一种用于FISH的快速标记基因组探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种用于fish的快速标记基因组探针及其制备方法和应用。
背景技术：
：由染色体畸变引起的疾病难以治愈，危害严重；目前，针对染色体异常检测的重要方法之一为荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，fish)，该技术是将dna（或rna）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或dna纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测dna序列在染色体或dna纤维切片上的定性、定位、相对定量分析；具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核，为疾病诊断提供可靠的依据，早发现早治疗，使患者减少痛苦。然而目前荧光原位杂交方法耗时长，杂交条件苛刻；且探针有制备繁琐，批次差异比较大，特异性不高，信号背景偏高等缺点，基于此，有必要提供一种特异性高、杂交效率高且检测时间短的荧光原位杂探针及其制备方法。crispr-cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。而crispr-cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定dna修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法。crispr-cas9是基因组调控技术中灵活性最强的系统之一。cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域:ruvc和hnh。这两个结构域分别负责切割dna链的两条链，并且这两个结构域能够单独地被人工点突变失活。当ruvc和hnh同时处于失活状态时(d10a＆h840a;ruvc-＆hnh-)，cas9将不具有核酸酶活性，成为dcas9(deadcas9)。dcas9虽然没有剪切dna的能力，但仍然可以在grna的引导下与特定的dna序列结合。基于以上原理，应用cas9体系有开发出标记基因组dna的潜力。技术实现要素：本发明的目的是研发一种用于fish的快速标记基因组探针及其制备方法和应用，采用最新技术dcas9蛋白，在sgrna的引导下标记靶基因，应用该方法标记基因具高效，快速，准确的特点，且样本可以包含非变性和变性两种。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明目的在于提供一种用于fish的快速标记基因组探针的制备方法，包括如下步骤：（1）制备dcas9蛋白：原核表达及纯化得到dcas9蛋白，将荧光染料标记dcas9蛋白；（2）制备sgrna库：从ncbi下载目标基因序列，针对目标基因区域保守序列，利用在线网站http://crispr.mit.edu/分析可能的sgrna位点，其中pam序列为ngg，在每条sgrna核心序列的5’端加上19bp的序列如seqidno.36所示，3’端加上86bp的序列如seqidno.37所示，得到一系列优化sgrna序列，化学合成所述优化sgrna序列，将合成的sgrna序列连入puc57-simple质粒，通过质粒pcr扩增、pcr产物体外转录、转录产物纯化，得到一系列sgrna，即sgrna库，pcr扩增引物如seqidno.38、seqidno.39所示；（3）构建探针库：将步骤（1）中所得的荧光染料标记的dcas9蛋白分别与步骤（2）中所得的sgrna库混合组装，所述dcas9蛋白与所述sgrna库按照摩尔比例为1：1-1:4进行混合组装，即得到sgrna-dcas9酶探针库。上述方案中，步骤（2）的pcr扩增体系如下：质粒模板1ul上游引物1ul下游引物1ul2xpcrmix25h2oto50ul上述方案中，步骤（2）的pcr反应条件为：95℃5min；95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，共进行35个循环。本发明的另一目的在于提供一种用于fish的快速标记基因组探针，该探针根据上述一种用于fish的快速标记基因组探针的制备方法制备得到。本发明的另一目的在于提供一种快速荧光原位杂交检测试剂盒，该试剂盒含有上述用于fish的快速标记基因组探针。上述试剂盒在制备用于快速荧光原位杂交检测产品中的应用。本发明的有益效果如下：具有快速、经济、操作方便等优点：（1）传统fish操作需要加热和甲酰胺处理，使得双链dna变性进行杂交，需要数小时或更长时间。dcas9介导的fish技术利用crispr系统进行dna快速杂交，该方法在优化的条件下仅需要约1小时；同时sgrna-dcas9酶探针比核酸探针有准确性高，特异性好、假阳性低等优点；（2）cas9介导的fish技术操作条件温和（室温和37°c），因此可以更好地维持细胞形态和dna结构；（3）传统fish每条探针均需要荧光标记，操作繁琐，成本高；而dcas9介导的fish技术操作简便，成本低：只需荧光标记dcas9蛋白，标记的dcas9蛋白库可与针对不同目的基因设计的多条sgrna灵活组装为探针库。附图说明：图1gapdh基因检测结果。具体实施方式：下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明本发明，而不视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：dcas9蛋白的表达和纯化将质粒pet302-6his-dcas9-halo（addgene，72269）转化入e.colibl21(de3)，进行原核表达并纯化蛋白。其中histag利于蛋白纯化；halotag用于蛋白的荧光标记。具体操作如下：（1）质粒转化bl21（de3）感受态细胞，涂板后37℃倒置培养过夜；（2）选取单克隆于5mllb培养液中37℃培养过夜；（3）次日1:50接种到新lb培养基扩大培养至1l，至菌体od600为0.6-0.8，加入iptg至终浓度为1mm，16°c培养16h后离心，收集菌体；（4）takaranihis标签纯化柱洗脱并收集蛋白；（5）将洗脱蛋白透析至buffer（50mmhepes(ph7.5),100mmkcl,1mmtcep）中，并用50,000-mwco超滤管（millipore）超滤后收集纯化蛋白；（6）将已纯化蛋白加入甘油（含量20%），-80°c储存，备用。实施例2：dcas9蛋白荧光标记将染料（halotag®alexafluor®488，promega）按照protocol将实施例1中制备的dcas9蛋白进行标记。