株rbe4进行驯化(acclimatization)于本实施例中，申请人以纤维素水解液来对乳酸菌分离株rbe4进行驯化，借此提升其对纤维素水解液中的发酵抑制物的耐受性，进而提高乳酸产量。实验材料：首先，将作为纤维素生质的稻秆(购自于宏远农业商行)切成0.5cm的长度，继而以粉碎机予以粉碎，接着加入30g/l硫酸溶液予以混合均匀，并在121℃下进行反应历时120至180分钟。之后，将所得到的混合物置于一立式圆筒型高压蒸煮槽(购自于七福工业股份有限公司)，继而通入蒸气并在一为190至200℃的温度下进行加热处理历时5分钟。接着，使用一板框式压滤机(购自于水丽科技股份有限公司，型号fp500-5)来对通过上述酸催化蒸气爆裂前处理(acid-catalyzedsteamexplosionpretreatment)所得到的蒸煮液进行高压过滤处理以将其固形物含量调整至约25％。接着，以25％的氨水来将ph值调整至4.8-5.5，继而加入一由纤维素酶(cellulase)与半纤维素酶(hemicellulase)所构成的酶混合物(novozymesctec3，使用量为15至30fpu/克纤维素生质)，并在一为50至55℃的温度以及一为70rpm的搅拌速率下进行纤维素分解处理(cellulolyticprocesses)历时48小时。之后，进行高压过滤处理以去除固形物，借此而得到一纤维素水解液。所得到的纤维素水解液是依据上面“一般实验方法”的第1项「高效能液相层析分析」当中所述的方法来进行糖类以及发酵抑制物的含量分析。所得到的结果被显示在下面的表4中。表4.纤维素水解液中的糖类与发酵抑制物的含量成分含量(g/l)葡萄糖97木糖17醋酸3-5糠醛2-3.5羟甲糠醛1-2最后，对所述纤维素水解液添加3g/l的酵母萃取物，继而在121℃下进行灭菌处理历时20分钟，借此而得到一经灭菌的纤维素水解液。实验方法：将于上面实施例1的第b项「制备乳酸菌分离株rbe1-5的接种源」当中所得到的乳酸菌分离株rbe4的接种源以一为1％(v/v)的接种量接种至99ml的经灭菌的纤维素水解液中，继而置于一厌氧条件下以及一恒温振荡培养箱中(50至52℃、150rpm)进行培养历时72小时。接着，将所得到的培养物涂布于第二碳酸钙筛选培养盘上，并在50℃下静置培养24至48小时，继而从中挑选出生长快速的菌落。上述接种-培养-筛选步骤被重复进行100次，而得到一经驯化的乳酸菌分离株rbe4-4。实施例3.乳酸菌分离株rbe4-4对于发酵抑制物的耐受性的评估实验方法：有关乳酸菌分离株rbe4-4对于发酵抑制物(包括糠醛、羟甲糠醛以及醋酸)的耐受性的评估大体上是参考cn103667110a当中所述的方法来进行。首先，申请人将乳酸菌分离株rbe4-4以一为5×109细胞/ml的接种量接种至90ml的ypd40培养基中，继而置于一恒温振荡培养箱中(50℃、150rpm)进行培养过夜。接着，将所得到的乳酸菌分离株rbe4-4的培养物分为1个对照组以及5个实验组(亦即实验组1至5)，并将实验组1至5以一为1％(v/v)的接种量分别接种至添加有不同浓度的糠醛(亦即1至5g/l)的mrs乳杆菌肉汤培养基(difcotmlactobacillimrsbroth)(bdbioscience，购自于启新生物科技有限公司)(99ml)中，而对照组则是以相同的接种量被接种至未添加糠醛的mrs肉汤培养基(99ml)中。将各组的培养物置于一恒温振荡培养箱中(50℃、150rpm)进行培养历时24小时后，分别自各组的培养物中取100μl的体积并加入至一96-孔培养盘的各孔中，继而于420nm的波长下以一分光光度计(thermoscientific,biomatetm3s)来读取各孔的吸光值(od420)。各组的相对光学密度(％)(relativeopticaldensity,rod)是通过将所测得的od420代入下列公式(2)而被计算出：公式(2)：d＝(e/f)×100其中：d＝rod(％)e＝各组所测得的od420f＝对照组所测得的od420乳酸菌分离株rbe4-4对于羟甲糠醛以及醋酸的耐受性评估大体上是参照上面针对糠醛所描述的方式来进行实验，不同处在于：分别以羟甲糠醛(1至5g/l)以及醋酸(10至40g/l)来替代糠醛。此外，为供比较，未经驯化的乳酸菌分离株rbe4被拿来进行相同实验。针对不同的发酵抑制物所得到的实验结果分别被显示于下面的表5、表6以及表7中。表5.在不同的糠醛浓度下所测得的各组rod表6.在不同的羟甲糠醛浓度下所测得的各组rod表7.在不同的醋酸浓度下所测得的各组rod由表5可见，无论在何种浓度的糠醛的存在下，乳酸菌分离株rbe4-4所测得的rod皆高于乳酸菌分离株rbe4所具者，这表示乳酸菌分离株rbe4-4在糠醛的存在下的生长情形是优于乳酸菌分离株rbe4所具者。特别地，当糠醛的浓度达至4g/l以上时，乳酸菌分离株rbe4即已无法生长，而乳酸菌分离株rbe4-4仍可生长，并且在5g/l的糠醛的存在下的生长情形仍显著地优于乳酸菌分离株rbe4在3g/l的糠醛的存在下所具者。由表6可见，当羟甲糠醛浓度为2g/l以上时，乳酸菌分离株rbe4-4所测得的rod皆高于乳酸菌分离株rbe4所具者，这表示乳酸菌分离株rbe4-4在羟甲糠醛存在下的生长情形是优于乳酸菌分离株rbe4所具者。