一种用于FISH的快速标记基因组探针及其制备方法和应用与流程

文档序号:19376084发布日期:2019-12-10 23:53阅读:529来源:国知局
一种用于FISH的快速标记基因组探针及其制备方法和应用与流程
本发明属于分子生物学领域,涉及医学和生物技术,具体的是涉及一种用于fish的快速标记基因组探针及其制备方法和应用。
背景技术
:由染色体畸变引起的疾病难以治愈,危害严重;目前,针对染色体异常检测的重要方法之一为荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization,fish),该技术是将dna(或rna)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或dna纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测dna序列在染色体或dna纤维切片上的定性、定位、相对定量分析;具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核,为疾病诊断提供可靠的依据,早发现早治疗,使患者减少痛苦。然而目前荧光原位杂交方法耗时长,杂交条件苛刻;且探针有制备繁琐,批次差异比较大,特异性不高,信号背景偏高等缺点,基于此,有必要提供一种特异性高、杂交效率高且检测时间短的荧光原位杂探针及其制备方法。crispr-cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源dna。而crispr-cas9基因编辑技术,则是对靶向基因进行特定dna修饰的技术,这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法。crispr-cas9是基因组调控技术中灵活性最强的系统之一。cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域:ruvc和hnh。这两个结构域分别负责切割dna链的两条链,并且这两个结构域能够单独地被人工点突变失活。当ruvc和hnh同时处于失活状态时(d10a&h840a;ruvc-&hnh-),cas9将不具有核酸酶活性,成为dcas9(deadcas9)。dcas9虽然没有剪切dna的能力,但仍然可以在grna的引导下与特定的dna序列结合。基于以上原理,应用cas9体系有开发出标记基因组dna的潜力。技术实现要素:本发明的目的是研发一种用于fish的快速标记基因组探针及其制备方法和应用,采用最新技术dcas9蛋白,在sgrna的引导下标记靶基因,应用该方法标记基因具高效,快速,准确的特点,且样本可以包含非变性和变性两种。本发明是通过以下技术方案实现的:本发明目的在于提供一种用于fish的快速标记基因组探针的制备方法,包括如下步骤:(1)制备dcas9蛋白:原核表达及纯化得到dcas9蛋白,将荧光染料标记dcas9蛋白;(2)制备sgrna库:从ncbi下载目标基因序列,针对目标基因区域保守序列,利用在线网站http://crispr.mit.edu/分析可能的sgrna位点,其中pam序列为ngg,在每条sgrna核心序列的5’端加上19bp的序列如seqidno.36所示,3’端加上86bp的序列如seqidno.37所示,得到一系列优化sgrna序列,化学合成所述优化sgrna序列,将合成的sgrna序列连入puc57-simple质粒,通过质粒pcr扩增、pcr产物体外转录、转录产物纯化,得到一系列sgrna,即sgrna库,pcr扩增引物如seqidno.38、seqidno.39所示;(3)构建探针库:将步骤(1)中所得的荧光染料标记的dcas9蛋白分别与步骤(2)中所得的sgrna库混合组装,所述dcas9蛋白与所述sgrna库按照摩尔比例为1:1-1:4进行混合组装,即得到sgrna-dcas9酶探针库。上述方案中,步骤(2)的pcr扩增体系如下:质粒模板1ul上游引物1ul下游引物1ul2xpcrmix25h2oto50ul上述方案中,步骤(2)的pcr反应条件为:95℃5min;95℃30sec,56℃30sec,72℃30sec,共进行35个循环。本发明的另一目的在于提供一种用于fish的快速标记基因组探针,该探针根据上述一种用于fish的快速标记基因组探针的制备方法制备得到。本发明的另一目的在于提供一种快速荧光原位杂交检测试剂盒,该试剂盒含有上述用于fish的快速标记基因组探针。上述试剂盒在制备用于快速荧光原位杂交检测产品中的应用。本发明的有益效果如下:具有快速、经济、操作方便等优点:(1)传统fish操作需要加热和甲酰胺处理,使得双链dna变性进行杂交,需要数小时或更长时间。dcas9介导的fish技术利用crispr系统进行dna快速杂交,该方法在优化的条件下仅需要约1小时;同时sgrna-dcas9酶探针比核酸探针有准确性高,特异性好、假阳性低等优点;(2)cas9介导的fish技术操作条件温和(室温和37°c),因此可以更好地维持细胞形态和dna结构;(3)传统fish每条探针均需要荧光标记,操作繁琐,成本高;而dcas9介导的fish技术操作简便,成本低:只需荧光标记dcas9蛋白,标记的dcas9蛋白库可与针对不同目的基因设计的多条sgrna灵活组装为探针库。附图说明:图1gapdh基因检测结果。具体实施方式:下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但下列实施例仅用于说明本发明,而不视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1:dcas9蛋白的表达和纯化将质粒pet302-6his-dcas9-halo(addgene,72269)转化入e.colibl21(de3),进行原核表达并纯化蛋白。其中histag利于蛋白纯化;halotag用于蛋白的荧光标记。具体操作如下:(1)质粒转化bl21(de3)感受态细胞,涂板后37℃倒置培养过夜;(2)选取单克隆于5mllb培养液中37℃培养过夜;(3)次日1:50接种到新lb培养基扩大培养至1l,至菌体od600为0.6-0.8,加入iptg至终浓度为1mm,16°c培养16h后离心,收集菌体;(4)takaranihis标签纯化柱洗脱并收集蛋白;(5)将洗脱蛋白透析至buffer(50mmhepes(ph7.5),100mmkcl,1mmtcep)中,并用50,000-mwco超滤管(millipore)超滤后收集纯化蛋白;(6)将已纯化蛋白加入甘油(含量20%),-80°c储存,备用。实施例2:dcas9蛋白荧光标记将染料(halotag®alexafluor®488,promega)按照protocol将实施例1中制备的dcas9蛋白进行标记。