具体操作如下：（1）染料：蛋白样品按照如下体系混匀后室温孵育30min，随后4°c孵育过夜，体系为lysate20ul，ligand(50um)1ul，1×50mmhepes(ph7.5）9ul，共30ul；（2）50,000-mwco超滤管（millipore）超滤除去未结合的染料；（3）用buffer（50mmhepes(ph7.5),100mmkcl,1mmtcep，10%甘油）洗脱蛋白，分装，-80°c储存，备用。实施例3：制备sgrna库1、sgrna设计及合成ncbi下载大鼠基因gapdh序列（geneid:24383），利用麻省理工大学张锋教授实验室提供的在线网站（http://crispr.mit.edu/）分析可能的sgrna位点（pam序列为ngg），设计35条sgrna核心序列，其在gapdh基因上的靶向位点序列为seqidno.1-seqidno.35（表1）；选取16条sgrna核心序列，其在gapdh基因上的靶向位点序列为seqidno.1-seqidno.16。分别在16条sgrna核心序列的5’端插入t7promoter序列：如seqidno.36所示，3’端插入骨架序列：如seqidno.37所示，得到16条优化sgrna序列，即sgrna库。优化后的sgrna能显著降低荧光背景，提高探针的灵敏度。以上优化后的sgrna序列均由上海生工人工合成，合成序列连入puc57-simple质粒中。表1seqidno.sequence1aaggacgctgtacgggttta2ggatccgacccgtaatcccc3ccggcatgcgcaacggagcg4ccccggaggtgcggtagcaa5gcgggtgcgcgccagtgtcg6gggctgcagtccgtatttat7agaatataagttatgcccga8caaggtcagcgctcggacct9ttctttactttcgcgcccag10cccccgtgccaccgaccctg11atcctctgcaatgcggagcc12gccgccgccatgttgcaaac13gccggagacgaatggaaatt14gggctgtgctgtagcgtgcg15gacgtgatggggcatgcggc16ctgccacaaaatggctccgg17gcccaggctccgcattgcag18ccagcctggggattacgggt19cgacccgtaatccccaggct20ataaggctggaggcctataa21cgtctctcgtcagcctttat22agttatgcccgagggaaata23gccattgctaccgcacctcc24tgacccaaaccctataggcc25tcctaatttccattcgtctc26gaggtccggaagccgagccc27cttgtaactccgcctttgct28cctcagggtcggtggcacgg29agcccttagaagatgcgcaa30agggcttcacttatggtaac31aacggagcggggccccgccc32ccttgtaactccgcctttgc33ggcccggagtctaaagtagc34tggggggaaggacgctgtac35ggacgtgatggggcatgcgg2、pcr扩增将带有目标序列的质粒pcr扩增后获得模板，操作如下：pcr扩增引物如下：上游引物：taatacgactcactatagg（seq.no38）下游引物：gcaccgactcggtgcc（seq.no39）pcr扩增反应体系如下：质粒模板1ul上游引物1ul下游引物1ul2xpcrmix25h2oto50ulpcr扩增反应条件如下：95℃5min；95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，共进行35个循环。3、pcr产物体外转录及纯化采用体外转录试剂盒t7transcriptionkit（thermofisher，am1322）进行体外转录，并纯化得到sgrna；体外转录体系为：5×transcriptaidreactionbuffer4ul，atp/ctp/gtp/utpmix*8ul，templatedna1ug**，transcriptaidenzymemix2ul，depc-treatedwaterto20ul；共20ul。实施例4：构建sgrna-dcas9酶探针库将实施例2中所得的荧光染料标记的dcas9蛋白分别与实施例3中所得的sgrna库混合组装，dcas9蛋白与sgrna库按照摩尔比例为1：1-1:4进行混合组装，得到sgrna-dcas9酶探针库。实施例5：荧光原位杂交反应大鼠血旺细胞爬片固定：甲醇：乙酸=1：1，固定20min后-20℃保存，按照以下步骤进行检测：（1）洗涤：pbst摇晃洗涤样品5min；（2）bloking/reactingbuffer37℃孵育样品15min；（3）将探针加入样品中，37℃孵育15min，其中对照组仅加入dcas9蛋白，sgrna用bloking/reactingbuffer代替；（4）pbst洗涤样品，3次，每次5min；（5）dapi复染样品，室温，5min，洗涤，封片；（6）在荧光显微镜下观察采集图像（图1）。序列表<110>重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司<120>一种快速检测alk基因重排探针、fish试剂盒及方法<160>39<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>1aaggacgctgtacgggttta20<210>2<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>2ggatccgacccgtaatcccc20<210>3<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>3ccggcatgcgcaacggagcg20<210>4<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>4ccccggaggtgcggtagcaa20<210>5<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>5gcgggtgcgcgccagtgtcg20<210>6<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>6gggctgcagtccgtatttat20<210>7<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