特别地，当羟甲糠醛的浓度达至4g/l以上时，乳酸菌分离株rbe4即已无法生长，而乳酸菌分离株rbe4-4仍可生长，并且在5g/l的羟甲糠醛的存在下的生长情形仍显著地优于乳酸菌分离株rbe4在3g/l的羟甲糠醛的存在下所具者。由表7可见，当醋酸浓度为20g/l以上时，乳酸菌分离株rbe4-4所测得的rod皆高于乳酸菌分离株rbe4所具者，这表示乳酸菌分离株rbe4-4在醋酸存在下的生长情形是优于乳酸菌分离株rbe4所具者。特别地，当醋酸的浓度达至35g/l以上时，乳酸菌分离株rbe4即已无法生长，而乳酸菌分离株rbe4-4仍可生长，并且在40g/l的醋酸的存在下的生长情形近似于乳酸菌分离株rbe4在30g/l的醋酸的存在下所具者。这个实验结果显示，相较于未经纤维素水解液驯化的乳酸菌分离株rbe4，经驯化的乳酸菌分离株rbe4-4对于发酵抑制物(包括糠醛、羟甲糠醛以及醋酸)具有更高的耐受性。实施例4.乳酸菌分离株rbe4-4的特征鉴定为了确认在上面实施例中所筛选出的乳酸菌分离株rbe4-4所属的菌种，乳酸菌分离株rbe4-4被拿来进行下面的初步试验、糖类发酵型态(carbohydratefermentationprofile)分析、16srdna序列分析，以及不同碳源的发酵测试。a.初步试验：申请人对乳酸菌分离株rbe4-4进行初步试验，试验项目包括：形态观察(morphologicalobservation)以及是否具有抗生素抗性(antibioticresistance)。依据初步试验结果，乳酸菌分离株rbe4-4为杆菌，并且对于安比西林(ampicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、康那霉素(kanamycin)，以及四环霉素(tetracycline)不具有抗性。b.糖类发酵型态(carbohydratefermentationprofile)分析：关于糖类发酵型态的分析是委托食品工业发展研究所(foodindustryresearchanddevelopmentinstitute,firdi)的生物资源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter,bcrc)并使用api50chb鉴定试剂盒v4.1(api50chbidentificationkitv4.1)(biomérieux)来进行，而所得到的分析结果被显示于下面的表8中。表8.乳酸菌分离株rbe4-4的糖类发酵型态分析结果*：“+”表示能够利用所测试的糖类进行发酵并产酸，而“－”表示无法利用所测试的糖类进行发酵。将上述分析结果与apiwebtm在线细菌与酵母菌数据库(apiwebtmon-linebacterialandyeastdatabase)进行比对后发现：本发明的乳酸菌分离株rbe4-4的糖类发酵型态与凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)所具者之间具有95.5％的相同性(identity)。c.16srdna序列分析：首先，使用一细菌基因组dna纯化试剂盒(bacterialgenomicdnapurificationkit)(购自于赛恩斯生物科技股份有限公司)来萃取乳酸菌分离株rbe4-4的基因组dna，继而以所得到的基因组dna作为模板(template)，并使用现有针对细菌的16srdna基因所设计的一前向引物(forwardprimer)27f(weisburgw.g.etal.(1991),j.bacteriol.,173(2):697-703)(序列辨识编号：1)以及一反向引物(reverseprimer)ph’(edwardsu.etal.(1989),nucleicacidsres.,17(19):7843-53)(序列辨识编号：2)来进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)，以扩增出乳酸菌分离株rbe4-4的16srdna片段。之后，委托明欣生物科技有限公司来进行测序分析，而得到乳酸菌分离株rbe4-4的16srdna序列(序列辨识编号：3)。经与ncbi网站中的基因数据库比对后发现，乳酸菌分离株rbe4-4的16srdna序列与凝结芽孢杆菌36d1的部分16srdna序列[genbank登录编号(accessionnumber)cp003056.1]之间具有99％的相似性。依据上面第a至c项的实验结果，本发明的乳酸菌分离株rbe4-4被初步鉴定是凝结芽孢杆菌，而为了确认凝结芽孢杆菌rbe4-4是否为一种新颖的凝结芽孢杆菌分离株，凝结芽孢杆菌rbe4-4被进一步拿来进行下面的分析。d.不同碳源的发酵测试：依据rheem.s.etal.(2011)(同上述)的揭示内容，凝结芽孢杆菌36d1可利用葡萄糖作为生长或发酵所需的碳源，但无法利用纤维素(cellulose)与木聚糖(xylan)。因此，申请人选用葡萄糖、纤维素以及木聚糖作为碳源来对凝结芽孢杆菌rbe4-4进行发酵测试。首先，参照实施例1的第b项「制备乳酸菌分离株rbe1-5的接种源」当中所述的方法来制备乳酸菌分离株rbe4-4的接种源。