具体操作如下:(1)染料:蛋白样品按照如下体系混匀后室温孵育30min,随后4°c孵育过夜,体系为lysate20ul,ligand(50um)1ul,1×50mmhepes(ph7.5)9ul,共30ul;(2)50,000-mwco超滤管(millipore)超滤除去未结合的染料;(3)用buffer(50mmhepes(ph7.5),100mmkcl,1mmtcep,10%甘油)洗脱蛋白,分装,-80°c储存,备用。实施例3:制备sgrna库1、sgrna设计及合成ncbi下载大鼠基因gapdh序列(geneid:24383),利用麻省理工大学张锋教授实验室提供的在线网站(http://crispr.mit.edu/)分析可能的sgrna位点(pam序列为ngg),设计35条sgrna核心序列,其在gapdh基因上的靶向位点序列为seqidno.1-seqidno.35(表1);选取16条sgrna核心序列,其在gapdh基因上的靶向位点序列为seqidno.1-seqidno.16。分别在16条sgrna核心序列的5’端插入t7promoter序列:如seqidno.36所示,3’端插入骨架序列:如seqidno.37所示,得到16条优化sgrna序列,即sgrna库。优化后的sgrna能显著降低荧光背景,提高探针的灵敏度。以上优化后的sgrna序列均由上海生工人工合成,合成序列连入puc57-simple质粒中。表1seqidno.sequence1aaggacgctgtacgggttta2ggatccgacccgtaatcccc3ccggcatgcgcaacggagcg4ccccggaggtgcggtagcaa5gcgggtgcgcgccagtgtcg6gggctgcagtccgtatttat7agaatataagttatgcccga8caaggtcagcgctcggacct9ttctttactttcgcgcccag10cccccgtgccaccgaccctg11atcctctgcaatgcggagcc12gccgccgccatgttgcaaac13gccggagacgaatggaaatt14gggctgtgctgtagcgtgcg15gacgtgatggggcatgcggc16ctgccacaaaatggctccgg17gcccaggctccgcattgcag18ccagcctggggattacgggt19cgacccgtaatccccaggct20ataaggctggaggcctataa21cgtctctcgtcagcctttat22agttatgcccgagggaaata23gccattgctaccgcacctcc24tgacccaaaccctataggcc25tcctaatttccattcgtctc26gaggtccggaagccgagccc27cttgtaactccgcctttgct28cctcagggtcggtggcacgg29agcccttagaagatgcgcaa30agggcttcacttatggtaac31aacggagcggggccccgccc32ccttgtaactccgcctttgc33ggcccggagtctaaagtagc34tggggggaaggacgctgtac35ggacgtgatggggcatgcgg2、pcr扩增将带有目标序列的质粒pcr扩增后获得模板,操作如下:pcr扩增引物如下:上游引物:taatacgactcactatagg(seq.no38)下游引物:gcaccgactcggtgcc(seq.no39)pcr扩增反应体系如下:质粒模板1ul上游引物1ul下游引物1ul2xpcrmix25h2oto50ulpcr扩增反应条件如下:95℃5min;95℃30sec,56℃30sec,72℃30sec,共进行35个循环。3、pcr产物体外转录及纯化采用体外转录试剂盒t7transcriptionkit(thermofisher,am1322)进行体外转录,并纯化得到sgrna;体外转录体系为:5×transcriptaidreactionbuffer4ul,atp/ctp/gtp/utpmix*8ul,templatedna1ug**,transcriptaidenzymemix2ul,depc-treatedwaterto20ul;共20ul。实施例4:构建sgrna-dcas9酶探针库将实施例2中所得的荧光染料标记的dcas9蛋白分别与实施例3中所得的sgrna库混合组装,dcas9蛋白与sgrna库按照摩尔比例为1:1-1:4进行混合组装,得到sgrna-dcas9酶探针库。实施例5:荧光原位杂交反应大鼠血旺细胞爬片固定:甲醇:乙酸=1:1,固定20min后-20℃保存,按照以下步骤进行检测:(1)洗涤:pbst摇晃洗涤样品5min;(2)bloking/reactingbuffer37℃孵育样品15min;(3)将探针加入样品中,37℃孵育15min,其中对照组仅加入dcas9蛋白,sgrna用bloking/reactingbuffer代替;(4)pbst洗涤样品,3次,每次5min;(5)dapi复染样品,室温,5min,洗涤,封片;(6)在荧光显微镜下观察采集图像(图1)。序列表<110>重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司<120>一种快速检测alk基因重排探针、fish试剂盒及方法<160>39<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>1aaggacgctgtacgggttta20<210>2<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>2ggatccgacccgtaatcccc20<210>3<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>3ccggcatgcgcaacggagcg20<210>4<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>4ccccggaggtgcggtagcaa20<210>5<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>5gcgggtgcgcgccagtgtcg20<210>6<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>6gggctgcagtccgtatttat20<210>7<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>7agaatataagttatgcccga20<210>8<