玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1及其编码基因和应用。

背景技术：

玉米赤霉烯酮(zearalenone,zen)又被称为f-2毒素，它是由多种镰刀菌属产生的非甾体、具有类雌激素性质的霉菌毒素。zen的雌激素效应毒性不仅仅表现在损害雌性动物生殖能力，而且能引起雄性动物生殖系统的损害。此外，高剂量zen还具有肝肾毒性、肠道毒性、免疫毒性及其霉菌毒素的联合毒性，严重危害动物健康。

微生物降解法消除zen污染是利用微生物在代谢过程中产生的酶与zen作用，破坏zen分子的毒性基团，使其被降解或转化为无毒产物的过程。生物降解法降解zen专一性强、zen分子被转化效率高、不会引起环境污染，并且能够保留饲料原有营养价值。但目前所发现的玉米赤霉烯酮水解酶活性均较低，阻碍了玉米赤霉烯酮水解酶的大规模工业化生产及应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1。

本发明的再一目的在于提供上述突变体的编码基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1的应用。

根据本发明的具体实施方式，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1通过将野生型玉米赤霉烯酮水解酶zh607的第136-142位氨基酸由asvtgme突变为dillhih得到，其中，野生型玉米赤霉烯酮水解酶zh607的氨基酸序列如seqidno.1所示：

msttratktvttkdgikwhveqegngpdivlvpdglgecqmfdkpmsiiaasgfrvttfdmpgmsrsrdappetyrdvtghklagyvdtlleelkipiasvwgcssgattvlalcaafpervrnamphelptvnpasvtgmeekdpavisqemaavsrsisggteawdalgpevharlhdnyvrwargypvtippsaptksevlhkrpvdwtvgggtptamffdniviavkeglnigllpgghfpyvshpeafaeyvvetcrkyi

玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1的氨基酸序列如seqidno.2所示：

msttratktvttkdgikwhveqegngpdivlvpdglgecqmfdkpmsiiaasgfrvttfdmpgmsrsrdappetyrdvtghklagyvdtlleelkipiasvwgcssgattvlalcaafpervrnamphelptvnpdillhihekdpavisqemaavsrsisggteawdalgpevharlhdnyvrwargypvtippsaptksevlhkrpvdwtvgggtptamffdniviavkeglnigllpgghfpyvshpeafaeyvvetcrkyi

玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1编码基因的核苷酸序列如seqidno.3所示：

atgtccaccaccagagccaccaagactgttaccaccaaggatggaattaagtggcatgttgagcaagaaggaaacggtccagacattgtgttggttccagatggtttgggtgagtgtcaaatgtttgataagcccatgtccattattgcagcctccggttttagagtcactacctttgatatgccaggtatgagtagatccagagatgctcctccagaaacttacagagatgttaccggtcataagctggctggttacgttgacactttgcttgaggaattgaagattccaattgcttctgtttggggttgttcctctggtgctactactgttctggccttgtgtgctgcttttccagaaagagttagaaatgccatgccacacgagttgccaactgttaacccagatattttacttcatattcatgagaaggaccctgctgttatttctcaagaaatggctgctgtttcaagatcaattagtggtggtactgaagcctgggatgctttaggaccagaagttcatgctagacttcatgataattacgttagatgggctagaggttacccagtgactattccaccatctgccccaaccaagtctgaggttttgcataagagaccagttgattggacagttggtggtggtaccccaactgctatgttttttgataatattgtcatcgctgtcaaggaaggtttgaacattggtttgttgccaggtggtcatttcccatacgtttctcatcctgaagcttttgctgaatacgttgttgagacttgtagaaagtacatttaa

上述序列包含终止子，共798bp。

本发明还提供包含上述编码基因的重组表达载体，优选为ppicz(α)a-zh607-ah。

本发明还提供包含上述编码基因的重组菌株，优选为毕赤酵母x33(ppicz(α)a-zh607-ah)。

根据本发明具体实施方式的玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1的制备方法，包括以下步骤：

(1)用包含玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导表达玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1；

(3)分离并纯化所表达的玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1。

本发明还提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1的应用，尤其是在能源、食品和饲料领域。

本发明的有益效果：

本发明的玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1的酶活力由野生型的4940u/mg提高到了14419u/mg，是野生型的2.9倍，因此，本发明高酶活力突变体能够满足能源、食品和饲料等领域中对于玉米赤霉烯酮降解活性的要求，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示赤霉烯酮水解酶野生型及突变体在毕赤酵母x33中表达后的sds-page电泳检测结果。

具体实施方式

1、菌株及载体：本发明的表达宿主pichiapastorisx33，表达质粒载体ppicz(α)a。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，连接酶购自invitrog公司，其它都为国产试剂。

3、大肠杆菌培养基llb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％nacl，ph自然)。毕赤酵母培养基ypd(yeastextract1％,trytone2％，glucose2％ph自然)；bmgy(yeastextract1％,trytone2％,ynb10％,生物素0.1％,ph自然)；bmmy(yeastextract1％，trytone2％，甲醇0.5％，ynb10％，生物素0.1％，ph自然)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1含野生型赤霉烯酮水解酶基因的重组菌株x33(ppicz(α)a-zh607)的制备