接着，将所得到的乳酸菌分离株rbe4-4的接种源分为1个葡萄糖组、1个纤维素组以及1个木聚糖组，并将各组以一为10％(v/v)的接种量分别接种至含有20g/l的对应碳源(包括葡萄糖、纤维素以及木聚糖)以及10g/l酵母萃取物的液态培养基(90ml)中。各组被置于一厌氧条件下以及一恒温振荡培养箱中(50℃、150rpm)进行发酵反应历时48小时之后，自各组的培养物中取100μl并加入至一96-孔培养盘的各孔中，继而于420nm的波长下以一分光光度计来读取各孔的吸光值(od420)，而所得到的结果被显示于下面的表10中。表10.各组在不同的碳源下所测得的od420组别所测得的od420葡萄糖组15.93纤维素组29.18木聚糖组323.6由表10看来，乳酸菌分离株rbe4-4可利用葡萄糖、纤维素以及木聚糖作为生长所需的碳源。特别地，当以木聚糖作为碳源时，乳酸菌分离株rbe4-4的生长速度最快。综合以上各项的特征鉴定结果，申请人认为：本发明的乳酸菌分离株rbe4-4是一株新颖的凝结芽孢杆菌分离株。本发明的凝结芽孢杆菌rbe4-4于公元2018年3月2日以保藏编号bcrc910831被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(bcrcoffirdi)(300新竹市食品路331号，中国台湾)，以及于公元2018年5月28日以保藏编号cctccm2018310被保藏于中国典型培养物保藏中心(chinacenterfortypeculturecollection,cctcc)。实施例5.使用纤维素水解液作为底物来进行乳酸发酵为了探讨本发明的凝结芽孢杆菌rbe4-4在使用纤维素水解液作为底物的情况下的乳酸发酵能力，下面的实验被进行。此外，为供比较，凝结芽孢杆菌rbe4以及凝结芽孢杆菌dsm1(bcrc10606，对应于atcc7050)(购自于中国台湾的食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心)被拿来进行相同的实验。a.分步水解共发酵(separatehydrolysisandco-fermentation,shcf)制程：首先，将依据上面实施例2的实验材料中所得到的纤维素水解液(其具有一如上面表4所示的糖类以及发酵抑制物)添加以10g/l的酵母萃取物，继而加入适量的25％的氨水以将其ph值调整至5.5至7.0。接着，参照实施例1的第b项「制备乳酸菌分离株rbe1-5的接种源」当中所述的方法来制备乳酸菌分离株rbe4-4、rbe4以及dsm1的接种源。之后，将凝结芽孢杆菌rbe4-4、rbe4以及dsm1的接种源以一为10％(v/v)的接种量分别接种至纤维素水解液(90ml)中，继而于一厌氧条件下以及一恒温振荡培养箱中(50℃、150rpm)进行发酵反应历时48小时。在发酵反应开始之后的第6、12以及24小时，对培养物添加适量的25％的氨水以使其ph值被维持在5.5至7.0。之后，将所得到的发酵培养物于12,000rpm下予以离心历时6分钟，而所得到的发酵产物是依据上面“一般实验方法”的第1项「高效能液相层析分析」当中所述的方法来进行乳酸的含量分析。实验被重复进行3次，而所得到的实验数据是以“平均值(mean)±平均值的标准误差(standarderrorofthemean,sem)”来表示。所得到的结果被显示在下面的表11中。表11.不同的凝结芽孢杆菌分离株所得到的乳酸产率凝结芽孢杆菌分离株乳酸产率(g/l/h)dsm10.697±0.2rbe41.69±0.18rbe4-42.11±0.14由表11可见，利用分步水解共发酵制程来发酵纤维素水解液生产乳酸时，使用凝结芽孢杆菌rbe4-4所得到的乳酸产率明显高于凝结芽孢杆菌rbe4以及dsm1所具者。b.同步糖化共发酵(simultaneoussaccharificationandco-fermentation,sscf)制程：首先，参照上面实施例2的实验材料当中所述的操作程序来进行纤维素水解液的制备，不同处在于：纤维素分解处理是在一为50至55℃的温度以及一为150rpm的搅拌速率下进行历时12小时，而使得纤维素未被完全分解，并且没有进一步去除固形物。所得到的纤维素水解液是依据上面“一般实验方法”的第1项「高效能液相层析分析」当中所述的方法来进行糖类以及发酵抑制物的含量分析。所得到的结果被显示在下面的表12中。表12.经初步分解处理的稻秆纤维素水解液中的糖类与发酵抑制物的含量成分含量(g/l)葡萄糖80.5木糖27醋酸2.5糠醛2羟甲糠醛1.2之后，参照上面第a项当中所述的操作程序来进行发酵反应，不同处在于：发酵反应被进行历时20小时，并且在发酵反应开始之后的第6和12小时，对培养物添加适量的25％的氨水以使其ph值被维持在5.5至7.0。所得到的结果被显示在下面的表13中。表13.不同的凝结芽孢杆菌分离株所得到的乳酸产率由表13可见，利用同步糖化共发酵制程来发酵纤维素水解液生产乳酸时，使用凝结芽孢杆菌rbe4-4所得到的乳酸产率明显地高于凝结芽孢杆菌rbe4以及dsm1所具者。综合以上的实验结果，申请人认为：当使用纤维素水解液作为底物时，无论是分步水解共发酵制程或同步糖化共发酵制程，本发明的凝结芽孢杆菌rbe4-4皆能展现优异的乳酸发酵能力。