>7agaatataagttatgcccga20<210>8<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>8caaggtcagcgctcggacct20<210>9<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>9ttctttactttcgcgcccag20<210>10<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>10cccccgtgccaccgaccctg20<210>11<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>11atcctctgcaatgcggagcc20<210>12<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>12gccgccgccatgttgcaaac20<210>13<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>13gccggagacgaatggaaatt20<210>14<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>14gggctgtgctgtagcgtgcg20<210>15<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>15gacgtgatggggcatgcggc20<210>16<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>16ctgccacaaaatggctccgg20<210>17<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>17gcccaggctccgcattgcag20<210>18<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>18ccagcctggggattacgggt20<210>19<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>19cgacccgtaatccccaggct20<210>20<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>20ataaggctggaggcctataa20<210>21<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>21cgtctctcgtcagcctttat20<210>22<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>22agttatgcccgagggaaata20<210>23<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>23gccattgctaccgcacctcc20<210>24<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>24tgacccaaaccctataggcc20<210>25<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>25tcctaatttccattcgtctc20<210>26<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>26gaggtccggaagccgagccc20<210>27<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>27cttgtaactccgcctttgct20<210>28<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>28cctcagggtcggtggcacgg20<210>29<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>29agcccttagaagatgcgcaa20<210>30<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>30agggcttcacttatggtaac20<210>31<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>31aacggagcggggccccgccc20<210>32<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>32ccttgtaactccgcctttgc20<210>33<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>33ggcccggagtctaaagtagc20<210>34<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>34tggggggaaggacgctgtac20<210>35<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>35ggacgtgatggggcatgcgg20<210>36<211>19<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>36taatacgactcactatagg19<210>37<211>86<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>37gtttaagagctatgctggaaacagcatagcaagtttaaataaggctagtccgttatcaac60ttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc86<210>38<211>19<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>38taatacgactcactatagg19<210>39<211>16<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>39gcaccgactcggtgcc16当前第1页12