检测HPV的组合物、试剂盒及方法与流程

本发明属于分子学生物检测领域，更具体的，属于hpv检测领域。
背景技术：
：人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)是一类分子量较小的无包膜的双链环状dna病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(e区)、晚期转录区(l区)和非转录区(长控制区，lcr)，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。而hpv感染以后不仅可能会出现生殖器疣或皮肤疣，更有可能诱发女性宫颈癌，据相关报道，90％以上的宫颈癌都是由hpv感染引起的。在临床上，根据人乳头瘤病毒不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将人乳头瘤病毒分为高危型和低危型两大类。低危型hpv一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌，高危型hpv感染引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变。关于高危型与低危型的划分，国际上许多机构都给出了参考建议，依据who国际癌症研究机构(iarc)及其他国际组织的研究成果，建议将hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型别，26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别。据此，本领域中存在着对hpv进行全面的检测的需求。例如，中国专利申请201110156111.8公开了一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其能够对18种hpv基因型进行检测，检测型别比较全面，且灵敏度也比较高，为1×103拷贝/ml；但其无法实现16和18具体分型，因为在该试剂盒中，18型和45型必须共用一组探针，从而无法区分18和45型，导致不能对16和18分型。实际上，hpv16和hpv18的具体分型，在宫颈癌的筛查具有重要的分流作用。如saslowd等指出：目前acog和acs/asccp/ascp均建议将hpv16、18分型检测作为分流hpv检测阳性而细胞学阴性患者的标准，即hpv16、18分型检测阳性者建议行阴道镜检查，或在12月内复查hpv和细胞学。因此，在本领域中存在着在检测hpv的同时将hpv16、18具体分型的需求。对此，硕世生物科技有限公司提供了一种hpv检测试剂盒，名为硕世高危型人乳头瘤病毒(hpv16+2)核酸检测试剂盒，该试剂盒可以检测18种型别，包括16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82；可具体对16和18分型，但这一检测试剂在灵敏度方面有所牺牲，其灵敏度为5×105拷贝/ml。因此，在本领域中存在着既能对hpv16和18具体分型又能达到较高灵敏度的hpv检测试剂。技术实现要素：为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种能够对hpv16/18分型的引物和探针的组合物，其还能够用于检测hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型，所述组合物包括：如seqidno:1所示的hpv16型上游引物、如seqidno:2所示的hpv16型下游引物和如seqidno:3所示的hpv16型探针；如seqidno:4所示的hpv18型上游引物、如seqidno:5所示的hpv18型下游引物和如seqidno:6所示的hpv18型探针；如seqidno:7所示的hpv31型上游引物、如seqidno:8所示的hpv31型下游引物和如seqidno:9所示的hpv31型探针；如seqidno:10所示的hpv33型上游引物、如seqidno:11所示的hpv33型下游引物和如seqidno:12所示的hpv33型探针；如seqidno:13所示的hpv35型上游引物、如seqidno:14所示的hpv35型下游引物和如seqidno:15所示的hpv35型探针；如seqidno:16所示的hpv45型上游引物、如seqidno:17所示的hpv45型下游引物和如seqidno:18所示的hpv45型探针；如seqidno:19所示的hpv51型上游引物、如seqidno:20所示的hpv51型下游引物和如seqidno:21所示的hpv51型探针；如seqidno:22所示的hpv52型上游引物、如seqidno:23所示的hpv52型下游引物和如seqidno:24所示的hpv52型探针；如seqidno:25所示的hpv58型上游引物、如seqidno:26所示的hpv58型下游引物和如seqidno:27所示的hpv58型探针；如seqidno:28所示的hpv39、59、68型上游引物、如seqidno:29所示的hpv39、59、68型下游引物和如seqidno:30所示的hpv39、59、68型探针；如seqidno:31所示的hpv53、56、66型上游引物、如seqidno:32所示的hpv53、56、66型下游引物和如seqidno:33所示的hpv53、56、66型探针；其中，hpv16和18型的探针的荧光报告基团不同，且hpv16和18探针与其余hpv探针的荧光报告基团也不相同。