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>8caaggtcagcgctcggacct20<210>9<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>9ttctttactttcgcgcccag20<210>10<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>10cccccgtgccaccgaccctg20<210>11<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>11atcctctgcaatgcggagcc20<210>12<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>12gccgccgccatgttgcaaac20<210>13<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>13gccggagacgaatggaaatt20<210>14<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>14gggctgtgctgtagcgtgcg20<210>15<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>15gacgtgatggggcatgcggc20<210>16<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>16ctgccacaaaatggctccgg20<210>17<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>17gcccaggctccgcattgcag20<210>18<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>18ccagcctggggattacgggt20<210>19<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>19cgacccgtaatccccaggct20<210>20<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>20ataaggctggaggcctataa20<210>21<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>21cgtctctcgtcagcctttat20<210>22<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>22agttatgcccgagggaaata20<210>23<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>23gccattgctaccgcacctcc20<210>24<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>24tgacccaaaccctataggcc20<210>25<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>25tcctaatttccattcgtctc20<210>26<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>26gaggtccggaagccgagccc20<210>27<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>27cttgtaactccgcctttgct20<210>28<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>28cctcagggtcggtggcacgg20<210>29<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>29agcccttagaagatgcgcaa20<210>30<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>30agggcttcacttatggtaac20<210>31<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>31aacggagcggggccccgccc20<210>32<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>32ccttgtaactccgcctttgc20<210>33<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>33ggcccggagtctaaagtagc20<210>34<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>34tggggggaaggacgctgtac20<210>35<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>35ggacgtgatggggcatgcgg20<210>36<211>19<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>36taatacgactcactatagg19<210>37<211>86<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>37gtttaagagctatgctggaaacagcatagcaagtttaaataaggctagtccgttatcaac60ttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc86<210>38<211>19<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>38taatacgactcactatagg19<210>39<211>16<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>39gcaccgactcggtgcc16当前第1页12
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