于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求所示者的限制。序列表<110>远东新世纪股份有限公司<120>具有高乳酸生产能力之凝结芽孢杆菌rbe4-4分离株及其用途<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221><223>用于扩增细菌的16srdna基因的前向引物27f<400>1agagtttgatcmtggctcag20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221><223>用于扩增细菌的16srdna基因的反向引物ph’<400>2aaggaggtgatccagccgca20<210>3<211>1546<212>dna<213>凝结芽孢杆菌rbe4-4(bacilluscoagulansrbe4-4)<400>3agagtttgatcatggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgtgc60ggaccttttaaaagcttgcttttaaaaggttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggc120aacctgcctgtaagatcgggataacgccgggaaaccggggctaataccggatagtttttt180cctccgcatggaggaaaaaggaaagacggcttcggctgtcacttacagatgggcccgcgg240cgcattagcttgttggtggggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgag300agggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagta360gggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggcc420ttcgggtcgtaaaactctgttgccggggaagaacaagtgccgttcgaacagggcggcgcc480ttgacggtacccggccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgt540aggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggcttcttaagt600ctgatgtgaaatcttgcggctcaaccgcaagcggtcattggaaactgggaggcttgagtg660cagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaaca720ccagtggcgaaggcggctctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggag780caaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagag840ggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggcc900gcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggttt960aattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacctccctggagac1020agggccttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgt1080cgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgaccttagttgccagcatt1140cagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtca1200aatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggc1260tgcgagaccgcgaggttaagccaatcccagaaaaccattcccagttcggattgcaggctg1320caacccgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaat1380acgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagt1440cggtgaggtaacctttacggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagt1500cgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacctcctt1546当前第1页1 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