本发明的组合物针对16和18型单独设计引物和探针，能够实现16/18分型。同时，在与其余引物和探针的配合下，灵敏度仍能达到1×103拷贝/ml。需要指出的是，在检测过程中不但要保证这些检测类型各自的特异性和灵敏度，还要保证避免这些引物和探针直接的互相影响(诸如形成二聚体等)；其次，由于待检测的不同类型hpv核酸序列高度同源，一方面要选取高度保守的序列，另一方面还需要该序列在不同毒株中又有一定水平的差异。此外，本发明使用的是具有通常长度的普通探针，而并未使用可以减小探针碱基数的mgb探针。mgb探针连接有mgb(minorgroovebinder)修饰基团，在获得同样的tm值的情况下，其可以比普通taqman探针设计得更短并因此降低了探针设计的难度，而在灵敏度、特异性方面通常优于普通探针。尽管如此，mgb探针的引入会导致成本不可避免的升高，从而不利于推广使用。而本发明的组合物在采用普通探针，在节约成本的同时，仍然解决了可能存在的探针过长使得探针不易设计以及灵敏度和特异性不好的问题。值得说明的是，本发明针对hpv的e区域进行引物和探针设计，这进一步避免了hpv发生整合时l1区随机丢失而造成的假阴性结果。另一方面，本发明的组合物中分别采用了一组引物和探针实现了对hpv53/56/66型以及39/59/68的同时检测，即用11对引物和探针就能检测15种类型的hpv。通过使用这些引物和探针，有效地降低了成本，并且避免了引物和探针过多而出现的潜在影响，提高了灵敏度和特异性。本发明的组合物采用多重pcr，在一管之中就能够实现同时检测15种类型的hpv，即16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型。需特别指出的是，如在
背景技术：
中所述，hpv高危型加中危型一共18种类型，而在5种hpv中危型当中，53和66型在中国(特别是在少数民族中)更为流行，因此实际上本发明的引物和探针同时检测15种hpv，包含了高危的13种hpv，以及在中国更为流行的53和66型，使得本发明的产品更适合于国内人群的hpv检测，尤其能满足中国少数民族的需要。在一个具体的实施方式中，hpv16探针的荧光报告基团为cy5，hpv18探针的荧光报告基团为fam，其余hpv探针的荧光报告基团为rox。在优选的实施方式中，所述本发明中的组合物还包括：用作内标检测的组合物。具体地，用作内标检测的组合物可包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针。在一个实施方式中，内标上游引物具有seqidno:34所示的序列，内标下游引物具有seqidno:35所示的序列，内标探针具有seqidno:36所示的序列。进一步地，内标探针带有荧光报告基团与其余探针不同，例如为hex或vic。也就是说，本发明的组合物可进一步包括内标引物以及内标探针。其可与本发明的组合物中的其它引物和探针联用且互不影响。内标引物和探针的使用能够判断本次检测是否有效，进一步确保所述组合物的检测准确性。在优选的实施方式中，本发明组合物中引物seqidno:28和29的用量为0.15μmol/l-0.5μmol/l，其余的引物的用量约为0.08μmol/l-0.5μmol/l。在优选的实施方式中，本发明组合物中探针seqidno:15和24的用量为0.02μmol/l-0.15μmol/l，其余的探针的用量约为0.04μmol/l-0.15μmol/l。通过使用如上所述的引物和探针的用量，扩增曲线的ct值更为靠前，这代表使用如上所述的引物和探针的用量，其灵敏度更高，同时还保证了扩增效率，避免了引物二聚体的形成和非特异性产物的产生。更优选地，本发明组合物中引物seqidno:28和29的用量约为0.15μmol/l-0.25μmol/l，例如约为0.2μmol/l，其余引物的用量约为0.08μmol/l-0.15μmol/l，例如0.1μmol/l。更优选地，本发明组合物中探针seqidno:15和24的用量约为0.02μmol/l-0.03μmol/l，例如约为0.025μmol/l，其余探针的用量约为0.04μmol/l-0.07μmol/l，例如0.05μmol/l。通过使用如上所述的引物和探针的用量，除了具备前述的优点之外，还具有使用量小，对pcr体系影响小，成本低等优点。在第二方面，本发明还提供了上述组合物在制备检测hpv并对hpv16/18分型的试剂盒中的用途，所述hpv为hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型。在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的组合物。进一步地，所述试剂盒还包括提取dna所需试剂、mg2+、dntps、dna聚合酶、糖基化酶、pcr缓冲液中的至少一种。在一个具体的实施方式中，各成分具体终浓度为mg2+0.1～0.4mmol/l、dntps1～2mmol/l、dna聚合酶0.5～2mmol/l、糖基化酶0.05-0.15mmol/l。在第四方面还提供了本发明的试剂盒用于hpv检测的用途。