1.1扩增赤霉烯酮水解酶蛋白野生型zh607的核酸序列zh607

经密码子优化后，得到赤霉烯酮水解酶zh607的编码基因zh607。采用pcr的方法扩增zh607基因及载体ppicz(α)a核酸片段，通过重组试剂盒将两者连接，获得重组质粒ppicz(α)a-zh607，并转化毕赤酵母x33，获得重组毕赤酵母菌株x33(ppicz(α)a-zh607)。

pcr所用引物如下：

表1野生型赤霉烯酮水解酶及载体扩增特异性引物

其中，zh607-ppicz(α)a-f及zh607-ppicz(α)a-r用于扩增赤霉烯酮水解酶野生型zh607的基因编码序列；ppicz(α)a-zh607-f及ppicz(α)a-zh607-r用于扩增可与zh607基因重组的ppicz(α)a载体核酸片段。

扩增结束后，将pcr产物进行核酸电泳检测，zh607和ppicz(α)a条带大小分别为835bp和3579bp(加引物)，分别回收纯化。

1.2构建重组菌株x33(ppicz(α)a-zh607)

将回收的zh607与ppicz(α)a基因片段通过试剂盒重组酶进行重组连接，然后将重组产物转化大肠杆菌transⅰ感受态，并涂布于llb(含100μg/mlzeocin)进行筛选。

待测序正确后，利用saci限制性内切酶将重组质粒ppicz(α)a-zh607进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞x33进行诱导表达，得到重组表达菌株x33(ppicz(α)a-zh607)。

实施例2含突变型赤霉烯酮水解酶基因的重组菌株x33(ppicz(α)a-zh607-ah)的制备

2.1重组质粒ppicz(α)a-zh607-ah的构建

经优化突变位点设计为将136-142位的asvtgme替换为dillhih，通过点突变试剂盒的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得赤霉烯酮水解酶突变质粒ppicz(α)a-zh607-ah。所用引物如表2所示：

表2突变体玉米赤霉烯酮水解酶特异性引物

2.2构建重组菌株x33(ppicz(α)a-zh607-ah)

利用saci将重组质粒ppicz(α)a-zh607-ah进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞x33进行诱导表达，得到重组表达菌株x33(ppicz(α)a-zh607-ah)。

实施例3赤霉烯酮水解酶蛋白野生型zh607及突变体zhdm1的获得

3.1蛋白zh607及zhdm1的诱导表达

将得到的重组表达菌株x33(ppicz(α)a-zh607)及x33(ppicz(α)a-zh607-ah)接种至ypd培养基中进行种子培养，200rpm，30℃培养48h后，以1％接种量转接至bmgy培养基中，200rpm，30℃培养48h，富集足够的菌体后收集菌体并加入到含有1％甲醇的bmmy培养基中进行诱导表达。

2.蛋白zh607及zhdm1的纯化

将诱导表达后的菌液12000rpm，10min离心，收集上清进行浓缩，再用10mm磷酸氢二钠溶液(柠檬酸调ph至7.6)进行透析，然后将透析后的酶液进行离子交换层析，a液为10mm磷酸氢二钠溶液(柠檬酸调ph至7.6)，b液为a液加1mnacl，纯化蛋白，收集洗脱液，进行sds-page，蛋白zh607及zhdm1蛋白纯化结果见图1。

实施例4玉米赤霉烯酮水解酶zh607及突变体zhdm1的活性检测

诱导表达后对玉米赤霉烯酮水解酶zh607及突变体zhdm1进行纯化及酶活的测定。

酶活的测定方法(zen由dmso溶)：

37℃反应0.5h，加入800μldmso终止反应。

终止反应后通过hplc检测对照组及实验组zen剩余峰面积。

酶活力单位(u)：在37℃，反应0.5h条件下，在1h内能转化1μgzen的酶量。

酶活计算(每毫升酶液所含酶活力单位)：反应体系中zen初始含量*(对照组峰面积-实验组峰面积)/对照组峰面积*2*稀释倍数*10。

在ph8.0,35℃的最适条件下对纯化的玉米赤霉烯酮水解酶zh607和突变体zhdm1进行比活性测定。经hplc检测，zh607的比活力为4940u/mg,突变体zhdm1的比活力为14419u/mg，经定点突变，突变体zhdm1的酶活力是野生型的2.9倍。

实施例5玉米赤霉烯酮水解酶野生型和突变体的基本特性

诱导表达后对zh607、zhdm1粗酶液进行纯化并测定基本性质。

在ph5.0-11.0，37℃的条件下测定，zh607、zhdm1的最适ph,反应时间为30min,使用的缓冲液为：130mm的na2hpo4-柠檬酸缓冲液(ph5.0-7.0)、130mm的tris-hcl(ph8.0)和130mm的甘氨酸-naoh(ph9.0-11.0)。为测定ph稳定性，将纯化后的酶液在37℃,ph5.0的条件下孵育1h,在标准条件下(ph8.0，37℃，反应30min)测定其剩余活性。反应测定具体方法如实施例4所示。

在25℃-55℃的温度范围，ph8.0的条件下反应30min测定温度对纯化zh607、zhdm1活性的影响。

结果显示，zh607、zhdm1的最适ph为8.0，最适温度均为35℃。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1及其编码基因和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>265

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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151015

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202530

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65707580

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