在第五方面，本发明提供了用于检测hpv的方法，所述方法包括以下步骤：1)提取待测样本的dna；2)使用上述本发明的组合物或试剂盒对步骤1)获得的dna进行荧光定量pcr检测；3)获得并分析结果。在本发明中，用于检测样本可以是疣体表面脱落细胞、妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等，但不限于此。在一个具体实施方式中，所述步骤1)中的提取待测样本dna的方法为磁珠法。总的说来，本发明的产品，在全面覆盖所有高危型的hpv的同时，还能够针对性的检测53和66型，更适合国内人群hpv的检测，同时还能对16和18型进行分型，对临床阴道镜做指导。并进行了临床试验，在临床上有较高的临床灵敏度和临床特异性。除此之外，本申请还采用一组引物和探针检测了多种类型，减小了探针和引物过多而造成的干扰，降低了成本的同时，也保证了本发明产品的灵敏度和特异性。附图说明图1为hpv16型3套引物探针筛选的ct值的结果图；图2为hpv16型高中低浓度的引物量的结果图；图3为hpv16型高中低浓度的探针用量的结果图；图4为检测样本的roc曲线图。具体实施方式下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。实施例1、本发明所使用的引物及探针设计和筛选1、引物及探针设计应用dnastar软件包中的seqman和megalign软件对genbank中检索到的15种人乳头瘤病毒高危型基因组序列进行同源性比较，找e区间特异且型内保守区段，在引物、探针设计软件primerexpress3.0和primerpremier5.0软件的辅助下，并通过genbank数据库中blast工具的检索分析，每型别设计出3套引物和对应的探针。同时，找出β-球蛋白基因保守区段，以相同方法针对β-球蛋白基因设计3套引物和对应的探针，命名见表1，序列分别见表2-4。表1设计的3套引物探针编号表2第一组引物探针序列信息表3第二组引物探针序列信息表4第三组引物探针序列信息其中，f和r为扩增引物的正向和反向引物对，gb-f和gb-r为内标引物对，p为检测探针。同时，我们在反应体系中对hpv16型及hpv18探针采用cy5及fam荧光标记，其余13种型均采用rox荧光标记，内标探针带有荧光报告基团hex或vic，所以可同时检测出hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型感染，并能对hpv16及18型进行分型。2、引物探针筛选2.1制备hpv15种高危型人乳头瘤病毒16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68的e区域假病毒，浓度1.00～5.00e+06拷贝/ml。对设计的3套引物、探针等与pcr反应体系混合检测，筛选较好的引物探针。2.2以hpv16型为例，取5μl的hpv16型假病毒分别与3套引物探针(hphr16-f1、hphr16-r1、hphr16-p1，hphr16-f2、hphr16-r2、hphr16-p2和hphr16-f3、hphr16-r3、hphr16-p3)以及表5的pcr-mix混合，上机检测。表5pcr-mix反应液体系2.3荧光pcr反应(在荧光定量pcr扩增仪上进行)1)将pcr反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。2)荧光检测通道选择；3)荧光定量pcr反应条件为：2.4结果分析反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本ct值和定值结果。结果如图1所示，发现16的第1套引物探针的ct值靠前，且曲线光滑，扩增效率高。按照相同的实验步骤对其余的引物和探针进行了筛选，发现18、31、45、51、(39/59/68)、(53/56/66)、β-globin(内标)的第一套引物和探针以及33、35、52、58的第2套引物探针的ct值靠前，且曲线光滑，扩增效率高。实施例2、引物和探针用量优化一般pcr反应中引物用量影响着扩增，引物浓度过低则产物量降低，引物浓度过高不仅促进非特异性产物的产生，而且还会增加引物二聚体的形成。针对15种型别设计了12对引物探针，然后对着12对引物探针采用15种hpv高危型高、中、低浓度的假病毒(浓度1.00～5.00e+08拷贝/ml，浓度1.00～5.00e+06拷贝/ml，浓度1.00～5.00e+04拷贝/ml)进行检测比较。以hpv16型为例，先固定其他组分用量，然后采用0.05μmol/l、0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.4μmol/l引物量如表6进行pcr反应液的配制，然后用取5μl的hpv16型假病毒进行pcr检测，根据实施例1的pcr扩增检测，然后分析结果，获得最佳的引物用量。同理，在筛选好引物浓度后，固定最佳的引物以及其他的组合用量，再针对不同探针量0.0125μmol/l、0.025μmol/l、0.05μmol/l、0.1μmol/l如表7进行pcr反应液的配制以筛选，获得最佳的探针用量。表6引物用量优化实验中pcr反应液的配制表7探针用量优化实验中pcr反应液的配制通过对hpv16型高中低浓度的不同引物探针量探讨结果分析，高中低浓度检测效果一致，发现在引物用量为0.05μmol/l时候ct值比0.1μmol/l拖后，且随着引物量继续增加时，ct值差异不大，如图2所示。因此增加引物用量对于扩增影响不大，筛选出最佳的引物量为0.1μmol/l。然后分别对hpv16型探针用量的探讨，通过检测发现在中浓度和低浓度是采用0.0125μmol/l和0.025μmol/lct值较0.05μmol/l的拖后，且随着引物量继续增加时，0.05μmol/l和0.1μmol/lct值差异不大，如图3所示。因此筛选出最佳的探针用量为0.05μmol/l。依照与hpv16型相同的方法，随后对各引物探针量分别进行探讨，结果总结于表8。表8引物和探针最优用量实施例3hpv检测实验1、试剂准备：根据待测样本、阴性对照、阳性对照数量，按比例(pcr反应液38～44μl/人份+酶混合液3～5μl/人份)取相应量的反应液、酶混合液，充分混匀成pcr-mix，pcr-mix中的各引物和探针按照如上表8所述加入，将pcr-mix瞬时离心后备用。2、样本处理从样本收集管中吸取1ml样本至1.5ml离心管，作为待测样本备用，推荐使用湖南圣湘生物科技有限公司的样本释放剂按其说明书操作进行核酸提取。或使用湖南圣湘生物科技有限公司的核酸提取或纯化试剂按其说明书操作进行核酸提取。提取的样本取出10μl用于pcr扩增。3、荧光pcr反应与结果分析(在荧光定量pcr扩增仪上进行)1)将pcr反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。2)荧光检测通道选择：选择fam通道检测人乳头瘤病毒18-dna；选择hex或vic通道检测β-球蛋白(内标)；选择cy5通道检测人乳头瘤病毒16-mrna；选择rox通道检测人乳头瘤病毒31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68-dna。3)荧光定量pcr反应条件如实施例1所示。4、结果分析反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本ct值和定值结果。对于测定fam、cy5、rox通道ct值≤40.5的样本，hex/vic通道内标ct值≤40.5，报告为高危型人乳头瘤病毒阳性；对于测定fam、cy5、rox通道ct值≤40.5的样本，hex/vic通道内标ct值>40.5或无显示，表明标本内没有宫颈上皮细胞，建议对此样本进行重新取样再进行实验，如重复此现象，则报告高危型人乳头瘤病毒阳性。对于测定fam、cy5、rox通道ct值>40.5的样本，hex/vic通道内标ct值≤40.5，报告为高危型人乳头瘤病毒阴性(包括高危型人乳头瘤病毒dna含量低于检测下限或在预定的阳性判断值之下)。对于测定fam、cy5、rox通道ct值>40.5的样本，hex/vic通道内标ct值>40.5或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重新取样再进行实验。实施例4、特异性分析以易引起相同或相似的临床症状的病原体(沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌、单纯疱疹病毒ⅱ型、梅毒螺旋体、白色念珠菌、阴道毛滴虫、人型支原体、hpv常见低危型40、42、43、44)、其他hpv基因型(国家人乳头瘤病毒全基因组分型参考品)为待测样本进行交叉反应研究。交叉反应中所用梅毒螺旋体、淋球菌、白色念珠菌、阴道毛滴虫、人型支原体、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌和单纯疱疹病毒ⅱ型样本均收集自湖南省肿瘤医院；hpv6、hpv11、hpv26、hpv61、hpv67、hpv69、hpv71、hpv73、hpv81、hpv82来自国家人乳头瘤病毒全基因组分型参考品，其说明书显示均为全基因组重组质粒，浓度为106拷贝/ml左右。hpv40、hpv42、hpv43、hpv44为人工克隆的hpv基因组dna质粒，委托泰和永昌(长沙)生物技术有限公司合成，采用分光光度计测量并计算质粒浓度，用te稀释至106拷贝/ml。以易引起相同或相似的临床症状的病原体以及hpv其他型别进行核酸的提取，然后取核酸10μl与pcr-反应液体系(40μl)按表9混合，根据实施例3中的操作进行pcr扩增反应，然后统计结果见表10、表11。表9pcr反应液的配制表10易引起相同或相似的临床症状的病原体检测结果表1125例人乳头瘤病毒全基因组分型参考品检测结果统计标识型别611161826ct值noctnoct24.0224.20noct报告结果阴性阴性阳性，16型阳性，18型阴性标识型别3133354556ct值23.9123.8823.9323.9623.88报告结果阳性，其他型阳性，其他型阳性，其他型阳性，其他型阳性，其他型标识型别5859616667ct值23.9323.93noct23.90noct报告结果阳性，其他型阳性，其他型阴性阳性，其他型阴性标识型别6971738182ct值noctnoctnoctnoctnoct报告结果阴性阴性阴性阴性阴性标识型别n1n2n3n4n5ct值noctnoctnoctnoctnoct报告结果阴性阴性阴性阴性阴性由上述表10和表11中可以看出，易引起相同或相似的临床症状的病原体(沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌、单纯疱疹病毒ⅱ型、梅毒螺旋体、白色念珠菌、阴道毛滴虫、人型支原体、hpv常见低危型40、42、43、44)、其中hpv16、18、31、33、35、45、56、58、59、66型参考品均检测为阳性且分型准确，不在本试剂盒检测范围内的其他hpv参考品及5例阴性参考品均检测为阴性。综上所述，本试剂盒具有很好的准确性和特异性，不会产生交叉反应。实施例5灵敏度分析分别将已定值的15种hpv高危型样本依次稀释至1.00e+06拷贝/ml、1.00e+05拷贝/ml、1.00e+04拷贝/ml、1.00e+03拷贝/ml、5.00e+02拷贝/ml，以所有稀释样本为待测样本，使用质检合格的hpv高危型(13+2)检测试剂盒进行检测，其中1.00e+06拷贝/ml、1.00e+05拷贝/ml、1.00e+04拷贝/ml浓度的样本每个检测1次(每个梯度共15个样本)，1.00e+03拷贝/ml、5.00e+02拷贝/ml每个检测3次(每个梯度共45个样本)，分别与实施例4中的pcr反应液体系混合，按实施例3上机检测，统计结果见表12，确定本试剂盒的最低检测限。表12各梯度样本阳性检出率统计待测样本阳性数/样本数阳性检出率(％)1.00e+06拷贝/ml15/15100％1.00e+05拷贝/ml15/15100％1.00e+04拷贝/ml15/15100％1.00e+03拷贝/ml45/45100％5.00e+02拷贝/ml36/4580％由上述表格可以看出，浓度为1.00e+03拷贝/ml及以上的样本阳性检出率为100％，而浓度为5.00e+02拷贝/ml的样本阳性检出率为80％。因此，确定本试剂盒的最低检测限为1.00e+03拷贝/ml。实施例6阳性判断值的确定临床灵敏度是来衡量试剂检测出有病者的能力，是将实际有病的人正确地判断为真阳性的比例。临床特异度是衡量试验正确判断无病者的能力，是将实际无病的人正确的判定为真阴性的比例。临床上对于该类试剂的应用并不在于查找是否有无病毒，而是在于查找是否存在病变或病变的风险，因此必须进行阳性判断值(cutoff值)的研究。宫颈病变检测的金标准是宫颈组织病理学检测，因此通过病理结果(cin1-为阴性，cin2+为阳性)为分界点，采用受试者工作特征(roc)曲线的方式进行相关研究。选取471份临床样本，来自中国医学科学院肿瘤医院及南京市中医院，并涵盖不同病理分期，采用湖南圣湘生物科技有限公司的样本释放剂按其说明书操作进行核酸提取，分别与实施例3中的pcr反应液体系混合，进行上机检测，统计结果。采用以病理诊断“cin2+”为阳性判断标准，roc曲线分析，获得理想的临床灵敏度和临床特异性的临界值(cutoff)，拟定本试剂盒目标基因的临床阳性判断值。通过对这471份样本检测，有430例为16/18/其他型中的单重感染，39例样本为双重感染，2例样本为三重感染，因此共计输出430*1+39*2+2*3＝514份ct值数据。对于无ct值显示的(noct)，将ct值设定为45(pcr扩增程序中的反应循环数为45)。以病理结果为标准来判断样本的阴阳性(cin1-为阴性，cin2+为阳性)，用spss19.0软件对上述514份检测ct值数据进行roc分析，结果如图4所示。由以上roc分析的输出结果可以看出：roc曲线下的面积为0.906，表明试剂的诊断准确度很好，具有较高的诊断价值。分析计算最佳诊断界值，如下表13所示：表13目标基因检测结果临床cutoff值分析为了保证本试剂盒具备较高的敏感性，因此对灵敏度的要求需在0.93以上，在此前提下，尽量保持较高的特异度。由上表13可见，综合灵敏度和特异度，当ct值在40.250～41.445之间时，试剂盒的灵敏度均在0.93以上，特异度均在0.78以上，综合考虑，暂拟定目标基因检测的ct阳性判断值为40.5：≤40.5的判为阳性；>40.5的判为阴性。以此标准判断上述471份临床样本，各临床性能指标如下：表14471份样本临床性能统计由上表可见，以40.5为临床阳性判断值，检测此471例样本，对于cin2+的诊断，灵敏度为93.0％(88.7-96.0)，特异度为79.8％(74.4-84.6)，阳性预测值为79.2％(73.6-84.1)，阴性预测值为93.2％(89.1-96.2)，临床性能符合预期。以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。序列表<110>圣湘生物科技股份有限公司<120>检测hpv的组合物、试剂盒及方法<160>108<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1cacaggagccacccagaaag20<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列<400>2gtcatatacctcacgtcgcagtaac25<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列<400>3ccacagttatgcacagagctgcaaacaac29<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4tcagaggaagaaaacgatgaaatag25<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<400>5ctggcttcacacttacaacacatac25<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<400>6aatcatcaacatttaccagcccgacg26<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7agccaacaacaccaccacatc21<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<400>8gctctgttcttggtcgcttagtag24<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9tcgcccgccgcacaccttca20<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列<400>10accgcccagccccttac17<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列<400>11gtccgctgcttgtttgtgc19<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列<400>12ccgccttggacaatagaacagcacg25<210>13<211>26<212>dna<213>人工序列<400>13tatttagcagcacagaactatccact26<210>14<211>24<212>dna<213>人工序列<400>14ttgtgatttgtcttctgggtttct24<210>15<211>27<212>dna<213>人工序列<400>15ctacacgcctacaacaccaccgagacc27<210>16<211>24<212>dna<213>人工序列<400>16agtaccgagggcagtgtaatacat24<210>17<211>24<212>dna<213>人工序列<400>17ggttccaaatgcaatacaatttct24<210>18<211>24<212>dna<213>人工序列<400>18accaggcacggcaagaaagacttc24<210>19<211>21<212>dna<213>人工序列<400>19gacttgcaatgctacgagcaa21<210>20<211>26<212>dna<213>人工序列<400>20ggtagctggtcacgcatattatctac26<210>21<211>26<212>dna<213>人工序列<400>21tcatcctcctcctctgagctgtcaaa26<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<400>22ctccaagacctccgcagtgt20<210>23<211>18<212>dna<213>人工序列<400>23tgttgtccccgcaaaagg18<210>24<211>28<212>dna<213>人工序列<400>24cacacacctacaaccaccacagaaacga28<210>25<211>24<212>dna<213>人工序列<400>25cagacattttttggtaggctactg24<210>26<211>21<212>dna<213>人工序列<400>26ccaacgcctgacacaaatcat21<210>27<211>24<212>dna<213>人工序列<400>27tccgtggtttctcctctgcgtcct24<210>28<211>20<212>dna<213>人工序列<400>28tttgtgtgtccgtggtgtgc20<210>29<211>19<212>dna<213>人工序列<400>29aaccatccgttacaacccg19<210>30<211>22<212>dna<213>人工序列<400>30tcccctccccatctgtaccttc22<210>31<211>21<212>dna<213>人工序列<400>31gacctgcaatgcaatgagcaa21<210>32<211>24<212>dna<213>人工序列<400>32ctcctgcaaatggtctacttcatc24<210>33<211>26<212>dna<213>人工序列<400>33tcatcctcatcctctgagctgtccaa26<210>34<211>20<212>dna<213>人工序列<400>34cacaggagccacccagaaag20<210>35<211>25<212>dna<213>人工序列<400>35gtcatatacctcacgtcgcagtaac25<210>36<211>29<212>dna<213>人工序列<400>36ccacagttatgcacagagctgcaaacaac29<210>37<211>24<212>dna<213>人工序列<400>37tttagcagcacagaact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